CN112593007B - 一种与小麦粒长qtl连锁的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种与小麦粒长QTL连锁的SNP分子标记及应用，属于作物分子遗传育种领域；所述SNP分子标记为KASP‑KL‑sau1，多态性为C/T；所述KASP‑KL‑sau1与小麦粒长QTL QKL.sau‑1B共定位于小麦1B染色体长臂，与QTL QKL.sau‑1B间的遗传距离为4cM，其前后35bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示；本发明公开的KASP‑KL‑sau1与粒长QTL QKL.sau‑1B极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高小麦较长籽粒品种的选择鉴定效率，成功率高，在提高育种工作效率的同时，为小麦粒长基因的研究提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及作物分子遗传育种领域，特别是涉及一种与小麦粒长QTL连锁的SNP分子标记及应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界主要粮食作物之一，小麦产量在世界粮食安全中占有很大比重，我国小麦产量世界第一。为人类提供大概20％的卡路里和25％的蛋白质，同时还是微量元素的重要来源。因此，需要对产量潜力进行遗传改良，同时改善作物管理，以实现农民田地小麦产量的进一步提高。
一般来说，小麦和谷类作物的产量是一个多基因和高度复杂的性状，在植物生长的各个阶段受到环境和遗传相互作用的影响。小麦产量的构成因素包括单位面积穗数、穗粒数和粒重。与产量本身相比，它们对环境的敏感度较低，并被视为提高产量的间接性状。在这些产量构成性状中粒重的遗传力最高，同时粒重与粒长、粒宽、粒厚显著相关并直接影响小麦的产量和品质。从发育角度看，粒长是在籽粒发育早期确定的，受环境条件影响较小，而粒宽和粒厚则建立较晚，对环境的敏感性较高。同时，较大的籽粒对小麦幼苗的活力也有着积极影响，并间接增加小麦产量。因此，鉴定控制这些籽粒相关性状的遗传位点对于阐明小麦产量性状的遗传基础十分重要。
小麦粒长是受多基因控制的复杂数量性状，通常是受一个基因网络控制，且其中多为微效基因，同时也受环境影响。由于表型和基因型之间并不能展现十分清晰的对应关系，故而増加了数量性状研究的困难性。第三代分子标记—单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)的出现，为构建小麦高密度遗传连锁图谱和数量性状遗传研究提供了良好的平台，为这类复杂的数量性状位点(QTL)的分析提供了一条有效的途径。
单核苷酸多态性(SNP)指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。
竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)是由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)(http://www.lgcgenomics.com)研发的低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及InDel位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。
在前人研究中，对粒长进行了QTL定位，发现与粒长相关的QTL在小麦中广泛存在，并且在小麦的21条染色体上均有过报道。然而，目前与小麦粒长性状相关且可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却并不多。因此研究获得有关粒长的QTL或基因，利用分子生物学技术，选择粒形与农艺性状较好的植株进行后续育种试验，最终达到选育增产小麦新品种的目的，在小麦育种工作中意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦粒长QTL QKL.sau-1B连锁的SNP分子标记及其应用，本申请公开的分子标记KASP-KL-sau1与粒长QTL QKL.sau-1B极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高不同环境下粒长较长小麦品种的选择鉴定效率，且成功率高。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：申请人利用小麦品种‘SY95-71’为父本，以小麦品系‘20828’为母本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单粒传法，一直到F7代，获得含有128个单株的重组自交系，构成遗传作图群体。对重组自交系群体粒长进行表型鉴定，提取亲本‘20828’、‘SY95-71’和重组自交系群体植株DNA，使用小麦55KSNP芯片对该群体进行图谱构建，从而定位粒长QTL。小麦55K SNP芯片是在小麦660K SNP芯片的基础上开发的一款经济型中密度SNP芯片。芯片包含55000个左右的小麦SNP标记，均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有2600个标记，标记间的平均遗传距离约为0.1cM，平均物理距离小于300Kb，适合于一般的种质资源多样性分析、遗传作图与新基因发掘、比较基因组分析、品种注册与鉴别。
根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的粒长表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2019年6个生态点及6个生态点粒长的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，在1B染色体长臂上的4cM区间定位出稳定表达的小麦粒长主效QTL QKL.sau-1B，根据侧翼标记的物理定位筛选位于区间内的基因，共筛选获得51个基因，并在该区间开发分子标记，最终得到标记KASP-KL-sau1与粒长QTL QKL.sau-1B紧密连锁(表1)。
本发明所述的小麦粒长QTL QKL.sau-1B，来自父本‘SY95-71’，该QTL位于小麦染色体1B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为566.6-583.6Mbp。本发明提供了上述小麦粒长QTL QKL.sau-1B在调控小麦籽粒性状中的应用。所述小麦粒长QTL QKL.sau-1B显著增加小麦籽粒长度，平均LOD值为9.63，解释约9.48-25.23％的表型变异。
根据上述方法，本发明提供一种与小麦粒长QTL QKL.sau-1B连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为KASP-KL-sau1，多态性为C/T；所述KASP-KL-sau1与小麦粒长QTLQKL.sau-1B共定位于小麦1B染色体长臂上，且与QTL QKL.sau-1B间的遗传距离为4cM，其前后35bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示。
本发明还提供一种所述的SNP分子标记的引物组，所述引物组包括两条5’端修饰不同荧光基团的特异性上游引物和一条通用下游引物；所述两条5’端修饰不同荧光基团的特异性上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示，所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供一种含有所述的SNP分子标记或所述的引物组的试剂盒。
本发明还提供一种含有所述的SNP分子标记或所述的引物组的小麦全基因组芯片。
本发明还提供一种根据所述的SNP分子标记或所述的引物组或所述的试剂盒或所述的小麦全基因组芯片的在小麦分子育种、培育转基因小麦、小麦种质资源改良、筛选具有合适粒长的小麦品种或品系、调控小麦粒长性状、小麦粒长基因遗传分析或小麦粒长基因遗传精细定位中的应用。
本发明还提供一种筛选含有粒长QTL QKL.sau-1B的小麦株系方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，利用所述的引物组对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型。
进一步的，所述荧光定量PCR的反应体系为：5μL Master Mix、1.4μL混合引物、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL。
进一步的，所述荧光定量PCR至少有3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
进一步的，所述荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环。
本发明公开了以下技术效果：
本发明首次公开了来自小麦‘SY95-71’的粒长QTL QKL.sau-1B，位于小麦1B染色体长臂上，显著增加小麦粒长。该QTL在小麦产量(调控粒长)育种中具有较高的利用价值。本发明公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘SY95-71’的粒长QTL QKL.sau-1B的分子标记KASP-KL-sau1，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。本发明公开的分子标记KASP-KL-sau1与粒长QTL QKL.sau-1B极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高适应不同环境的小麦较长籽粒品种的选择鉴定效率，且成功率高。
本发明公开了位于小麦1B染色体上的与小麦粒长连锁的分子标记KASP-KL-sau1，该分子标记是小麦1B染色体长臂上粒长QTL QKL.sau-1B的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦1B染色体上的粒长QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记KASP-KL-sau1与小麦1B上的粒长QTL QKL.sau-1B紧密连锁，可用来对小麦粒长这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰较短籽粒的植株，提高育种工作效率，并为小麦粒长基因的研究提供基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中小麦粒长QTL QKL.sau-1B在1B染色体上的定位；
图2为本发明实施例1中，小麦‘20828’בSY95-71’重组自交系验证群体的株系植株分子标记QKL.sau-1B检测的荧光读值结果；其中，FAM(圆形，‘20828’)荧光为有较短籽粒的株系，HAX(正方形，‘SY95-71’)荧光为较长籽粒株系；黑色菱形荧光为空白对照；
图3为本发明实施例1中，小麦‘S849-8’בSY95-71’重组自交系验证群体的株系植株分子标记QKL.sau-1B检测的荧光读值结果；其中，FAM(圆形，‘S849-8’)荧光为有较短籽粒的株系，HAX(正方形，‘SY95-71’)荧光为较长籽粒株系；黑色菱形荧光为空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所兰秀锦教授种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1小麦粒长QTL QKL.sau-1B及其分子标记KASP-KL-sau1的获得
(1)利用小麦品系‘20828’为母本，以小麦品种‘SY95-71’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单粒传法，一直到F7代，获得含有128个单株的重组自交系，构成遗传作图群体。
(2)重组自交系群体粒长表型鉴定：小麦成熟期对重组自交系群体株系进行收获，脱粒，烘干并进行籽粒性状表型鉴定，每个株系进行30个籽粒长度重复值的测量，并得出平均值，代表该株系的粒长。
(3)55K SNP芯片分析
a)DNA提取：用CTAB法提取亲本‘20828’、‘SY95-71’和重组自交系群体植株DNA。
b)使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本研究中双亲和作图群体的基因型分析由北京博奥晶典生物技术有限公司(http://www.capitalbio tech.com)与贾继增课题组合作开发的55K SNP芯片完成，该芯片市售可得。
c)连锁图谱的构建：根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的粒长表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(Inclusive CompositeInterval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2019年共6个生态点及6个生态点粒长的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，定位出小麦粒长QTL QKL.sau-1B，并计算QTL QKL.sau-1B的位置和分子标记之间的遗传距离。
d)粒长位点的比较以及分子标记的获得：前人报道与籽粒性状相关的QTL或基因较多。Ramya等人利用黑麦品种Rye Selection111(RS)与Chines Spring(中国春)杂交的185株重组自交系(RILs)的定位群体对籽粒性状QTL进行定位分析，检测到8个控制粒长的QTL，分别位于1A、2B、2D、5A、5B、5D染色体上，主效的粒长位点QKl.ncl-2D.1来源于籽粒较长的亲本RS(Journal of Applied Genetics 2010,51(4):421-429)。Fang等人利用亲本Dalibao与BYL8杂交构建的重组自交系群体，并使用205个SSR标记构建了遗传连锁图谱。籽粒相关性状进行QTL定位的结果检测到5个QTL存在于2B、2D、7D染色体上，解释了9.68-19.91％的表型变异，在这些QTL中，qKL7D-1和qKL7D-2分别在两个不同环境下7D染色体Xbrac76和Xwmc698的标记区间内检测到,它们均来源于长粒亲本Dalibao(麦类作物学报2020,36:27-35)。Cui等人利用三个重组自交系群体在1B、2A、2B、2D、3A、3B、5A、6B、7A、7B染色体上检测到了控制粒长的QTL位点，其中8个主效位点QKl-1BL.1，QKl-2B.1，QKl-2D.1，QKl-2D.2，QKl-3A.1，QKl-6B.3，QKl-7B.1和QKl-7B.3在2个或3个群体与多个环境中稳定检测到，并且表型变异在2.02-14.66％之间(Theoretical Applied Genetics 2014,127(3):659-675)。Brinton等人对粒长相关QTL有更深入的研究，在检测到主效QTL的同时对QTL的分子机制进行研究。其检测到一个位于5A的主效QTL，该QTL通过增加种皮细胞的长度从而增加粒长，达到增加粒重的目的(New Phytologist 2017,215(3):1026-1038)。位于1B上的QTL很少且都与QKL.sau-1B的距离很远，这表明QKL.sau-1B是一个新的稳定的QTL。
为了进一步获得与粒长QTL QKL.sau-1B紧密连锁的分子标记，利用55K SNP芯片数据定位结果对侧翼标记开发成KASP分子标记，需要如下几个步骤：
(I)多态性位点上下游KASP引物的设计。在获得多态性位点之后，需要设计KASP特异引物。由如前所述，小麦为异源六倍体植物，则仍然要凭借熟练的生物信息学技术对ABD染色体序列进行分析，从而获得特异于目标染色体的KASP引物。
(II)KASP引物扩增条件的优化。引物合成之后，需要凭借经验进一步对引物扩增条件进行调试优化，以便能达到在亲本之间能够显著区分的效果。
综上所述，虽然KASP标记技术已经广泛应用于二倍体物种，但是要想在六倍体小麦中获得高效的KASP标记时，对本领域技术人员而言绝非易事。
最终经过多次KASP标记开发，引物设计和扩增，共设计KASP引物10对,最终得到标记KASP-KL-sau1与粒长QTL QKL.sau-1B紧密连锁(表1)。
KASP-KL-sau1前后35bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示：CGAGGAAGGCAAAAAATGATTTCATGTGATAGCAC[C/T]GATACCTCGATTTTTGGGA GGTTCATTGAAAATGA。
表1 KASP引物序列
设计的10对KASP引物中最终得到了1个分子标记KASP-KL-sau1，其与粒长QTLQKL.sau-1B紧密连锁，结果见图1-2。
实施例2分子标记KASP-KL-sau1在选择控制粒长QTL QKL.sau-1B上的应用
(1)利用较长粒长的普通小麦品系‘S849-8’为母本，普通小麦品系‘SY95-71’为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择90个株系。
(2)对所获得的90个株系进行KASP-KL-sau1标记检测，具体方法为：提取90个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-KL-sau1的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述引物为：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATTTCATGTGATAGCACC-3’(SEQ ID No.1)
HEX标签上引物：(下划线部分为HEX标签序列)5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGATTTCATGTGATAGCACT-3’(SEQ ID No.2)通用下游引物：5’-ACCTCCCAAAAATCGAGGTA-3’(SEQ IDNo.3)
PCR扩增的扩增体系为：5μL Master Mix、三条引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O 460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
荧光读值结果如图3所示，将检测到与‘S849-8’一致的FAM(橙色)荧光的植株基因型记为B，为粒长较短的株系，同‘SY95-71’一样表现为HAX(蓝色)荧光的植株基因型记为A，为粒长较长的株系。各个株系基因型与粒长的表型值如表2所示。与含有粒长QTL KASP-KL-sau1的‘SY95-71’类型相同的植株平均粒长为7.42mm，极显著高于与‘S849-8’类型的植株平均粒长(6.81mm)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的粒长QTL KASP-KL-sau1确实有显著增加粒长的作用；同时本发明的分子标记KASP-KL-sau1可以用与跟踪鉴定粒长QTLKASP-KL-sau1。
表2‘S849-8’בSY95-71’重组自交系KASP-KL-sau1基因型与表型对应结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种与小麦粒长QTL连锁的SNP分子标记及应用
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc ttgatttcat gtgatagcac c 41
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<212> DNA
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gcaaatgcac aatgattcat 20
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<212> DNA
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acacagccac aaacagatta 20
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caattgtgag cacgagaaa 19
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cgaggaaggc aaaaaatgat ttcatgtgat agcacygata cctcgatttt tgggaggttc 60
attgaaaatg a 71
Claims (8)
1.一种引物组，其特征在于，所述引物组包括两条5’端修饰不同荧光基团的特异性上游引物和一条通用下游引物；
所述两条5’端修饰不同荧光基团的特异性上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示，所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种含有权利要求1所述的引物组的试剂盒。
3.一种含有权利要求1所述的引物组的小麦全基因组芯片。
4.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒或权利要求3所述小麦全基因组芯片在筛选具有合适粒长的小麦品种或品系、调控小麦粒长性状、小麦粒长基因遗传分析或小麦粒长基因遗传精细定位中的应用，其特征在于，所述小麦品种为SY95-71或20828。
5.一种筛选含有小麦粒长QTL QKL.sau-1B的小麦株系方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物组对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型；所述小麦粒长QTL QKL.sau-1B位于小麦染色体1B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为566.6-583.6Mbp；所述小麦品种为SY95-71或20828。
6.根据权利要求5所述的筛选含有小麦粒长QTL QKL.sau-1B的小麦株系方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：5μL Master Mix、1.4μL混合引物、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL。
7.根据权利要求6所述的筛选含有小麦粒长QTL QKL.sau-1B的小麦株系方法，其特征在于，所述荧光定量PCR至少有3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
8.根据权利要求5所述的筛选含有小麦粒长QTL QKL.sau-1B的小麦株系方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性延伸60s，共26个循环。
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