CN111893207B - 一种与小麦旗叶长QTL QFll-2B连锁的KASP分子标记及其应用 - Google Patents

一种与小麦旗叶长QTL QFll-2B连锁的KASP分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与小麦旗叶长QTL QFll‑2B连锁的KASP分子标记及其应用，该分子标记位于RefSeqv1.0基因组的2B染色体长臂上。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦旗叶长QTL QFll‑2B，预测小麦的旗叶长特性，进而方便进行分子育种。本发明还公开了一种鉴定小麦旗叶长QTL QFll‑2B的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强旗叶长的预测的准确性，能更快速筛选出具有较长旗叶的小麦品种或品系用于育种，大大加快小麦育种的进程。

Description

一种与小麦旗叶长QTL QFll-2B连锁的KASP分子标记及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学及作物遗传育种技术领域，具体涉及一种与小麦旗叶长QTL QFll-2B连锁的KASP分子标记及其应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的作物之一，其播种面积占全国耕地面积的20％-30％。它是35％人口的主要食物。据报道，小麦生产应该增加70％以满足未来的粮食需求。
随着人口的增加、可利用耕地面积的减小，提高小麦产量是解决粮食需求矛盾的重要途径。光合作用是作物干物质积累和产量形成的基础，叶片是小麦进行光合作用的主要器官，因此旗叶大小对小麦的最终产量具有很大的影响。旗叶长是一种重要的农艺性状，既是小麦株型的重要构成因素之一，也是植物光合作用的主要器官，在小麦中对产量潜力起着重要作用。在灌浆期，种子的有机物一半是由旗叶提供，直接影响小麦的产量。此外，旗叶决定了小麦的冠层结构，它影响开花时间，光照量，光合作用，种子灌浆，并最终影响每株植物的籽粒产量。
小麦产量性状是复杂的数量性状，受多个数量性状基因位点(Quantitativetrait locus，QTL)控制，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高的特性，所以在选育过程中，传统的育种方法存在时间长、消费大、成本高、成果小的问题。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。
KASP是由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)(http://www.lgcgenomics.com)研发的竞争性等位基因特异性PCR技术(Kompetitive AlleleSpecific PCR,KASP)具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及In Del位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。
此前部分学者对旗叶长进行了QTL定位，发现与之相关的QTL在小麦中广泛存在，并且分布在小麦的各个染色体上。然而目前与小麦旗叶长性状相关且可用于实际分子育种的紧密连锁的分子标记却并不多。因此研究获得有关旗叶长的QTL或基因，利用分子生物学技术，选择合适旗叶长植株，进而提高作物光合作用，最终达到选育增产小麦新品种的目的，在小麦育种工作中意义重大。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种与小麦旗叶长QTL QFll-2B连锁的KASP分子标记及其应用，本申请公开的分子标记KASP-Fll-sau1与旗叶长QTL QFLL-2B极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高不同环境下较长旗叶小麦品种的选择鉴定效率，且成功率高。
基于以上目的，申请人利用旗叶较长的小麦品种‘SY95-71’为父本，以小麦品系‘20828’为母本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，一直到F7代，获得含有128个系的重组自交系，构成遗传作图群体。对重组自交系群体旗叶表型鉴定，提取亲本‘20828’、‘SY95-71’和重组自交系群体植株DNA，本研究使用小麦55K SNP芯片来定位旗叶长QTL。小麦55K SNP芯片是在小麦660K SNP芯片的基础上开发的一款经济型中密度SNP芯片。芯片包含55，000个左右的小麦SNP标记，均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有2，600个标记，标记间的平均遗传距离约为0.1cM，平均物理距离小于300Kb，适合于一般的种质资源多样性分析、遗传作图与新基因发掘、比较基因组分析、品种注册与鉴别(指纹分析)。
根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的旗叶长表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2020年11个生态点及11个生态点旗叶长的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiased prediction)值来检测QTL，在2B染色体长臂上的3.9cM区间定位出稳定表达的小麦旗叶长主效QTL QFLL-2B，对侧翼标记进行物理定位筛选位于区间内的基因，共筛选获得27个基因，并对部分基因在亲本‘20828’和‘SY95-71’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，共设计了10对共30条KASP引物(表1)，最终得到标记KASP-Fll-sau1与旗叶长QTL QFLL-2B紧密连锁。
本发明所述的小麦旗叶长QTL QFLL-2B，来自父本‘SY95-71’，该QTL位于小麦染色体2B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为634.4Mbp-663.3Mbp。本发明提供了上述小麦旗叶长QTL QFLL-2B在调控小麦旗叶性状中的应用。所述小麦旗叶长QTL QFLL-2B显著增加小麦旗叶长度，平均LOD值为15.9，解释约8％–54％的表型变异。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种与QTL QFLL-2B连锁的KASP-Fll-sau1分子标记在调控小麦旗叶长中的应用。
一种与QTL QFLL-2B连锁的KASP-Fll-sau1分子标记，分子标记为SNP分子标记，多态性为G/T，其与小麦旗叶长QTL QFLL-2B共定位于小麦2B染色体长臂上，且位于QTL QFLL-2B区间内。一种引物组合物，包括用于对KASP-Fll-sau1分子标记进行扩增的两条特异性引物和一条通用引物；引物具体序列如SEQ ID NO.1～3所示。
进一步地，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’端分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’端分别添加不同的荧光修饰基团。
进一步地，荧光修饰基团包括但不限于FIFC、FAM、TET、HEX、JOE、TAMRA、BHQ。
上述分子标记或引物组合物在作物分子育种、培育转基因小麦或小麦种质资源改良中的应用。
上述分子标记或引物组合物在在筛选具有合适旗叶长的小麦品种或品系中的应用。
上述分子标记在培育合适旗叶长的小麦或高产小麦中的应用。
上述分子标记在小麦旗叶长基因遗传分析和精细定位中的应用。
一种筛选含有旗叶长QTL QFLL-2B小麦植株的方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求3所述的引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型；
所述引物组合物中，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’分别添加不同的荧光修饰基团，将能够读取到SEQ ID NO.2所标记的荧光基团的植株鉴定为含有小麦旗叶长QTL QFLL-2B的植株。
具体地，在本发明的一个实施例中，上述的应用，包括如下步骤：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增分子标记KASP-Fll-sau1的引物，在仪器CFX96 Real-Time System，进行PCR扩增反应并读取荧光值；
3)检测PCR扩增产物荧光，如果能够读取FAM荧光，则待测植株为具有较长旗叶性状的小麦资源。
进一步地，荧光定量PCR的反应体系为：5μL Master Mix、1.4μL混合引物、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白；
混合引物由引物SEQ ID No：1、2和3均按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL、120μL和300μL，并添加460μL ddH2O进行混合后作为混合引物；
荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
一种小麦全基因组芯片，包括上述分子标记.
上述小麦旗叶长QTL QFLL-2B在调控小麦旗叶长性状中的应用。
一种试剂盒，包括上述分子标记，和/或引物组合物。
本发明公开了位于小麦2B染色体上的与小麦旗叶长连锁的分子标记KASP-Fll-sau1，该分子标记是小麦2B染色体长臂上旗叶长QTL QFLL-2B的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦2B染色体上的旗叶长QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记KASP-Fll-sau1与小麦2B上的旗叶长QTLQFLL-2B紧密连锁，可用来对小麦旗叶长这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰较短旗叶的植株，提高育种工作效率，并为小麦旗叶长基因的研究提供基础。
本发明的有益效果为：
1、本发明首次公开了来自小麦‘SY95-71’的旗叶长QTL QFLL-2B，位于小麦2B染色体长臂上，显著增加小麦旗叶长。该QTL在小麦产量(调控旗叶长)育种中具有较高的利用价值。
2、本发明公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘SY95-71’的旗叶长QTLQFLL-2B的分子标记KASP-Fll-sau1，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
3、本发明公开的分子标记KASP-Fll-sau1与旗叶长QTL QFLL-2B极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可显著提高适应不同环境的小麦较长旗叶品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中小麦旗叶长QTL QFLL-2B在2B染色体上的定位。
图2为本发明实施例1中‘20828’בSY95-71’的重组自交系株系植株分子标记KASP-Fll-sau1检测的荧光读值结果；其中，FAM(橙色圆形，‘SY95-71’)荧光为有较长旗叶的株系，HAX(蓝色正方形，‘20828’)荧光为较短旗叶株系；绿色三角形荧光为杂合株系；黑色菱形荧光为空白对照。
图3为本发明实施例2中小麦‘S849-8’×小麦品种‘SY95-71’的重组自交系株系植株分子标记KASP-Fll-sau1检测的荧光读值结果；其中，FAM(橙色圆形，‘SY95-71’)荧光为有较长旗叶的株系，HAX(蓝色正方形，‘S849-8’)荧光为较短旗叶株系；黑色菱形荧光为空白对照。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所兰秀锦教授种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1小麦旗叶长QTLQFLL-2B及其分子标记KASP-Fll-sau1的获得
(1)利用小麦品系‘20828’为母本，以小麦品种‘SY95-71’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，一直到F7代，获得含有128个系的重组自交系，构成遗传作图群体。
(2)重组自交系群体旗叶长表型鉴定：小麦成熟期对重组自交系的旗叶长进行分析鉴定，去除每行两端的单株，分别收取五个长势一致的单株，计算旗叶长，并得出平均值，代表该株系的旗叶长。
(3)55K SNP芯片分析
a)DNA提取：用CTAB法提取亲本‘20828’、‘SY95-71’和重组自交系群体植株DNA。
b)使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本研究中双亲和作图群体的基因型分析由北京博奥晶典生物技术有限公司(http://www.capitalbiotech.com)与贾继增课题组合作开发的55K SNP芯片完成。
c)连锁图谱的构建：根据55K SNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的旗叶长表型数据，用QTL IciMapping 4.0中的完备区间作图法(InclusiveComposite Interval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2017-2020年共11个生态点及11个生态点旗叶长的BLUP(最佳线性无偏预测，best linear unbiasedprediction)值来检测QTL，定位出小麦旗叶长QTL QFLL-2B，并计算QTL QFLL-2B的位置和分子标记之间的遗传距离。
d)旗叶位点的比较以及分子标记的获得：前人报道与旗叶相关的QTL或基因较多。Kaiye Liu等人利用半野生小麦“藏1817”和普通小麦“宁冬3331”组合的含有213个株系的RIL群体定位到7个控制旗叶长QTL位点，分别位于2B、3A、4B和5A染色体上，单个位点表型变异的解释率为4.62％-12.11％；Waseem Hussain等人基于基因型测序(GBS)技术对“Harry”(耐旱)与“Wesley”(干旱易感)两个品种组合的RIL群体对旗叶相关性状进行QTL定位，共定位到5个控制旗叶长QTL位点，分别位于2D、6A和7A染色体上，单个位点表型变异的解释率为7.83％-14.22％；Xiaoli Fan等人利用“科农9024”与“京411”两个亲本组合所衍生的含有188个株系的重组自交系为材料，进行旗叶相关的QTL定位，共定位到11个控制旗叶长QTL位点，分别位于1B、2B、4A、4B、5B和5D染色体上，单个位点表型变异的解释率为4.05％-13.14％。位于2B上的QTL很少且都与QFLL-2B的距离很远，这表明QFLL-2B很可能是一个新的稳定的QTL。
为了进一步密化图谱并获得与旗叶长QTL QFLL-2B紧密连锁的分子标记，利用55KSNP芯片数据定位结果对侧翼标记进行物理定位并筛选位于区间内的基因。开发获得高效的KASP分子标记，需要如下多个步骤：
(I)设计扩增特定小麦基因型目标同源染色体(2B)候选基因序列的引物。虽然目前已有六倍体小麦‘中国春’参考基因组，但是因为小麦进化过程中可能有染色体结构变异(Ma J,Stiller J,Wei Y,Zheng Y-L,Devos KM,
Figure BDA0002642423790000091
J,Liu C(2014)ExtensivePericentric Rearrangements in the Bread Wheat(Triticum aestivum L.)Genotype“Chinese Spring”Revealed from Chromosome Shotgun Sequence Data.Genome BiolEvol 6:3039-3048)，不同小麦基因型的基因序列结构和多态性位点差异可能较大，要高效、快速、低成本地获得特定小麦基因型的基因序列，最简单的方法便是同源序列克隆。而因为小麦具有三个部分同源染色体组，要分离获得特异于其中某个同源染色体上的序列具有很大难度(Bagge M,Xia X,Lübberstedt T(2007)Functional markers in wheat.CurrOpin Plant Biol10:211-216)，需要通过设计特异于某个染色体组上的引物。在熟练掌握比较基因组学技术、生物信息学技术的基础上，对六倍体小麦的供体二倍体亲本乌拉尔图小麦和节节麦、四倍体野生二粒小麦和六倍体‘中国春’等参考基因组进行序列截取、比对、分析，获得特异于某个染色体上的多态性位点，从而设计扩增目标区域的特异引物。在设计好引物后，需依靠比较基因组学技术对引物特异性、退火温度、扩增长度等进一步分析，从而确定引物的可用性。
(II)利用特异引物对目标小麦基因型进行扩增。在进行扩增时，需要凭借熟练的分子生物学技术对扩增条件进行优化，进一步克隆测序。以获得目标区域的基因序列。
(III)目标同源染色体候选基因序列多态性位点的获得。在获得两个亲本候选基因序列后，需要进一步对序列进行详细分析，检测是否有多态性位点，如果没有，则需要重新回到第I步，选择其他可能的候选区域进行分离克隆。
(IV)多态性位点上下游KASP引物的设计。在获得多态性位点之后，需要设计KASP特异引物。由如前所述，小麦为异源六倍体植物，则仍然要凭借熟练的生物信息学技术对ABD染色体序列进行分析，从而获得特异于目标染色体的KASP引物。
(V)KASP引物扩增条件的优化。引物合成之后，需要凭借经验进一步对引物扩增条件进行调试优化，以便能达到在亲本之间能够显著区分的效果。
综上所述，虽然KASP标记技术已经广泛应用于二倍体物种，但是要想在六倍体小麦中获得高效的KASP标记时，对本领域技术人员而言绝非易事。
最终经过多次克隆测序，引物设计和扩增，共设计KASP引物10对(表1)，最终得到标记KASP-Fll-sau1与旗叶长QTL QFLL-2B紧密连锁。
表1 10对KASP引物序列
Figure BDA0002642423790000101
Figure BDA0002642423790000111
Figure BDA0002642423790000121
e)进行分析。设计的10对KASP引物中最终得到了1个分子标记KASP-Fll-sau1，其与旗叶长QTL QFLL-2B紧密连锁。结果见图1，图2。
实施例2分子标记KASP-Fll-sau1在选择控制旗叶长QTLQFLL-2B上的应用
(1)利用较短旗叶的普通小麦品系‘S849-8’为母本，较长旗叶的普通小麦品系‘SY95-71’为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择70个株系。
(2)对所获得的70个株系进行KASP-Fll-sau1标记检测，具体方法为：提取70个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-Fll-sau1的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述引物为：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTATCCTATGGAGTTGGAAAG-3’(SEQ ID No.1)
HEX标签上引物：(波浪线部分为HEX标签序列)
Figure BDA0002642423790000122
通用下游引物：5’-CAATGTCATCAACTAATGGT-3’(SEQ ID No.3)
上述PCR扩增的扩增体系为：5μL Master Mix、三条引物SEQ ID No：1、2和3按照10ng/μL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。
上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
荧光读值结果(见图3)，将检测到与‘SY95-71’一致的FAM(橙色)荧光的植株基因型记为A，为较长旗叶型株系，同‘S849-8’一样表现为HAX(蓝色)荧光的植株基因型记为B，为较短旗叶型株系。各个株系基因型与旗叶长田间表型值如表2所示。与含有旗叶长QTLQFLL-2B的‘SY95-71’类型相同的植株平均旗叶长为27.24，极显著高于与‘S849-8’类型的植株旗叶长(平均24.09)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的旗叶长QTL QFLL-2B确实有显著增加旗叶长的作用；同时本发明的分子标记KASP-Fll-sau1可以用与跟踪鉴定旗叶长QTL QFLL-2B。
表2‘S849-8’בSY95-71’重组自交系KASP-Fll-sau1基因型与表型对应结果
Figure BDA0002642423790000131
Figure BDA0002642423790000141
Figure BDA0002642423790000151
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种与小麦旗叶长QTL QFll-2B连锁的KASP分子标记及其应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc ttatcctatg gagttggaaa g 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat ttatcctatg gagttggaaa t 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatgtcatc aactaatggt 20
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc ttatgccaat gtcttgcact a 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat ttatgccaat gtcttgcact g 41
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccagacccg tacaacgcca 20
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc taacaagtaa atgacgatca c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat taacaagtaa atgacgatca t 41
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagtgatca ataggggaaa 20
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tgccgatttt gggttcgcat a 41
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tgccgatttt gggttcgcat c 41
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cggaggggaa aagaaatttg 20
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc taaggtgagc cactcgcatg c 41
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat taaggtgagc cactcgcatg g 41
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tatgggtgtg gacgaattgg 20
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc ttcacagagg gagagattaa c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat ttcacagagg gagagattaa g 41
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaggcaggag gacgaggtga 20
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tttcttgggc tcagctgcaa c 41
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tttcttgggc tcagctgcaa t 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atagtccata tcaactatac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tgtcccgagt ggaagaccaa g 41
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tgtcccgagt ggaagaccaa t 41
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttggttcaat gtcgttcacg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc ttatttcaag tcatagttca c 41
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaggtcgga gtcaacggat ttatttcaag tcatagttca t 41
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgtataact ccattcaatt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc ttccttaacc gctgcagtca c 41
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat ttccttaacc gctgcagtca t 41
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
attggagcac tgtcagagtt 20

Claims (7)

1.一种与QTL QFLL-2B连锁的KASP-Fll-sau1分子标记，其特征在于，所述KASP-Fll- sau1分子标记为SNP分子标记，多态性为G/T，其与小麦旗叶长QTL QFLL-2B共定位于小麦2B染色体长臂上，且位于QTL QFLL-2B区间内；所述KASP-Fll-sau1分子标记的扩增引物如SEQID NO.1~3所示。
2.一种引物组合物，其特征在于，包括用于对KASP-Fll-sau1分子标记进行扩增的两条特异性引物和一条通用引物；引物具体序列如SEQ ID NO.1~3所示。
3.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合物在筛选具有合适旗叶长的小麦品种或品系中的应用。
4.权利要求1所述的分子标记在小麦旗叶长基因遗传分析和精细定位中的应用。
5.一种筛选含有旗叶长QTL QFLL-2B的小麦株系方法，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的引物组合物对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型；
所述引物组合物中，SEQ ID NO.1-2所示的引物序列在5’分别添加不同的荧光修饰基团，将能够读取到SEQ ID NO.1所标记的荧光基团的植株鉴定为含有小麦旗叶长QTL QFLL- 2B的植株。
6.根据权利要求5所述的筛选含有旗叶长QTL QFLL-2B的小麦株系的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：5µL Master Mix、1.4µL混合引物、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10µL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白；
所述混合引物由引物SEQ ID No：1、2和3均按照10ng/µL的浓度，分别加入120µL、120µL和300µL，并添加460µL ddH2O进行混合后作为混合引物；
所述荧光定量PCR的反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组合物。
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