CN109913574A - 与小麦旗叶宽度主效qtl紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记及应用。本发明还公开了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦旗叶宽度性状的引物对，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示5BID‑4引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。本发明所提供的小麦旗叶宽主效QTL的分子标记可用于检测小麦品种或品系中是否含有增加小麦旗叶宽的QTL，以便快速筛选出具有增加小麦旗叶宽的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦优异品种的选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。

Description

与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记及应用

技术领域

本发明属于小麦分子生物技术与育种应用技术领域，具体地说，涉及一种与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记及应用。

背景技术

小麦作为全球重要的粮食作物之一,提高小麦的产量是解决人类粮食需求的重要途径。旗叶是小麦生殖生长期的功能叶片，因细胞中叶绿体数目较多，与抽穗后小麦籽粒灌浆、籽粒产量关系密切。旗叶作为小麦生殖生长期的源器官，在小麦产量形成中起着决定性作用。经过以往小麦旗叶性状与产量性状的相关性分析，小麦旗叶宽度对小麦产量性状的影响明显高于旗叶长度和旗叶面积。因此挖掘控制与旗叶宽相关的优异等位基因，开发分子标记，进一步开展分子标记辅助选择育种，大大加快小麦优异品种的选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。

小麦旗叶宽度是受多基因控制的数量性状，遗传基础复杂，受环境影响较大。因此，对小麦旗叶的遗传研究比较困难。经典的遗传分析方法只能把控制数量性状的多个基因作为一个整体进行研究，难以有效地研究控制性状表达的基因的数目、基因在染色体上的位置、基因的效应及其作用方式。随着分子生物学和生物统计的发展，以分子标记遗传图谱和各种统计模型为基础的数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)作图技术，为研究数量性状遗传提供了有效的技术手段。利用QTL可检测出目标性状在染色体上的位置及效应以及与其它基因的关系。因此，不断丰富小麦旗叶宽度基因的多样性，并通过分子标记技术，研究和开发有关小麦旗叶宽度的基因，在育种工作中具有极其重要的意义。

迄今已发现小麦21条染色体上均有旗叶宽度QTL，通过数量性状基因位点(Quantitative trait locus，QTL)分析，利用多个作图群体在5B染色体检测到与小麦旗叶宽度有关的QTL位点(Keller et al.,Theoretical and Applied Genetics,1999,98(6/7):903-912；Lian et al.,Journal of Triticeae Crops.,36(6):689-698,2016；Zhao etal.Euphytica.,214:209,2018；Liu et al.,Mol Breed 38:11，2018b)。目前，在5B染色体上有关旗叶宽度QTL的报道相对较少。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记及应用，通过获得的与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种或品系中是否具有增加小麦旗叶宽度的QTL，以加快小麦优异品种的选育进程。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示5BID-4引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。

可选地，所述5BID-4引物对由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成，SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列均为单链DNA分子。

可选地，所述小麦为以小麦京411为亲本，通过采用常规杂交并繁衍选育至F2代以上的京411小麦衍生品种或品系。

本发明还公开了一种鉴定或辅助鉴定小麦品种或品系的方法，包括如下步骤：

S1、以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述的5BID-4引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

S2、将上述PCR产物在6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离后，如能够分别获得扩增产物的分子量为303bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为在该基因位点上具有增加小麦旗叶宽基因的小麦品种或品系；否则，该小麦品种或品系属于在该位点为不具有增加小麦旗叶宽基因的小麦品种或品系。

可选地，所述步骤S1中的PCR扩增体系为：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的2×Taq PCR StarMix，2μl的ddH₂O。

可选地，所述步骤S1中的PCR扩增程序如下：95℃变性5min；34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存。

可选地，所述小麦品种或品系为以小麦科农9204为亲本，通过采用常规杂交并繁衍选育至F2代以上的科农小麦衍生品种或品系。

可选地，所述6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。

可选地，与小麦旗叶宽性状相关的分子标记，其特征在于，为以小麦基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增所得的DNA片段，为5BID-4，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3所示。

本发明还公开了一种上述的引物对或分子标记在如下任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定小麦旗叶宽性状；

(2)小麦育种。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明公开的与小麦旗叶宽度紧密连锁的分子标记5BID-4充分体现了小麦品种或品系的旗叶宽度主效QTL，通过分子标记对小麦品种或品系PCR扩增，可以快捷地对小麦品种或品系是否具有旗叶宽度的QTL进行判断，以便快速筛选出具有增加小麦旗叶宽度的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦优异品种的选育进程，为小麦产量性状分子育种提供优异基因资源和选择工具。

2)将本发明提供的与小麦旗叶宽度紧密连锁的分子标记方法用于小麦育种，只需检测这些标记的扩增条带特性，可以判断旗叶宽主效基因位点的增效变异存在与否，来预测小麦的旗叶宽度表型，用于指导小麦数量性状改良的育种工作，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了小麦品种或品系的选择效率和质量，直接实现了目标基因在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定，为小麦育种开拓更多优良的旗叶基因遗传资源。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明小麦品种科农9204的旗叶宽主效QTL在染色体5BL上的作图区间；图中：空心长方形代表染色体，左侧是分子标记的名称，右侧数字是标记在染色体上的位置，单位是cM；图中共有两种分子标记，5BID-4为InDel标记，其余为STS标记，下划线部分为5BID-4分子标记；染色体右方黑色的长方形分别表示旗叶宽在各个环境下的QTL作图区间；

图2是本发明5BID-4在KJ-RIL家系扩增结果；M表示50bp DNA Ladder；K表示小麦品种科农9204扩增结果，J为小麦品种京411扩增结果；数字1-38表示部分KJ-RIL群体扩增结果；

图3是本发明在8个环境下利用MapQTL 6.0检测到的LOD峰值；

图4是本发明在8个环境下利用IciMapping 4.1检测到的LOD峰值；

图5是本发明8个环境下188个KJ-RIL家系基于5BID-4的旗叶宽、穗粒重、穗粒数单标记分析：AA等位基因来自科农9204，BB等位基因来自京411；**表示P<0.01差异极显著，*表示P<0.05差异显著。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明所述小麦品种科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037；京411为审定品种，于1991年通过北京市品种审定；1992年通过天津市、山西省和全国品种审定；京411可以从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。

本发明中2×Taq PCR StarMix为预混的含有优化浓度的高纯度Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、反应缓冲液和优化剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，本产品品牌为TIANGEN，由天根生化科技(北京)有限公司提供。

本发明中2×Taq PCR StarMix为预混的含有优化浓度的高纯度Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、反应缓冲液和优化剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，本产品品牌为TIANGEN，由天根生化科技(北京)有限公司提供。

实施例1与小麦旗叶宽主效QTL紧密连锁的分子标记

采用5BID-4标记引物

上游引物序列：GTTCAACACCTTCTTCCCTG(如SEQ ID NO:1所述)、

下游引物序列：GATTGTATCGTAGCTGCTCGA(如SEQ ID NO:2所述)，用5BID-4标记引物对小麦品种科农9204的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的2×Taq PCR StarMix，2μl的ddH₂O；采用普通扩增程序扩增：95℃变性5min；34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存；扩增产物在6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离，银染法，获得对应的扩增产物的分子量为303bp(如SEQ ID NO:3所述)。

PCR程序采用的型号为：T100^TMThermal Cycler，本发明中所有的PCR扩增均采用该型号PCR仪，该PCR仪不限制发明内容。

实施例2与小麦旗叶宽主效QTL紧密连锁的分子标记的筛选方法

具体包括以下步骤：

(i)以旗叶宽度较大的小麦品种科农9204为母本、以旗叶宽度较小的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交产生的F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F6代RIL群体；

(ii)用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化铵法(Vander Beek et al.,1992)提取上述RIL群体各株系的DNA，采用InDel标记、基于表达序列标签PCR扩增标记(STS标记)对所述家系进行基因型分析，获得所述RIL群体的基因型值材料(图1)。InDel(insertion-deletion)标记即插入缺失标记，指的是根据两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计扩增这些插入缺失位点的PCR引物序列标记位点(sequencetag site,STS)又称为序列靶位点,进行PCR扩增，使其与基因组DNA序列中的特定位点结合,从而扩增出基因组中的某段区域；

改良的CTAB法提取叶片DNA的步骤包括：取钢珠和0.2g左右的新鲜叶片放入2.0ml离心管中，快速放在液氮中，摇晃磨成细粉；加CTAB提取液0.8ml，摇匀，65℃水浴30～60min，其间不时反转2-4次摇匀；离心管放置于室温冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)或加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，剧烈摇晃1min混匀；8000rpm离心10min；吸上清600ul至另一1.5ml离心管中；加入0.8倍体积预冷的异丙醇(-20°预冷)沉淀DNA；12000rpm离心6min；倒掉上清，加入适量70％乙醇洗涤沉淀1-2次；离心管倾斜放置于通风橱吹干，待无酒精味，加400ul TE溶解，放-20℃冰箱长期保存。

用5BID-4标记引物对KJ-RIL群体的DNA进行PCR扩增，其PCR扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的2×Taq PCR StarMix，2μl的ddH₂O；采用普通扩增程序扩增：95℃变性5min；34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存；

扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度6.0％，电泳缓冲液为1×TBE，147V恒压电泳2小时。凝胶制备及电泳过程：将玻璃板水平放置，平板放下边，凹板放上面，中间放上封条，试插梳子是否合适；小板每板需50ml的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，加20ul的TEMED和200ul 10％的过硫酸铵，搅拌均匀；用玻璃棒引流灌胶，若有气泡，及时敲打玻璃板将其赶出，灌胶完毕，将梳子插上；约10分钟后，观看凝胶是否凝固；拔下梳子，用去离子水冲洗胶孔，看胶孔是否有残胶，若有，用注射器将其吸出；将凝固好的玻璃板放置于电泳槽，凹槽朝里，用夹子夹住。上下各加满1×TBE；点样后电泳2个小时。进行硝酸银染色步骤：电泳完毕，取下胶块在固定液中固定3min；用去离子水快速冲洗2–3次，每次30–40s；于银染液中染色5–7min后，用水快速冲洗(10s左右，不超过20s)；放入显影液中显影至扩增带出现(一般以Marker出现、颜色不再加深时止)；放入去离子水中停影，拍照，记录带型，得到非变性聚丙烯酰胺凝胶图片(图2)。由此进行结果分析，小麦品种科农9204扩增片段大小为300bp,小麦品种京411扩增片段大小为370bp，KJ-RIL共188个群体中带型与与科农9204相同的为95个，京411相同的有93个。

(iii)利用JOINMAP 2.0作图软件，将获得的RIL群体基因型资料构建具有119566个标记位点的小麦分子标记遗传连锁图谱，以LOD≥2.5为标准；119566个标记中包含119001个SNP标记，287个DArTs标记、153个g-SSR标记、50个e-SSR标记、17个STS标记、45个SRAPs标记、5个ISSRs标记、7个功能性PCR标记和1个形态标记；

(iv)将RIL群体进行了8个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的旗叶宽度，其中8个环境即：2012–2013、2013–2014连续2年在中国科学院栾城农业生态系统试验站(T1及T2：37°53’N，114°41’E)、2015-2016年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场(T3：40°06’N，116°24’E)及2017-2018年在河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地(T4：35°27’N，113°48’E)种植，每试验环境分高氮(High nitrogen，HN)和低氮(Low nitrogen，LN)两个处理；

其中LN处理，全年不施肥；而HN处理，每年播种前施300kg·hm-2磷酸二胺和225kg·hm-2尿素作为底肥，拔节期施150kg·hm-2尿素追肥；

其中小麦种植方法：每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5cm，行距25cm，正常生长及收获；旗叶宽度测定方法：方法一是在小麦孕穗期间在试验田用精确度为0.01的直尺测量旗叶宽度，方法二是从试验田取旗叶叶片，用万深LA-S系列植物图像分析系统-叶分析软件扫描得出旗叶宽度。

(v)利用JOINMAP 2.0软件构建连锁图谱。将8个单一环境中直接调查得到的旗叶宽表型值和旗叶面积表型值，按照IciMapping v4.1的BIP模块格式要求整理后，进行加性QTL定位。以1cM为步进区间，进行1000次置换检验，确定LOD阈值；

(vi)利用KJ-RIL遗传群体，在石家庄、北京、河南新乡三地高氮肥区和低氮肥区共3年8个环境条件下开展了旗叶相关性状的QTL定位，在5B染色体上的Ax-112288026–Ax-110407281区间内检测到1个控制旗叶宽的主效QTL-QFlw-5B。MapQTL 6.0、IciMapping 4.1在5BL染色体区段检测旗叶宽、旗叶面积多环境稳定表达的主效QTL-QFlw-5B，LOD峰值出现在5BL染色体的Ax-112288026–Ax-110407281的57.6–72.8cM遗传距离范围内，LOD值为2.81–8.81，能够解释6.6–19.8％的旗叶宽、旗叶面积表型变异，来自科农9204的等位基因增加旗叶宽0.04–0.07cm，增加旗叶面积0.70–1.34cm²(表1，图3-图4)。

表1 MapQTL 6.0、IciMapping 4.1基于高密度遗传图谱7个环境下QFlw-5B结果

(vii)利用5BID-4作为QFlw-5B紧密连锁的分子标记，进行188个RIL家系基因型分型，分析QFlw-5B对产量相关性状的遗传效应，结果表明来自科农9204的等位基因相对于京411等位基因在增加旗叶宽和旗叶面积的同时，能够增加穗粒数和穗粒重，该结果在8个环境中均被重复证明(图5)。

通过QTL分析，MapQTL 6.0、IciMapping 4.1均在5BL染色体区段检测到旗叶宽、旗叶面积多环境稳定表达的主效QTL-QFlw-5B，LOD峰值出现在5BL染色体的Ax-112288026–Ax-110407281的57.6–72.8cM遗传距离范围内，LOD值为2.81–8.81，能够解释6.6–19.8％的旗叶宽、旗叶面积表型变异，来自科农9204的等位基因增加旗叶宽0.04–0.07cm，增加旗叶面积0.70–1.34cm²；科农9204的等位基因相对于京411等位基因在增加旗叶宽和旗叶面积的同时，能够增加穗粒数和穗粒重，该结果在8个环境中均被重复证明。上述结果证明分子标记5BID-4为与小麦旗叶宽紧密连锁的分子标记，该分子标记可以很有效地用于小麦株型分子标记辅助选择育种程序之中。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 与小麦旗叶宽度主效QTL紧密连锁的分子标记及应用

<130> 2019

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

gttcaacacc ttcttccctg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gattgtatcg tagctgctcg a 21

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 小麦(wheat)

<400> 3

gttcaacacc ttcttccctg tgtaacaaaa acaagcgaga gaacatccca gccaaaagac 60

agaaacaaag aaagaagccc agctgaaatt aacaaacaaa taaacaagca gaaaagttca 120

gaagtcatgc ggatacagcc caacaggcgc cacgctagga atcaaacatg cggatacggc 180

ccatcaggcg caatgccagg aaacaggcct cgactgagac ctagacaaac ccaaaaatta 240

aagaagaaca gcgtaaaaac ggtgggcttg cgtatattgt cgagcagcta cgatacaatc 300

Claims (10)

1.用于鉴定或辅助鉴定小麦旗叶宽度性状的引物对，其特征在于，为能够扩增得到如下DNA片段的引物对：所述DNA片段是以小麦基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示5BID-4引物对进行PCR扩增所得的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述5BID-4引物对由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成，SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列均为单链DNA分子。

3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述小麦为以小麦京411为亲本，通过采用常规杂交并繁衍选育至F2代以上的京411小麦衍生品种或品系。

4.一种鉴定或辅助鉴定小麦品种或品系的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1或2所述的5BID-4引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

S2、将上述PCR产物在6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压147V电泳分离后，如能够分别获得扩增产物的分子量为303bp的扩增片段，则该小麦品种或品系为在该基因位点上具有增加小麦旗叶宽基因的小麦品种或品系；否则，该小麦品种或品系属于在该位点为不具有增加小麦旗叶宽基因的小麦品种或品系。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中的PCR扩增体系为：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的2×Taq PCR StarMix，2μl的ddH₂O。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中的PCR扩增程序如下：95℃变性5min；34个循环的普通PCR程序：95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min；72℃延伸5min；结束扩增，12℃保存。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述小麦品种或品系为以小麦科农9204为亲本，通过采用常规杂交并繁衍选育至F2代以上的科农小麦衍生品种或品系。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述6.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，与小麦旗叶宽性状相关的分子标记，其特征在于，为以小麦基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物对进行PCR扩增所得的DNA片段，为5BID-4，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3所示。

10.权利要求1或2所述的引物对或权利要求9所述的分子标记在如下任一中的应用：

(1)鉴定或辅助鉴定小麦旗叶宽性状；

(2)小麦育种。