CN108165656B - 小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用。本发明公开的小麦分子标记为下述M1)或M2)：M1)小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸；M2)含有M1)的DNA片段；本发明还制备了用于检测该小麦分子标记的P引物组、K‑IWB41105引物组和Str‑IWB41105引物组。本发明所提供的小麦分子标记及引物组可用于小麦白粉病成株抗性分子育种和白粉病成株抗性性状的鉴定。本发明的专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用。
背景技术
小麦是世界上种植面积最大、产量最多、分布最广、贸易额最高的粮食作物和人类最重要的谷物来源。目前全球年种植面积超过2.4亿hm2，产量超过6亿吨，贸易量1.735亿吨。我国是小麦产量最多的国家，小麦也是我国最重要的商品粮和贮藏粮，保障小麦高产稳产既是人民生活基本需求的必然，也是维护国家粮食安全的战略选择。
影响小麦高产稳产因素很多，其中病害是影响小麦生产安全的重要生物胁迫因素。小麦白粉病是全球性真菌病害，由小麦布氏白粉菌(Blumeria graminisf.sp.tritici)引起，具有发生频率高、流行范围广和暴发性强的特点，生理小种复杂多变，导致品种抗性频繁丧失，因此防治和控制病害是一项长期任务。通过化学方法可以有效防治病害，但是使用化学药剂会造成环境污染、增加成本，选育抗病品种是最经济、安全、有效的策略。
优异的抗性资源是抗病育种的基础。小麦的抗性分为垂直抗性和水平抗性。垂直抗性又称为小种专化抗性、苗期抗性、全生育期抗性、主效基因抗性，它由单个或少数几个主效基因控制；由于这种抗性具有小种专性，随着生理小种的变化，抗性容易丧失，因此该类抗性不持久、不稳定。在小麦抗病育种历史上，应用主效抗病基因明显地提高了品种的抗病性，并在防治病害的生产实践中取得了显著成效。但是，由于病原小种易变，使得利用单一主效基因后，随着育成品种大面积推广而频繁丧失抗性。水平抗性，又称非小种专化抗性、成株抗性、慢病性；这类抗性由若干个微效基因所控制，对病原菌生理小种无专化性或专化性较弱，减小了品种对病原菌生理小种的选择压力，从而表现抗病性持久、稳定。研究表明聚合4-5个效应相对较大的微效基因即可培育出接近免疫的成株抗性品种，国际上多数国家已将成株抗性的利用作为小麦抗病育种的主要方向。因此，由多基因控制的成株抗性能有效地延缓病原小种的变异速度，合理利用成株抗性基因是实现品种持久抗性的重要策略。
明确小麦抗病基因的类型、位置和遗传机制是聚合成株抗性的基础，QTL定位可提供位点数目、染色体上的位置及效应大小等重要信息，与其紧密连锁的分子标记可用于小麦抗病基因聚合。通过分子辅助选择可有目的地进行基因累加，从而实现抗源积累，提高抗病品种的使用年限。更为重要的是，应用分子标记能够在基因型水平上对作物种质资源进行深入评价和鉴定，同时把抗病性与小麦其它重要农艺性状结合起来，大大提高抗病育种的效率。
周8425B是河南省周口市农业科学院选育的矮秆、大穗、抗病的小麦骨干亲本，利用周8425B已育成100多个小麦品种；周8425B对白粉病、条锈病和叶锈病流行小种均表现抗病，含有抗条锈病基因YrZH84和抗叶锈病基因LrZH84；发掘抗白粉病基因、并开发其紧密连锁的分子标记，对分子辅助多个抗病基因的聚合育种有重要意义。
分子标记辅助抗病育种实践中，常采用表型分析和基因标记鉴定相结合的方法。目前常用于基因型鉴定的分子标记有STS、SSR、SNP等，相比之下SNP标记可以利用芯片进行高通量自动化操作。Illumina公司开发的Wheat 90K iSelect assay SNP芯片得到了很快的应用。LGC Genomics公司研发的基于KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术的SNP分型检测方案，可以利用通用的荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本。Long等(2017)开发的STARP(Semi-Thermal Asymmetric Reverse PCR)是一个创新的SNP基因分型方法，具有准确性高、通量灵活、操作价格低、平台兼容性好的特点。因此，利用KASP和STARP技术，可以达到高效、准确、经济的目的。
发明内容
本发明的目的是如何鉴定小麦白粉病抗性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了小麦分子标记在鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性或筛选或辅助筛选抗白粉病小麦中的应用；
所述小麦分子标记为下述M1)或M2)：
M1)小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸；
M2)含有M1)的DNA片段。
M1)所述小麦分子标记具体可为A或G。
M2)具体可为序列4或序列5所示的DNA片段。
本发明还提供了小麦基因型的检测方法，所述基因型为AA基因型、GG基因型和AG基因型，所述方法包括：检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸，如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g1)的染色体，所述待测小麦为AA基因型小麦；如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g2)的染色体，所述待测小麦为GG基因型小麦；如所述待测小麦基因组中两条染色体中一条为下述g1)的染色体，另一条为下述g2)的染色体，所述待测小麦为AG基因型小麦；
g1)对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸为A；
g2)对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸为G。
上述方法中，所述检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸可包括如下Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ：
Ⅰ、利用P引物组对待测小麦基因组DNA进行扩增，得到PCR产物；如所述PCR产物的序列为序列4，所述待测小麦为AA基因型小麦；如所述PCR产物的序列为序列5，所述待测小麦为GG基因型小麦；如所述PCR产物的序列为序列4和5，所述待测小麦为AG基因型小麦；所述P引物组由序列表中序列1、2和3所示的三条单链DNA组成；
Ⅱ、利用K-IWB41105引物组采用KASP的方法对待测小麦进行分型，确定所述待测小麦为AA基因型、GG基因型或AG基因型小麦；所述K-IWB41105引物组由序列表中序列6、7和3所示的三条单链DNA组成，序列6和7所示的单链DNA分别标记有不同的荧光基团；
Ⅲ、利用Str-IWB41105引物组采用STARP的方法对待测小麦进行分型，确定所述待测小麦为AA基因型、GG基因型或AG基因型小麦；所述Str-IWB41105引物组由序列表中序列8、9和3所示的三条单链DNA组成，序列8和9所示的单链DNA分别标记有不同的荧光基团。
在本发明的一个实施例中，序列6和序列8所示的单链DNA的5′端均标记有FAM，序列7和序列9所示的单链DNA的5′端均标记有HEX。
所述P引物组中，每条单链DNA可单独包装，各单链DNA的摩尔数可相等。
所述K-IWB41105引物组中，每条单链DNA可单独包装，各单链DNA的摩尔数可相等。
所述Str-IWB41105引物组中，每条单链DNA可单独包装，各单链DNA的摩尔数可相等。
采用所述K-IWB41105引物组时的PCR扩增的5μl反应体系可为：KASP mix 2.5μl，MgCl2 0.04μl，FAM引物134nM，HEX引物134nM，共同反向引物336nM，基因组DNA 100ng，用ddH2O补充至5μl。KASP mix(KBS-1016-002，KASP V4.0 2X Master mix 96/384,Std Rox)和MgCl2均可为LGC公司产品。
采用所述K-IWB41105引物组时的PCR扩增的程序可为：94℃15min；94℃20s、61-55℃1min(每个循环降0.6℃)、10个循环；94℃20s、55℃60s、26个循环。
具体可通过酶标仪使用FAM HEX ROM光束扫描和Kluster Caller分型软件对采用所述K-IWB41105引物组时的PCR扩增产物进行分型检测。
采用所述Str-IWB41105引物组时的PCR扩增的5μl反应体系可为：1×NH4 +Buffer(BBI B600066-006)，betaine(RTE 3103-02)0.8M，BSA(Abcam ab18843)0.04％，MgCl2(Merck Millipore 20-303)1.5mM，dNTP(Takara R500Z)50μM，PEA-1引物100nM，PEA-1引物100nM，AMAS-1引物20nM，AMAS-2引物20nM，共同反向引物100nM，rTaq DNA(Takara R500Z)1U，基因组DNA 100ng，用ddH2O补充至5μl。其中，PEA-1引物为：5'-FAM-AGCTGGTT-Sp9-GCAACAGGAACCAGCT(Dabcyl-dT)ATGAC-3'，PEA-2引物为5'-HEX-ACTGCTCAAGAG-Sp9-GACGCAAGTGAGCAGT(Dabcyl-dT)ATGAC-3'。
采用所述Str-IWB41105引物组时的PCR扩增的程序可为：94℃3min；94℃20s、56-50℃2min(每个循环降1℃)、6个循环；94℃20s、60℃1min、35个循环；62℃2min。
具体可通过酶标仪使用FAM HEX ROM光束扫描和Kluster Caller分型软件对采用所述Str-IWB41105引物组时的PCR扩增产物进行分型检测。
本发明还提供了下述X1)或X2)的方法：
X1)一种鉴定或辅助鉴定小麦的抗白粉病性状的方法，包括：按照所述小麦基因型的检测方法鉴定待测小麦的基因型，AA基因型待测小麦具有或候选具有抗白粉病性状，AG基因型待测小麦具有或候选具有抗白粉病性状，GG基因型待测小麦不具有或候选不具有抗白粉病性状，
X2)鉴定或辅助鉴定两种待测小麦的抗白粉病性状的方法，包括：按照所述小麦基因型的检测方法鉴定所述两种待测小麦的基因型，AA基因型待测小麦和AG基因型待测小麦白粉病抗性高于或候选高于GG基因型待测小麦。
本发明还提供了一种筛选或辅助筛选抗白粉病小麦的方法，所述方法包括：按照所述小麦基因型的检测方法鉴定小麦的基因型，筛选得到AA基因型或AG基因型小麦即为抗白粉病小麦。
本发明还提供了所述小麦分子标记。
本发明还提供了所述P引物组、所述K-IWB41105引物组或Str-IWB41105引物组。
本发明还提供了下述任一应用：
H1)所述小麦分子标记在小麦育种中的应用；
H2)检测所述小麦分子标记的物质在小麦育种中的应用；
H3)检测所述小麦分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性中的应用；
H4)检测所述小麦分子标记的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性产品中的应用；
H5)检测所述小麦分子标记的物质在筛选或辅助筛选抗白粉病小麦中的应用；
H6)检测所述小麦分子标记的物质在制备筛选或辅助筛选抗白粉病小麦产品中的应用。
本发明还提供了小麦育种方法，包括按照所述小麦基因型的检测方法检测小麦的基因型，选择AA或AG基因型的小麦作为亲本进行育种。
本发明中，所述抗白粉病小麦可为小麦品种“周8425B”、小麦品种“中国春”、小麦品种“周8425B”的衍生品种或小麦品种“周8425B”与其它小麦品种的杂交后代。以上任一所述抗白粉病的小麦可为小麦品种“周8425B”和小麦品种“中国春”的杂交后代。以上任一所述的白粉病具体可为白粉病菌流行小种E09和E20引起的白粉病。
所述抗白粉病可为小麦成株对白粉病的抗性。所述抗白粉病性状可为小麦成株的白粉病抗性性状。
本发明所提供的小麦分子标记可用于小麦白粉病成株抗性分子育种和白粉病成株抗性性状的鉴定。本发明的专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
附图说明
图1、K-IWB41105引物组对抗病亲本周8425B、感病亲本中国春、周8425B/中国春杂交F1对照和F8代RIL群体的DNA扩增的基因型分型结果。1、AG型为周8425B/中国春杂交F1代DNA扩增分型结果；2、AA型为周8425B及F8代RIL群体中与周8425B相同基因型株系的DNA扩增分型结果；3、GG型为中国春及F8代RIL群体中与中国春相同基因型株系的DNA扩增分型结果；4、纯水对照为不加任何DNA扩增结果。
图2、Str-IWB41105引物组对抗病亲本周8425B、感病亲本中国春、周8425B/中国春杂交F1对照和F8代RIL群体的DNA扩增的基因型分型结果。1、AG型为周8425B/中国春杂交F1代DNA扩增分型结果；2、AA型为周8425B及F8代RIL群体中与周8425B相同基因型株系的DNA扩增分型结果；3、GG型为中国春及F8代RIL群体中与中国春相同基因型株系的DNA扩增分型结果；4、纯水对照为不加任何DNA扩增结果。
图3、K-IWB41105引物组对抗病亲本周8425B、感病亲本中国春、周8425B/中国春杂交F1对照和103份周8425B衍生品种的基因型分型结果。1、AG型为周8425B/中国春杂交F1代DNA扩增结果；2、AA型为周8425B及周8425B衍生品种中与周8425B相同基因型的品种DNA扩增结果；3、GG型为中国春及周8425B衍生品种中与中国春相同基因型的品种DNA扩增结果；4、纯水对照为不加任何DNA扩增结果。
图4、Str-IWB41105引物组对抗病亲本周8425B、感病亲本中国春、周8425B/中国春杂交F1对照和103份周8425B衍生品种的基因型分型结果。1、AG型为周8425B/中国春杂交F1代DNA扩增结果；2、AA型为周8425B及周8425B衍生品种中与周8425B相同基因型的品种DNA扩增结果；3、GG型为中国春及周8425B衍生品种中与中国春相同基因型的品种DNA扩增结果；4、纯水对照为不加任何DNA扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
周8425B(Triticum aestivum)(Z8425B)：中国小麦品种白粉鉴定及抗白粉新基因YrZH84分子标记，李在峰，北京：中国农科院研究生院，2006年6月。周8425B是河南省周口市农业科学院选育的矮秆、大穗、抗病骨干亲本，在黄淮地区小麦育种中发挥着重要作用，已育成100多个衍生品种(系)，其中通过国家和省级审定的品种达80多个(矮抗58、郑麦7698、中麦895、西农822、洛麦21、淮麦28、徐麦9074、农大1108、百农207、淮麦33、存麦8号等)目前正是黄淮麦区的主推品种。
中国春(Triticum aestivum)(CS)：珍贵小麦资源——中国春的鉴定，钱曼懋，金天秀，宋春华，作物品种资源，1984年04期。中国春是我国珍贵的小麦种质资源，在国内外享有盛誉，五十年代初，鲍文奎和严育瑞曾用中国春及其他小麦品种与黑麦杂交，选育出不少抗病、耐寒、耐旱、抗逆性强的小黑麦品种。
小麦品种“京双16”，可从国家作物种质资源库获得，统一编号为ZM013361
最大严重度(Maximum Disease Severity，MDS)：发病面积占叶片总面积的百分数。
田间小麦成株抗性鉴定步骤及方法如下：
田间种植：采用完全随机区组设计，三次重复，单行区，行长1.5m，行宽0.2-0.3m，每行播种50粒种子，每个9行加1行对照，对照选用高感白粉病小麦品种京双16；为了确保发病充分，将京双16种植于试验区作为诱发行。
田间接种：在可控温室中将高感白粉病小麦品种京双16种植在小塑料钵中，于2叶期用白粉菌强毒性混合生理小种E09和E20进行人工接种，待发病充分时(约接种后13-15天，白粉病病斑大于1mm，并且大多数病斑连成一片)在3月底将其移栽入田间试验的接种诱发行，每0.5m移栽一盆，将移栽第1周记为接种第1周。
其中，E09和E20由中国农业科学院植物保护研究所提供，记载于文献“LanCaixia,Ni Xiaowen,Yan Jun,Zhang Yong,Xia Xianchun,He Zhonghu(2010)
Quantitative trait loci mapping of adult-plant resistance to powderymildew in Chinese wheat cultivar Lumai 21.Mol Breeding 25:615–622.”和“WangZhenzhong,Cui Yu,Chen Yongxing,Zhang Deyun,Liang Yong,Zhang Dong,Wu Qiuhong,Xie Jingzhong,Ouyang Shuhong,Li Delin,Huang Yinlian,Lu Ping,Wang Guoxin,YuMeihua,Zhou Shenghui,Sun Qixin,Liu Zhiyong(2014)Comparative genetic mappingand genomic region collinearity analysis of the powdery mildew resistancegene Pm41.Theor Appl Genet 127:1741–1751.”中，公众可从申请人处或中国农业科学院植物保护研究所获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
田间调查：接种大约6周后，京双16达到发病高峰，对待测小麦严重度进行第一次调查，即叶片上白粉病孢子堆面积占总叶片面积的百分数；一周后，调查群体发病最大严重度。
实施例1、抗白粉病基因的分子标记IWB41105及其专用引物组K-IWB41105和Str-IWB41105的获得。
田间表型鉴定及数据分析：周8425B与中国春杂交得到F1代，连续自交得到F8代RILs群体，将F8代RILs群体244个家系于2015和2016年均种植于郑州和北京，进行白粉病成株抗性田间鉴定。选用国际通用SAS统计软件PROC CORR模型计算MDS的Pearson相关系数、PROC ANOVA命令进行方差分析，相关性分析和方差分析结果表明：四个环境的相关系数在0.53-073之间，相关性较好，白粉病抗病性在不同基因间存在极显著差异，明确表现型数据的有效性。
遗传图谱构建：本文用高凤梅等(2016)已构建的遗传连锁图谱。其方法是采用90K芯片对周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系进行全基因组扫描，并用IciMapping和JionMap等软件作遗传连锁图谱。
QTL定位：244个家系在4个环境下的白粉病最大严重度及其平均值为表型数据，结合90K芯片对244个家系DNA进行全基因组扫描提供的基因型数据，采用QTL作图软件IciMapping 4.1中的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping，ICIM)估算QTL。设置参数如下：“permutation”为1000次，软件自动赋值LOD(Logarithm of Odds)，步长设为0.5cM，“control marker”和“Window size”使用默认值，回归方式采用“Forwardand backward method”；寻找QTL时，把LOD值峰值设为3.0，QTL的置信区间划分时采用LOD≥2.5。每个QTL的区间距不超过20cM，用逐步回归估算表型变异。LOD值大于2.5的QTL被认为是具有显著效应。
该群体共定位到四个较稳定的QTL，根据定位到的QTL进一步发现一SNP分子标记IWB41105与白粉病相关，SNP分子标记IWB41105为对应于小麦基因组DNA中序列表中序列4的第18位为A或G，利用该SNP分子标记设计KASP和STARP引物组，用于小麦分子标记辅助选择育种。
首先设计序列表中序列1、序列2和序列3所示的单链DNA，序列1和序列3所示的单链DNA形成的引物对能从周8425B的基因组DNA中扩增得到序列表中序列4所示的DNA分子，将周8425B的基因型记为AA基因型小麦；序列2和序列3所示的单链DNA形成的引物对能从中国春的基因组DNA中扩增得到序列表中序列5所示的DNA分子，将中国春的基因型记为GG基因型小麦；序列1、序列2和序列3所示的单链DNA形成的引物组能从周8425B与中国春杂交得到的F1代的基因组DNA中扩增得到序列表中序列4和5所示的DNA分子，将周8425B与中国春杂交得到的F1代记为AG基因型小麦。
在序列1的5'端加上GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，作为KASP引物组(记为K-IWB41105引物组)中的FAM引物，序列2的5'端加上GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，作为KASP引物组中的HEX引物。KASP引物组由三条引物组成，各引物信息如下：
FAM引物(序列表的序列6，上游引物)：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGTGCTCTTCCGTCCA-3'；FAM引物的5'末端标记有FAM荧光基团，在激发光485nm,发射光520nm波长下观察读值；
HEX引物(序列表的序列7，上游引物)：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTGTGCTCTTCCGTCCG-3'；HEX引物的5'末端标记有HEX荧光基团，在激发光528nm,发射光560nm波长下观察读值；
共同反向引物(序列表的序列3，下游引物)：5'-CCAACCAACTTCACTGATATGAAAA-3'。
在序列1的5'端加上GCAACAGGAACCAGCTATGAC，作为STARP引物组(记为Str-IWB41105引物组)中的AMAS-1，在序列2的5'端加上GACGCAAGTGAGCAGTATGAC，作为STARP引物组中的AMAS-2。STARP引物组由三条引物组成，各引物信息如下：
AMAS-1引物(序列表的序列8，上游引物)：5'-GCAACAGGAACCAGCTATGACACTGTGCTCTTCCGTCCA-3'；AMAS-1引物与PEA-1引物结合，PEA-1引物的5'末端标记有FAM荧光基团，在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值；
AMAS-2引物(序列表的序列9，上游引物)：5'-GACGCAAGTGAGCAGTATGACACTGTGCTCTTCCGTCCG-3'；AMAS-2引物与PEA-2引物结合，PEA-2引物的5'末端标记有HEX荧光基团，在激发光528nm,发射光560nm波长下观察读值；
共同反向引物(序列表的序列3，下游引物)：5'-CCAACCAACTTCACTGATATGAAAA-3'。
实施例2、基因型检测方法的建立
一、用实施例1的K-IWB41105引物组检测周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系的基因型，并利用周8425B、中国春、周8425B与中国春杂交得到的F1代作为对照。
1、提取周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系的基因组DNA，得到DNA浓度为100ng/μl的模板溶液。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用引物组K-IWB41105进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，利用纯水替换模板作为对照。
K-IWB41105引物组的PCR扩增的5μl体系：KASP mix 2.5μl，MgCl2 0.04μl，FAM引物134nM，HEX引物134nM，共同反向引物336nM，基因组DNA 100ng，用ddH2O补充至5μl。KASPmix(KBS-1016-002，KASP V4.0 2X Master mix 96/384,Std Rox)和MgCl2均为LGC公司产品。
K-IWB41105引物组的PCR扩增的程序：94℃15min；94℃20s、61-55℃1min(每个循环降0.6℃)、10个循环；94℃20s、55℃60s、26个循环。
具体可通过酶标仪的FAM HEX ROM光束扫描并采用Kluster Caller分型软件对K-IWB41105引物组扩增的PCR产物进行检测和分型，如图1所示。
3、以步骤2的分型结果，确定待测材料的基因型：如果待测材料的分型与周8425B相同，则待测材料基因型与周8425B相同，为AA纯合型；如果待测材料的分型与中国春相同，则待测材料基因型与中国春相同，为GG纯合型；如果待测材料的分型与周8425B与中国春的F1代相同，则待测材料基因型与周8425B与中国春的F1代相同，为AG杂合型。
4、将步骤3的244个家系的基因型结果与原芯片基因型分型比对，结果完全一致，说明K-IWB41105引物组可用于检测待测小麦的基因型。
二、用Str-IWB41105引物组检测周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系，并利用周8425B、中国春、周8425B与中国春杂交得到的F1代作为对照。
1、提取周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系的基因组DNA，得到DNA浓度为100ng/μl的模板溶液。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用引物组Str-IWB41105进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，利用纯水替换模板作为对照。
按照“Long YM,Chao WS,Ma GJ,Xu SS,Qi LL(2017)An innovative SNPgenotyping method adapting to multiple platforms and throughputs.Theor ApplGenet130:597–607.”一文制备Str-IWB41105引物组的PCR扩增的5μl体系：1×NH4 +Buffer(BBI B600066-006)，betaine(RTE 3103-02)0.8M，BSA(Abcam ab18843)0.04％，MgCl2(Merck Millipore 20-303)1.5mM，dNTP(Takara R500Z)50μM，PEA-1引物100nM，PEA-1引物100nM，AMAS-1引物20nM，AMAS-2引物20nM，共同反向引物100nM，rTaq DNA(Takara R500Z)1U，基因组DNA 100ng，用ddH2O补充至5μl。其中，PEA-1引物为：5'-FAM-AGCTGGTT-Sp9-GCAACAGGAACCAGCT(Dabcyl-dT)ATGAC-3'，PEA-2引物为5'-HEX-ACTGCTCAAGAG-Sp9-GACGCAAGTGAGCAGT(Dabcyl-dT)ATGAC-3'。
Str-IWB41105引物组的PCR扩增的程序：94℃3min；94℃20s、56-50℃2min(每个循环降1℃)、6个循环；94℃20s、60℃1min、35个循环；62℃2min。
具体可通过酶标仪的FAM HEX ROM光束扫描并采用Kluster Caller分型软件对Str-IWB41105引物组扩增的PCR产物进行检测和分型，如图2所示。
3、以步骤2的分型结果，确定待测材料的基因型：如果待测材料的分型与周8425B相同，则待测材料基因型与周8425B相同，为AA纯合型；如果待测材料的分型与中国春相同，则待测材料基因型与中国春相同，为GG纯合型；如果待测材料的分型与周8425B与中国春的F1代相同，则待测材料基因型与周8425B与中国春的F1代相同，为AG杂合型。
4、将步骤3的244个家系的基因型结果与原芯片基因型分型比对，结果一致，说明Str-IWB41105引物组可用于检测待测小麦的基因型。
三、田间小麦成株抗性与基因型的关系
利用步骤一和二的方法检测基因型的结果完全一致，结果如表1所示，然后进行田间小麦成株抗性鉴定，结果如表1所示。
表1、周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系的基因型与表型的关系
Figure BDA0001585728660000101
Figure BDA0001585728660000111
Figure BDA0001585728660000121
Figure BDA0001585728660000131
Figure BDA0001585728660000141
Figure BDA0001585728660000151
Figure BDA0001585728660000161
注：1 2015郑州：指在2015年郑州244个家系3个重复的白粉病最大严重度的平均值；
2 2015北京：指在2015年北京244个家系3个重复的白粉病最大严重度的平均值；
3 2016郑州：指在2016年郑州244个家系3个重复的白粉病最大严重度的平均值；
4 2016北京：指在2016年北京244个家系3个重复的白粉病最大严重度的平均值；
5平均值：指244个家系的白粉病最大严重度四个环境平均值；
6基因型：用K-IWB41105引物组和Str-IWB41105引物组检测的基因型结果。
用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型对244个家系中的两种基因型及对应的表型进行t检验，如表2所示，结果表明：四个环境中的MDS以及四个环境的平均MDS均表现出AA纯合型小麦MDS显著低于GG纯合型小麦MDS。表明，可利用本发明的SNP分子标记IWB41105及Str-IWB41105引物组和K-IWB41105引物组鉴定小麦的白粉病抗性。
表2、周8425B/中国春F8代RIL群体244个家系两种基因型的白粉病最大严重度差异
显著性检验
Figure BDA0001585728660000162
1基因型：由Str-IWB41105引物组和K-IWB41105引物组检测所得基因型。
实施例3、用K-IWB41105引物组和Str-IWB41105引物组检测103份周8425B衍生品种基因型。
103份周8425B衍生品种由周口市农业科学院提供，并保存于申请人所在实验室的种质库，公众可从申请人处或周口市农业科学院获得这些材料。
待测品种田间表型鉴定：103份周8425B衍生品种分别种植于郑州、荥阳和北京，进行白粉病成株抗性田间鉴定。
按照实施例2中步骤一的1-3的方法用K-IWB41105引物组检测103份待测品种的基因型，结果如图3所示。
按照实施例2中步骤二的1-3的方法用Str-IWB41105引物组检测103份待测品种的基因型，结果如图4所示。
103份周8425B衍生品种由Str-IWB41105引物组和K-IWB41105引物组检测的基因型完全一致，结果见表1。
103份周8425B衍生品种的3个环境中的白粉病最大严重度(MDS)的平均值如表3所示。
表3、103份周8425B衍生品种的基因型1和白粉病最大严重度平均值2
Figure BDA0001585728660000171
Figure BDA0001585728660000181
Figure BDA0001585728660000191
1基因型：由Str-IWB41105引物组和K-IWB41105引物组检测所得基因型
2平均值：指北京、郑州、荥阳三个环境中白粉病最大严重度的平均值。
用国际通用SAS9.2统计软件PROC TTEST模型对103份品种中的两种基因型及对应的表型进行t检验，如表4所示，结果表明：AA纯合型的小麦比GG纯合型的小麦的MDS的平均值降低了5.3％，在0.05水平上有显著差异。表明，可利用本发明的SNP分子标记IWB41105及Str-IWB41105引物组和K-IWB41105引物组鉴定小麦的白粉病抗性。
表4、103份周8425B衍生品种中两种基因型的白粉病最大严重度差异显著性检验
Figure BDA0001585728660000201
1基因型：由Str-IWB41105引物组和K-IWB41105引物组检测所得基因型。
2平均值：指北京、郑州、荥阳三个环境中白粉病最大严重度的平均值。
<110> 河南丰德康种业有限公司、中国农业科学院作物科学研究所
<120> 小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
actgtgctct tccgtcca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
actgtgctct tccgtccg 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ccaaccaact tcactgatat gaaaa 25
<210> 4
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
actgtgctct tccgtccata tctgagcaca tgattgagag tggatggaca cggtgttttt 60
ttcatatcag tgaagttggt tgg 83
<210> 5
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
actgtgctct tccgtccgta tctgagcaca tgattgagag tggatggaca cggtgttttt 60
ttcatatcag tgaagttggt tgg 83
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc tactgtgctc ttccgtcca 39
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat tactgtgctc ttccgtccg 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
gcaacaggaa ccagctatga cactgtgctc ttccgtcca 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
gacgcaagtg agcagtatga cactgtgctc ttccgtccg 39

Claims (6)

1.小麦分子标记在鉴定小麦白粉病抗性或筛选抗白粉病小麦中的应用；
所述小麦分子标记为下述M1）或M2）：
M1）小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸为A或G；
M2）含有M1）的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：M2）为序列4所示的DNA片段，序列4的第18位的核苷酸为A或G。
3.下述X1）或X2）的方法：
X1）一种鉴定小麦的抗白粉病性状的方法，包括：鉴定待测小麦的基因型，所述基因型为AA基因型和GG基因型，AA基因型待测小麦具有抗白粉病性状，GG基因型待测小麦不具有抗白粉病性状，
X2）鉴定两种待测小麦的抗白粉病性状的方法，包括：鉴定所述两种待测小麦的基因型，所述基因型为AA基因型和GG基因型，AA基因型待测小麦白粉病抗性高于GG基因型待测小麦；
所述鉴定待测小麦的基因型按照包括如下步骤的方法进行：
检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸，如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g1）的染色体，所述待测小麦为AA基因型小麦；如所述待测小麦基因组中两条染色体均为下述g2）的染色体，所述待测小麦为GG基因型小麦；
g1）对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸为A；
g2）对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸为G。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基因组DNA中对应于序列表中序列4的第18位的核苷酸包括如下Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ：
Ⅰ、利用P引物组对待测小麦基因组DNA进行扩增，得到PCR产物；如所述PCR产物的序列为序列4，所述待测小麦为AA基因型小麦；如所述PCR产物的序列为序列5，所述待测小麦为GG基因型小麦；所述P引物组由序列表中序列1、2和3所示的三条单链DNA组成；
Ⅱ、利用K-IWB41105引物组采用KASP的方法对待测小麦进行分型，确定所述待测小麦为AA基因型或GG基因型小麦；所述K-IWB41105引物组由序列表中序列6、7和3所示的三条单链DNA组成，序列6和7所示的单链DNA分别标记有不同的荧光基团；
Ⅲ、利用Str-IWB41105引物组采用STARP的方法对待测小麦进行分型，确定所述待测小麦为AA基因型或GG基因型小麦；所述Str-IWB41105引物组由序列表中序列8、9和3所示的三条单链DNA组成，序列8和9所示的单链DNA分别标记有不同的荧光基团。
5.一种筛选抗白粉病小麦的方法，包括：按照权利要求3或4中所述的鉴定待测小麦的基因型的方法鉴定小麦的基因型，筛选得到AA基因型小麦即为抗白粉病小麦。
6.下述任一应用：
H1）检测权利要求1或2中所述小麦分子标记的物质在鉴定小麦白粉病抗性中的应用；
H2）检测权利要求1或2中所述小麦分子标记的物质在筛选抗白粉病小麦中的应用。
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