CN108060247B - 一种与陆地棉8号染色体纤维强度相关的单体型 - Google Patents

一种与陆地棉8号染色体纤维强度相关的单体型 Download PDF

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Abstract

本发明属于棉花分子育种技术领域,公开了一种与陆地棉纤维强度相关的单体型及其检测和应用。所述的单体型是以棉花稳定的RIL群体为材料,通过基因组重测序的方法得到。利用本发明所公开的这些单体型,为棉花的分子标记辅助选择育种提供了一种新方法,缩短育种周期,在培育优异棉纤维品种或研究中具有重要意义。

Description

一种与陆地棉8号染色体纤维强度相关的单体型
技术领域
本发明属于棉花分子育种技术领域,具体涉及一种与陆地棉纤维强度相关单体型的筛选和应用。
背景技术
棉花是关系国计民生的重要战略物资,是仅次于粮食的第二大农作物,涉及到农业和纺织工业两大产业,在国民经济中起着重要作用。随着人们对中高档纺织品需求的增长,对纤维品质的要求日益提高,但传统的育种手段主要是通过表型进行选择,育种效率低,难以满足品质育种的需要。分子标记技术的发展使直接选择数量性状的基因型成为了可能。通过构建棉花遗传图谱进行QTL定位可以使育种者直接选择纤维品质等数量性状的基因型,通过利用F2和RIL等作图群体进行了纤维品质QTL定位研究也取得了丰硕的成果。尤其以第三代标记技术SNP标记的开发和应用,更可为以后的标记辅助育种打下基础。
袁有禄等利用一个异常棉高强纤维渐渗系7235和陆地棉遗传标准系TM-1为亲本构建了F2、F2:3分离群体,鉴定了一个可以在中国的不同棉区及美国等多个环境中均能检测到主效QTL,可解释30%以上的表型变异(袁有禄等,棉花高品质纤维性状QTLs的分子标记筛选及其定位,遗传学报,2001,28(12):1151-1161);孙福鼎以0-153和黄河流域推广的抗虫棉品种中棉所41选系sGK9708为亲本杂交,通过F2:6的单株选择,构建了一套含有196个系的陆地棉F 6:8重组自交系群体,并进行了两年三点四个环境(07年安阳、08年安阳、曲周、临清)的重复试验,筛选多环境稳定表达的主效QTLs,采用复合区间作图法检测到与纤维强度相关的QTL共7个,采用基于混合线性模型的复合区间作图法检测与纤维强度相关的互作QTL2对(孙福鼎等,陆地棉重组自交系群体纤维品质及产量性状遗传变异分析,棉花学报,2010,22(4):319-325)Jamshed利用重组自交系(RIL)群体构建遗传图谱,定位到47个QTL在多个环境下稳定,这些QTL多以聚合群的形式存在,控制两个或两个以上的性状,这些QTL主要集中在4、7、14、25号染色体(Jamshed et al.Identification of stablequantitative trait loc(QTLs)for fiber quality traits across multipleenvironments in Gossypium hirsutum recombinant inbred line population.BMCGenomics,2016,17:197);Zhang等通过两个陆地棉品种0–153和SGK9708构建的重组自交系群体利用SLAF序列构建了有5521个单核苷酸多态性标记,覆盖总距离为3259.37cM的高密度遗传图谱(Zhang et al.Construction of a high-density genetic map by specificlocus amplified fragment sequencing(SLAF-seq)and its application toQuantitative Trait Loci(QTL)analysis for boll weight in upland cotton(Gossypium hirsutum.).BMC Plant Biology,2016,16:79)。
连锁不平衡(Linkage disequilibriuln,LD)指的是不同基因座位上等位基因的非随机性组合。关联分析(Association analysis)是在植物数量性状研究和植物育种中应用的一种较新的分析方法。它以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系(Mackay I,Powell W.Methods for linkage disequllibrium mappingincrops[J].Trends Pl antSci,2007,12:57-63)。与重组群体比较,它的显著优点是高通量,即能在全基因组范围内有效地检测大量的具有不同遗传背景的种质资源材料的性状控制基因位点或区域;除高通量优点外,由于全基因组关联分析一般是以现有的自然群体为材料,所以比一般的重组群体花费的时间要少很多;同时,精度高,可达到单基因的水平(杨小红等.植物数量性状关联分析研究进展[J].作物学报,2007,33(4):523-530)。
连锁不平衡的衰减距离(LD decay)决定了进行全基因组范围的关联分析时所需标记的数目以及精确度,自然群体中的LD水平一定程度上决定了全基因组关联分析的分辨率(M ichael D,et al.Genetic properties of the maize nested associationmapping population[J].Science,2009,737:325)。位点之间的等位基因频率的大小和重组率会影响连锁不平衡的水平,所以在群体中的自然突变、重组、亚群体结构、人工选择的压力、以及遗传漂变等都会影响连锁不平衡(LD)的结构(Gupta et al.,2005;Oraguzie etal.,2007)。在进行全基因组关联分析时,群体中的亚群结构和材料之间亲缘关系使得整个关联群体的连锁不平衡程度增强,这可能会提供假阳性结果。所以,在进行关联分析前有必要对群体结构和亲缘关系进行分析,并且要以群体结构和亲缘关系作为协变量可以有效地减少假阳性标记的产生。
单体型(Haplotype)是位于一条染色体特定区域的一组相互关联,并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合,又称单倍体型或单元型。同一染色体上的连锁不平衡的多个分子标记的情况即为单体型。SNPs位点并不是独立遗传的,而是在染色体上倾向于以一个整体遗传给后代,成组遗传的SNPs位点在一代又一代的遗传中绝少发生重组。于是,这样的一组SNPs位点类型也就是单体型(RW Morris,NL Kaplan.On the advantage ofhaplotype analysis in the presence of multiple disease susceptibilityalleles.Genetic Epidemiology,2002,23(3):221-233)。由于单体型包含着多个SNPs的遗传信息,许多研究表明,在与复杂性状的相关分析中,采用单体型比单个SNPs具有更好地统计分析效果(Hoehe M R.Haplotypes and the systematic analysis of geneticvariation in genes and genomes.Pharmacogenomics,2003,4(5):547-570。而棉花中的纤维强度属于简单的数量性状,开发鉴定特定性状相关的单体型即可在苗期初步鉴定棉花材料的是否为高强度纤维品系。
本发明通过构建198份棉花品种的关联群体,利用基因组重测序进行基因分型,结合多年多点共11个环境下的纤维强度的表型数据进行了全基因组关联分析,旨在定位筛选出与这些性状含量相关的分子标记,并构建单体型,用于分子标记辅助选择、分子育种及后续相关基因的克隆与功能验证。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:通过筛选出与陆地棉纤维强度相关的单体型,将该单体型应用于棉花纤维品质的辅助选择,可以尽快的提高我国棉花品种的纤维品质水平。
本发明提供的技术方案是,一个与陆地棉纤维强度相关的单体型,定位在陆地棉8号染色体,与纤维强度相关的一个QTL(qFS-chr8-3)中,该QTL在3个环境下检测稳定,该单体型包括2个SNP标记,大小为353bp,分别为CRI-SNP198938、CRI-SNP198939,SNP标记在染色体上的位置和突变碱基如下表所示:
SNP chrom position alleles
CRI-SNP198938 Chr_A08 3724155 A/G
CRI-SNP198939 Chr_A08 3724508 C/T
本发明中,QTL命名参考McCouch等(1997)在水稻中的命名规则,以q+性状+连锁群+QTL个数的形式表示(参考文献:McCouch SR,Cho YG,Yano M,et al.Report on QTLnomenclature,Rice Genet Newslett.,1997,14:11-13),例如qFS-chr8-3表示定位到8号染色体与纤维强度相关的第二个QTL。多态性位点的命名规则为,CRI:Cotton ResearchInstitute代表中国农业科学院棉花研究所;SNP代表标记类型;数字代表标记开发顺序。
同时,本发明还提供了一种与陆地棉纤维强度相关单体型的筛选方法,包括如下步骤:
(1)利用大田推广的陆地棉栽培品种中棉所41选系SGK9708和具有亚洲棉高强纤维基因的陆地棉优异品系0-153为亲本构建F2和F2:3群体;
(2)F2:3群体家系内每世代自交,在F2:6世代进行一次单株选择,再种植两代到F6:8,把F6:8及以后的世代作为重组自交系群体进行多年多点实验;
(3)提取重组自交系群体和亲本的DNA;
(4)对样品进行重测序,通过reads间聚类的方法开发SLAF标签,根据多态性及完整度对标记进行过滤,对过滤后的SLAF标签进行基因型编码,通过与参考基因组的定位将SLAF标签分为26个连锁群,进行遗传图谱的构建,根据遗传图谱进行QTL的定位,针对已经定位到的QTL区间,进行单体型定位,得到单体型,并在亲本以及群体中,确定单体型的变异情况。
本发明的有益效果如下:
本发明所涉及的1个与多环境稳定的高强纤维有关的QTL,qFS-chr8-3能在3个环境下(2008年临清、2009年安阳、2010年安阳)检测到,可解释的表型变异为5.44~7.62%,加性效应值为0.62~1.00cN/tex。根据本发明所筛选出的与纤维强度相关的单体型,若待测样品的基因型为A时,则为高纤维强度材料,若待测样品的基因型为B时,则为低纤维强度材料,其余情况则为中等强度纤维样品,或被确定为基因型分别为A、B、C的待测样品,其鉴定基因型A的样品纤维强度大于基因型为B/C的样品,若鉴定基因型为C的样品,其纤维强度高于被基因型被确定为B的样品,这些鉴定结果在苗期即可完成,快速简便,该发明中所包含的多态性位点分子标记是以棉花稳定的RIL群体为材料,通过基因组重测序的方法得到,利用软件HaploView,针对已经定位到的QTL区间,进行单体型定位,得到单体型,并在亲本以及群体中,确定单体型的变异情况。利用该发明中单体型可以快速筛选出纤维强度高的株系,进行分子标记辅助育种选择,可大大缩短育种周期,提高棉花纤维强度的育种效率。
附图说明
图1是通过基因组重测序得到的总图距为5197.17cM的遗传图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明,但并不是对本发明的限制,仅仅做示例说明。
实施例1:
(1)重组自交系F6:8的获得
2007年-2008年的田间种植和DNA的提取请见专利申请公开号:CN 101613761A,发明名称:与棉花纤维强度主效基因连锁的SSR标记的专利申请文件。2009年分别于河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验站,中国农业大学曲周试验站和新疆阿克苏德佳科技种业有限公司试验站种植亲本和F6:10群体。安阳和曲周采用单行区,5米行长,行距分别为0.8m和(0.8+0.5)m,每行20株;新疆采用6行区,2米行长,每行15株。2010年分别于河北高邑原种场,河南安阳中国农业科学院试验站和河南郑州种植亲本和F6:11群体,安阳和郑州采用单行区,行长5m,行距0.8m;高邑采用单行区,行长4m,宽窄行(0.8+0.6)m。上述各个试点都采用不完全随机区组设计,种植两个重复。9月中下旬进行田间取样,按家系收花,取12g左右的纤维样品进行纤维品质的测定。
(2)提取重组自交系群体和亲本的DNA。
(3)选择以中国农业科学院棉花研究所提供的棉花四倍体基因组序列为参考基因组进行电子酶切预测(Li FG,Fan GY,Lu CR,Xiao GH,Zou CS,Kohel RJ,Ma ZY,Shang HH,Ma XF,Wu JH,et al.Genome sequence of cultivated Upland cotton(Gossypiumhirsutum TM-1)provides insights into genome evolution.Nature Biotechnology,2015,33(5)),最终选择HaeIII+SspI酶,酶切标率为98.61%,共得到495.48Mreads,酶切片段长度在364-414bp的序列定义为SLAF标签。
(4)根据选定的最适酶切方案,对检测的各样品基因组DNA进行酶切实验,对得到的酶切片段(SLAF标签)进行3’端加A处理,连接Dual-index测序街头,PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段,文库质检合格后用IlluminaHiseqTM2500进行测序。
(5)利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别,得到各个样品的reads。通过reads间聚类的方法开发SLAF标签,
(6)通过生物信息学分析,共得到321797个SLAF标签。按照在群体中具有多态性,MAF值>0.05,以及标记完整度>=60%,三个标准对标记进行过滤,最终得到标记20270个。
(7)对多态性的SLAF标签进行基因型编码,基因型编码规则为遗传学通用的2等位编码规则,如某标记的亲本基因型为aa(父本)和bb(母本),子代基因型ab则表示该样品在这个标记的编码类型为杂合,其中有一个基因型来自于父本,有一个基因型来自于母本。
(8)通过与参考基因组的定位将SLAF标签分为26个连锁群,计算高质量分子标签间的LOD值,通过LOD值进行连锁分群,对每个连锁群采用HighMap软件进行遗传图谱的构建,通过校正,得到总图距为5197.17cM的遗传图谱。
(9)采用软件QTL IciMapping V4.0(http://www.isbreeding.net/software/)和软件WinQTLCart 2.5,通过11个环境(2007年安阳(07ay)、2008年安阳(08ay)、2008年临清(08lq)、2008年曲周(08qz)、2009年安阳(09ay)、2009年曲周(09qz)、2009年阿克苏(o9xj)、2010年安阳(10ay)、2010年高邑(10gy)、2010年郑州(10zz)、2013年安阳(13ay))纤维强度性状的表型数据和基因型数据(见下表),进行纤维强度性状的多环境QTL定位分析,得到与强度相关的QTL共3个,其中三个环境以上稳定的有2个,其中有一个定位到单体型,即qFS-chr8-3。
Figure BDA0001533181040000061
Figure BDA0001533181040000071
(10)利用软件HaploView,针对上述已经定位到的QTL区间qFS-chr8-3,进行单体型定位,得到单体型,并在亲本以及群体中,确定单体型的变异情况。
Figure BDA0001533181040000072
Figure BDA0001533181040000081
(R:A/T,Y:C/T)
可见,当单体型的基因型为A时,所测样品的纤维强度均值≥33.0cN/tex,属高强材料;当单体型的基因型为B时,所测样品的纤维强度均值范围为≤27.0cN/tex属于低强材料,当鉴定基因型为C时纤维强度大致范围为27.0-33.0cN/tex。通过该单体型所述的基因型,通过分析统计手段即可快速进行鉴定,以便更好地筛选所需品种,灵活、快速,缩短育种周期,提高育种效率。
实施例:2:
(1)利用本课题已构建的棉花自然群体,共306份材料进行简化基因组重测序,根据棉花基因组大小以及GC含量等信息,最终选取棉花基因组作为参考基因组。具体信息如下所示:测序物种信息:棉花,实际基因组大小约为2.95G,GC含量为34.11%;参考物种信息:棉花基因组。组装出的基因组大小为2.55G,GC含量为34.11%
(2)对得到的酶切片段(SLAF标签)进行3′端加A处理、连接Dual-index[3]测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段,文库质检合格后用IlluminaHiSeq进行测序。
(3)最终确定使用HaeIII+SspI-HF酶切,酶切效率为95.70%,酶切片段长度在364-414的序列定义为SLAF标签,测序共得到1,970.53M reads。通过生物信息学分析,获得1,577,828个SLAF标签,标签的平均测序深度为13.19x。
(4)利用BWA将测序reads比对到参考基因组上,并使用GATK和samtools两种方法开发SNP,以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集,共得到3,464,561个群体SNP。根据完整度>0.6,MAF>0.05过滤,共得到133,846个高一致性的群体SNP其中多态性的SLAF标签共有889,412个,共得到3,464,561个群体SNP。
(5)利用上述提到的SNP标记进行检测,与实施例1中的SNP结果进行统计,随机抽取20份材料。检测结果如下表所示:
Figure BDA0001533181040000091
(6)将上述20份材料的田间数据和纤检结果中纤维强度值进行核对,所选取为三个环境,分别为2016安阳、2015安阳、2015阿拉尔,统计结果如下表所示:
Figure BDA0001533181040000092
Figure BDA0001533181040000101
综上所述,当单体型的基因型为A时,所测样品的纤维强度均值≥33.0cN/tex,属高强材料;当单体型的基因型为B时,所测样品的纤维强度均值范围为≤27.0cN/tex属于低强材料,当鉴定基因型为C时纤维强度范围为27.0-33.0cN/tex,可利用标记CRI-SNP198938
、CRI-SNP198939可快速确定待测样品的是否为高强材料,检测方法快速有效,可大大缩短育种周期,提高育种效率。

Claims (3)

1.一种与陆地棉纤维高强基因连锁的单体型,大小为353bp,包括2个SNP分子标记,分别为CRI-SNP198938、CRI-SNP198939,SNP标记在染色体上的位置和突变碱基如下表所示:
SNP chrom position alleles CRI-SNP198938 Chr_A08 3724155 A/G CRI-SNP198939 Chr_A08 3724508 C/T
所述单体型定位在陆地棉8号染色体与纤维强度相关的1个QTL内,即:qFS-chr8-3,该QTL可在3个环境中稳定检测到。
2.根据权利要求1所述的单体型,其特征在于:所述2个SNP分子标记位点依次为下述a)、b)和c)的情况时相对应的基因型分别为A、B和C:
a):G/G、T/T;
b):A/A、C/C;
c):G/A、T/C。
3.一种检测棉花纤维强度的方法,其特征在于:根据权利要求2所述的单体型和通过待测材料的基因分型结果,若待测样品的基因型为A时,所测样品的纤维强度均值>33.0cN/tex,属高强材料;若待测样品的基因型为B时,所测样品的纤维强度均值范围为<27.0cN/tex,属于低强材料;若待测样品的基因型为C时,所测样品的纤维强度范围为27.0-33.0cN/tex。
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