CN111100946B

CN111100946B - 一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物及应用

Info

Publication number: CN111100946B
Application number: CN202010065660.3A
Authority: CN
Inventors: 王汉中; 师家勤; 朱瑶瑶; 王新发; 刘贵华; 詹杰鹏
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111100946A

Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体公开了一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物及应用。申请人通过对中双11号和73290的F2:3家系进行田间实验和考种获得粒重性状的表型数据；结合F2分离群体的基因型和遗传图谱，进行QTL检测，获得了A7连锁群上控制油菜粒重的主效基因位点qSW.A7和分子标记BoSF2344。通过该标记对两亲本衍生的F3代进行基因型分析，挑选出来的携带有利基因单株其千粒重均值(4.28g)超过携带不利基因单株均值(3.95g)，且考种结果表明携带有利标记的单株粒重高于携带不利基因单株群体均值比例高达89.8％，因此利用该标记进行辅助选择可大大提高高产育种的选择效率。

Description

一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物，同时还涉及该分子标记在油菜高产育种中的应用。

背景技术

油菜是我国第一大油料作物，约占世界油菜产量的20％。菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，占国产食用植物油总量的57.2％，在国家食用油供给安全战略中占有十分重要的地位。另外，菜籽油与柴油有较为相近的脂肪酸构成，是一种绿色可再生能源。在我国城镇化规模持续扩大，耕地面积进一步缩小的情形下，提高油菜单位面积产油量(＝单产×含油量)已经成为目前我国油菜生产最为迫切的任务之一，是事关我国油菜产业持续与发展的根本问题。

近年来，我国油菜高油份育种取得突破，而单产水平较低。这严重影响了农民种植油菜的积极性，限制了油菜的经济效益和油菜产业的国际竞争力。在相同的种植密度下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量由三个构成因素(单株角果数、粒重和粒重)组成。研究表明油菜单株产量的三个构成因子之间表现出不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(白桂萍等，2016)，这说明可以通过提高单个产量构成因子(如粒重)来增加产量。在油菜种质资源中，粒重呈现出很大的自然变异，千粒重极值范围为2-8克。而国家审定油菜品种的千粒重均值只有3克多，这表明现有油菜品种粒重还有较大的提升空间。因此，增加粒重是提高油菜单产的有效途径之一。

虽然传统育种方法曾经为生产提供了许多优良油菜品种,但由于育种周期长、选择效率低,已经无法完全满足当前油菜生产的需要。随着分子生物学和分子遗传学的发展,育种家们对性状的选择正在逐渐实现由表型选择向基因型选择的过渡。分子标记辅助育种是将分子遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的育种手段,其基本原理是在油菜育种过程中直接利用与目标性状基因紧密连锁和共分离的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选,以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。近年来，美国等发达国家都投入巨资开展这方面的研究工作。伴随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发，利用筛选到的分子标记进行辅助选择育种已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因质量性状扩展到复杂的多基因数量性状。随着基因组学和测序技术的高速发展，油菜分子标记研究日渐受到关注，研究的领域涉及种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因标记和定位、品种纯度鉴定、配合力预测、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。

随着分子标记技术的不断发展，其在作物中的应用越来越广泛。Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记技术。RFLP是第一代分子标记，具有数量丰富、稳定遗传、专一性、重复性好、共显性等特点。但是，该标记对DNA要求量比较大；且操作程序繁琐、耗时费力、周期长；还需要使用放射性同位素对探针进行标记，这些因素都局限了RFLP标记的广泛使用。AFLP标记结合了PCR和RFLP标记技术，在作物遗传多样性研究、细胞学研究、品种纯度鉴定和抗病等研究中得到广泛的应用。但AFLP标记也存在一些缺点：成本较高，过程复杂，技术难度大；标记大多为显性标记；对DNA质量和限制性内切酶质量要求较高。SSR标记，也叫微卫星DNA标记(microsatellite DNA)，已经被广泛应用于作物的基因定位、分子标记辅助选择、DNA指纹图谱、品种纯度鉴定、种质资源的保存及利用和遗传多样性分析等研究中。SSR标记具有数量丰富、多态性高、操作简单、成本较低等优点，长期以来被广泛引用于分子标记辅助选择。近十年来，随着测序技术的持续进步，使得基于基因组序列信息的分子标记开发成为可能，如SNP标记和InDel标记。目前，全基因组选择育种芯片还只在水稻中开始尝试，油菜等其他作物仍以分子标记辅助选择为主。

大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)均表现数量性状的遗传特点，表型连续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative traitloci,QTL)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前对油菜粒重的QTL定位研究也有一些报道，但通常检测出的QTL效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本研究通过QTL定位，旨在筛选到对油菜粒重具有正向效应的QTL，用于油菜产量性状的标记辅助选择。

发明内容

本发明目的是在于提供一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

提供一种油菜粒重性状主效基因位点(QTL位点)分子标记的引物，所述的引物序列为：BoSF2344-F：CCTGAAACGAATCGGTGAAT,如SEQ ID No.1所示，和BoSF2344-R：AGCTCCGACCTTTCTCAACA,如SEQ ID No.12所示。

本发明的另一个目的在于提供一种油菜粒重性状的主效基因位点(QTL位点)分子标记引物的应用，应用方法为：用上述油菜粒重性状主效基因位点(QTL位点)分子标记的引物扩增叶片总DNA，其扩增结果：一个条带，大小为226bp，说明该单株基因型与母本中双11号相同，携带有油菜粒重的不利基因；一个条带，大小为224bp，说明该单株基因型与父本No.73290相同，携带有油菜粒重的有利基因；两个条带，大小为226bp和224bp，说明该单株基因型为杂合类型。

具体可为：取母本中双11号和父本No.73290两亲本衍生的F3代单株，提取其叶片总DNA，用上述油菜粒重性状主效基因位点(QTL位点)分子标记的引物扩增，然后进行基因型分析，应用于油菜高产育种。

一种油菜粒重性状紧密连锁的分子标记引物的应用，该引物还可应用于甘蓝型油菜的图位克隆、分子标记辅助选择等方面。

油菜粒重性状的QTL位点的获得，它包括如下步骤：

(1)利用在粒重上有极显著差异的油菜品种中双11号和73290杂交，杂种F1代自交产生F2群体及其F2:3家系。

(2)采用CTAB法(Doyle et al.1987)提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA。

(3)合成油菜公开(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)和自主开发的SSR和InDel引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。

(4)利用筛选到的多态性引物对F2分离群体进行分子标记分析,获得基因型数据。

(5)把F2分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件(商业途径获得)，进行遗传连锁图谱的构建；

(6)F2群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及F2群体及其F2:3家系的粒重性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位。其中，位于A7连锁群上的QTL在两个群体中能重复检测到，而且效应值和贡献率较大。

利用上述技术措施，申请人最终获得了油菜粒重性状的主效基因位点qSW.A7，该主效基因位点位于油菜A7染色体，与申请人自主开发的SSR标记BoSF2344紧密连锁，针对BoSF2344F设计其引物序列为5’-CCTGAAACGAATCGGTGAAT-3’；CNU288R:5’-AGCTCCGACCTTTCTCAACA-3’。利用WinQTLCart2.5软件分析测得其对油菜粒重的贡献率为10.2％,加性效应为-0.18，显性效应为0.02。所述的QTL位点的效应值和贡献率都较高，对油菜粒重的调控起着关键作用，该引物可用作图位克隆、油菜高产育种、分子标记辅助选择。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明定位了油菜品种中双11号控制粒重的重要QTL位点，该标记与离主效基因位点的遗传距离很近(<2cM)且是基于基因组序列信息的共显性SSR标记，因而可靠且使用方便，这给今后中双11号衍生品系的选育提供了极大的便利。可解释10.2％的表型方差。在常规育种方法中，粒重性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费力且选择效率低下(粒重表型受环境影响较大)。通过检测粒重性状主效基因位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中粒重主效基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。申请人利用该标记对育种群体后代进行了辅助选择，挑选出来的携带有利基因单株其千粒重均值(4.28g)超过携带不利基因单株均值(3.95g)，且考种结果表明携带有利标记的单株粒重高于携带不利基因单株群体均值比例高达89.8％，这表明该标记用于辅助选择是切实有效的。通过检测与粒重性状相关的分子标记，即可预测粒重的大小，进而准确快速筛选大粒单株。

附图说明

图1为F2:3家系在不同环境种植时粒重的频率分布图；

结果表明粒重表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明粒重属于数量性状。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

油菜粒重分离群体的构建及性状测定：

本实施例中使用的分离群体为大粒和小粒油菜亲本中双11号和73290衍生的F2(2009年种植于中国农科院油料所阳逻综合试验基地)及其F2：3家系(2010年、2011年种植于中国农科院油料所阳逻综合试验基地)。两亲本和群体的粒重表型在成熟期收获后经考种鉴定。粒重考种数据表明：两亲本有微弱的超亲分离，表明大粒基因主要分布在中双11号基因组中；群体粒重均呈正态分布，证明粒重性状的数量遗传特征(图1)。

F2：3家系考察了群体两年种植数据，W10F2:3b群体考种的是分枝上的千粒重；W11F2:3m群体考种的是主枝上的千粒重，W11F2:3b群体考种的是分枝上的千粒重，W11F2:3w群体考种的是全株的千粒。

实施例2：

引物的开发和合成：

申请人利用的SSR引物包括两类：一类是已发表文章和芸苔属数据库中公开引物序列(http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php)；另一类是申请人根据白菜和甘蓝scaffold序列开发的，分别命名为BrSF和BoSF系列，具体的开发方法是先利用SSR Hunter软件在每个scaffold搜索SSR，然后用Primer3.0软件设计SSR引物。自主开发的InDel引物则是通过比对73290的重测序序列和中双11的参考基因组序列而来，首先，利用BWA软件把73290的重测序序列定位到中双11的全基因组参考序列上，然后利用samtools软件查找InDel。

实施例3：

引物多态性的筛选，其流程如下：

(1)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。

(2)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，

反应体系：

PCR反应程序：

(3)凝胶电泳带型判读

实施例4：

F2群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：

(1)采用CTAB法提取F2群体179个单株的DNA；

(2)挑选出多态性引物对F2群体179个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。本发明涉及到的分子标记为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作A、B和H，分别表示来源于中双11号、73290和杂合带型。

(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。

(4)利用Joinmap4.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得19个连锁群(含805个分子标记)，恰好对应甘蓝型油菜的19条染色体。

(5)基于该遗传图谱、F2群体的基因型数据以及两群体的粒重表型数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，在A7染色体SSR标记BoSF2344附近(表1)检测到了一个重复性很好的主效QTL位点，其LOD值和贡献率都较大(表2)，其对油菜粒重的贡献率为10.2％，加性效应为-0.18，显性效应为0.02。针对BoSF2344分子标记涉及的引物为表1所示，利用该引物，在中双11号中扩增得到一个条带，大小为226bp，在本发明中记为A；在73290中扩增得到的一个条带，大小为224bp；在杂合子中扩增得到的两个条带，大小为226bp和224bp。

表1 A7连锁群粒重主效QTL连锁标记BoSF2344的引物序列

表2 A7连锁群粒重主效QTL的基本信息

实施例5：

粒重主效QTL连锁标记BoSF2344的有效性验证，其步骤是：

(1)田间种植中选F2单株的F3代种子，在多年多点进行种植。

(2)在定苗前对F3单株挂牌取样，并提取叶片总DNA，利用分子标记BoSF2344对其进行粒重主效QTL基因型的分析。

(3)在成熟期收获F3单株，并对其进行粒重的考种。结果表明，在考种的四个群体73290背景的单株千粒重明显高于群体均值(表3)。分子标记辅助选择挑选出来的73290背景单株均值(4.28g)超过中双11号背景单株其千粒重均值(3.95g)，且73290背景单株高于中双11号背景群体均值的占89.8％(表4)。可见在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出大粒株系用于油菜高产育种。

表3利用SSR标记CNU288辅助选择得到的F3群体的粒重考种数据

注：A、B、H分别代表来源于中双11号、73290、杂合子的分子标记带型。

表4利用SSR标记BoSF2344辅助选择得到的F3单株的粒重考种数据

注：A、B分别代表来源于中双11号、73290的分子标记带型。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种油菜粒重性状主效基因位点的分子标记引物及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 油菜(Brassica napus L.)

<400> 1

CCTGAAACGAATCGGTGAAT 20

<210> 1

<211> 383

<212> PRT

<213> 油菜(Brassica napus L.)

<400> 2

AGCTCCGACCTTTCTCAACA 20

Claims

1.油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物在油菜育种中的应用，所述油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物的序列为：BoSF2344-F：CCTGAAACGAATCGGTGAAT和BoSF2344-R：AGCTCCGACCTTTCTCAACA，具体应用方法为：用油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物扩增叶片总DNA，其扩增结果：一个条带，大小为226bp，说明单株基因型与母本中双11号相同，携带有油菜粒重的不利基因；一个条带，大小为224bp，说明单株基因型与父本No.73290相同，携带有油菜粒重的有利基因；两个条带，大小为226bp和224bp，说明单株基因型为杂合类型。

2.油菜粒重性状主效基因位点分子标记引物在油菜图位克隆中的应用，所述油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物的序列为：BoSF2344-F：CCTGAAACGAATCGGTGAAT和BoSF2344-R：AGCTCCGACCTTTCTCAACA，应用中：用油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物扩增叶片总DNA，其扩增结果：一个条带，大小为226bp，说明单株基因型与母本中双11号相同，携带有油菜粒重的不利基因；一个条带，大小为224bp，说明单株基因型与父本No.73290相同，携带有油菜粒重的有利基因；两个条带，大小为226bp和224bp，说明单株基因型为杂合类型。

3.油菜粒重性状主效基因位点分子标记引物在油菜分子标记辅助选择中的应用，所述油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物的序列为：BoSF2344-F：CCTGAAACGAATCGGTGAAT和BoSF2344-R：AGCTCCGACCTTTCTCAACA，具体应用方法为：用油菜粒重性状主效基因位点分子标记的引物扩增叶片总DNA，其扩增结果：一个条带，大小为226bp，说明单株基因型与母本中双11号相同，携带有油菜粒重的不利基因；一个条带，大小为224bp，说明单株基因型与父本No.73290相同，携带有油菜粒重的有利基因；两个条带，大小为226bp和224bp，说明单株基因型为杂合类型。