CN109652582A - 用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的snp分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记及其应用，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子标记SNP1、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的分子标记SNP2、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的分子标记SNP3、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的分子标记SNP4、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的分子标记SNP5和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的分子标记SNP6；该SNP分子标记为简单、快速、高效准确鉴定‘沪玉糯3号’的真实性奠定技术基础，同时为‘沪玉糯3号’基于分子生物学技术的深入研究提供了序列和SNP位点信息。

Description

用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物鉴别技术领域，具体涉及用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记及其应用。
背景技术
糯玉米(Zea mays L.var.ceratina Kulesh)是玉米属的一个亚种，富含支链淀粉、以及蛋白质、赖氨酸、色氨酸等营养物质、适口性良好，具有宝贵的应用价值和广泛的用途，是广受欢迎的食品和工业原料，具有较高的经济价值。
近年来，我国种业市场迅速发展的同时，也随之出现了制售假劣种子、种子混杂及套牌侵权等违法行为，造成了种子市场的混乱，严重侵害了农民的利益，影响了我国种业的健康可持续发展。因此，加强对玉米杂交种的真实性和纯度监管显得非常必要。
传统的表型鉴定工作量大，周期长，受环境影响大，且受季节限制，不利于种子营销工作的开展；而同工酶和种子贮藏蛋白鉴定多态率低，重复性差，以上方法均已无法满足玉米品种真实性鉴定的需要。
随着分子生物学技术的日益成熟，利用分子生物学技术从基因组水平上对糯玉米种质资源进行基因型分析，开发可用于特异性分析的分子标记，对提高糯玉米种质资源的利用效率、发掘优异基因、促进分子标记辅助选择育种技术的应用和发展具有重要意义。
SNP(single nucleotide polymorphism)是指由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP分子标记具有分布广泛、遗传稳定、可高通量自动化检测等优势。SNP在玉米基因组中分布广泛，平均约每60.8bp就存在一个SNP，这为玉米高通量基因型鉴定、遗传多样性分析、高密度遗传图谱构建、群体遗传结构分析以及连锁不平衡程度估计等研究中SNP标记的开发和应用提供了遗传学基础。
近年来，SNP标记作为第三代分子标记技术已在玉米研究中广泛应用于遗传多样性分析、遗传基础分析、重要性状的基因定位、辅助育种以及品种鉴定等领域。目前，主要利用SNP芯片技术和测序技术对SNP位点进行大规模、高通量的基因型数据分析。SNP芯片平台由于标记位点不能自由组合，灵活性稍差；而全基因组测序技术由于分析数据量大，存在着检测费用昂贵的问题。
RAD(Restriction Association site DNA)技术是一种广泛应用的简化基因组测序技术，其通过限制性内切酶降低测序物种基因组复杂程度、反映部分基因组序列结构信息。2b-RAD(type IIB endonucleases RAD)是基于IIB型限制性内切酶的RAD测序技术，具有文库构建简单快速、重复性和标签代表性高、成本低廉、基于混合泊松分布模型的denovoSNP分型新算法(iML)使假阳性率得到较大幅度降低等优势。
目前，2b-RAD测序技术已被应用于对金枪鱼(Thunnus albacares)、扇贝(Patinopecten yessoensis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、小麦(Triticumaestivum L.)、玉米(Zea mays L.)等物种的基因分型、高精度连锁图谱构建、群体遗传结构分析等研究中都得到了应用。
相比之下，在玉米(Zea mays L.)中2b-RAD测序技术应用得还较少，玉米中不同亲缘关系的自交系间基因组组成和结构差异都很大，而对所有供试玉米材料进场重测序的成本很高；且由于玉米基因中的非编码高度重复序列的比例很大，也造成重测序后的组装难度大。
‘沪玉糯3号’是以‘申W48’为母本、‘申W22’为父本选育的优质、高产鲜食糯玉米品种，已于2002年通过上海市品种审定。‘沪玉糯3号’产量较高，产量较对照‘苏玉糯1号’提高22.7％；外观品质好，无秃顶，锥型大果穗，排列整齐，颜色纯白，大粒，轴细，皮薄，糯性优良，口感香甜，适口性佳，风味独特，为大穗大粒型优质糯玉米品种，适用于鲜食和加工，目前在我国长三角地区推广面积较广，市场影响力大。
然而，目前关于‘沪玉糯3号’品种特异性、遗传多样性及优异基因挖掘等分子生物学研究尚未展开。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记及其应用，为简单、快速、高效准确鉴定‘沪玉糯3号’的真实性奠定技术基础，同时，为‘沪玉糯3号’基于分子生物学技术的深入研究提供了序列和SNP位点信息。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一组用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记，其包括：位于沪玉糯3号糯玉米1号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子标记SNP1、位于沪玉糯3号糯玉米3号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的分子标记SNP2、位于沪玉糯3号糯玉米6号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的分子标记SNP3、位于沪玉糯3号糯玉米8号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的分子标记SNP4、位于沪玉糯3号糯玉米9号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的分子标记SNP5和/或位于沪玉糯3号糯玉米10号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的分子标记SNP6。
本发明所述分子标记SNP1上有位于玉米1号染色体第301098295位的SNP位点，碱基为G；所述分子标记SNP2上有位于玉米3号染色体第227351990位的SNP位点，碱基为C；所述分子标记SNP3上有位于玉米6号染色体第161291771位的SNP位点，碱基为T；所述分子标记SNP4上有位于玉米8号染色体第166765556位的SNP位点，碱基为A；所述分子标记SNP5上有位于玉米9号染色体第8362277位的SNP位点，碱基为T；所述分子标记SNP6上有位于玉米10号染色体第104117476位的SNP位点，碱基为A。
本发明提供用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的特异引物对，包括分别对应于分子标记SNP1-SNP6的引物对组合1-6，每个引物对组合均含有两组引物对，其核苷酸序列如表1：
表1
其中，引物序列中带有下划线的碱基与分子标记SNP1-SNP6中的SNP位点相对应。
本发明提供所述SNP分子标记在鉴定沪玉糯3号糯玉米中的应用。
一种基于SNP分子标记的沪玉糯3号糯玉米品种真实性的鉴定方法，包括以下步骤：
1)根据所述SNP分子标记中SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP6的侧翼序列分别设计引物对组合1、引物对组合2、引物对组合3、引物对组合4、引物对组合5和引物对组合6，其中，每个引物对组合均含有两组引物对；
2)提取待鉴定糯玉米材料的基因组DNA；
3)根据步骤1)所述的引物对组合1-6分别对待鉴定材料的基因组DNA进行降落聚合酶链式扩增反应，获得扩增产物；
4)扩增产物多态性鉴定
对步骤3)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，获得扩增产物的SNP位点指纹图谱，根据SNP位点指纹图谱进行判定：若扩增产物的SNP位点指纹图谱结果与下述结果完全一致，则待鉴定材料为糯玉米品种‘沪玉糯3号’：
引物对组合1：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现271bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现290bp条带；
引物对组合2：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现278bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现297bp条带；
引物对组合3：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现240bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现259bp条带；
引物对组合4：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现288bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现307bp条带；
引物对组合5：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现262bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现281bp条带；
引物对组合6：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现255bp条带；
第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现274bp条带。
进一步，步骤3)中，所述降落聚合酶链式扩增反应的反应体系为10μL，各物质的终浓度为：基因组DNA 10μg·mL-1的，左右引物各2μmol·L-1，dNTPs 2.5mmol·L-1，MgCl22.5mmol·L-1，1×PCR buffer(Tris-HCl 10mmol·L-1，pH 8.5，KCl 50mmol·L-1和Taq酶0.5U。
又，步骤3)中，所述降落聚合酶链式扩增反应的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，66-67℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环依次降低1℃、速度0.1℃/s、共14个循环；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、22个循环；最后72℃延伸5min、4℃保存。
进一步，步骤4)中，扩增产物在3.5％的琼脂糖胶凝胶中进行电泳。
本发明利用6对引物对组合，对基于聚合酶链式扩增反应(TD-PCR)和琼脂糖凝胶电泳获得的指纹图谱进行分析，根据6对SNP分子标记的电泳带型，确定待测样品是否为‘沪玉糯3号’。
本发明利用2b-RAD测序技术对‘沪玉糯3号’及其亲本进行基因型分型，从分布于玉米10条染色体上的SNP位点中筛选在‘申W48’和‘申W22’表现为不同的纯合基因型，且在‘沪玉糯3号’中表现为‘申W22’和‘申W48’杂合基因型的SNP位点1317个。根据这1317个SNP位点在玉米B73参考基因组上的侧翼序列设计了19对AC-PCR引物对组合，对‘沪玉糯3号’进行基因型鉴定。
从上述19对AC-PCR引物对组合中筛选出9对引物对组合可在‘沪玉糯3号’及其亲本间扩增出稳定、清晰的差异条带，每对引物对组合在‘沪玉糯3号’中的扩增条带差异为19bp，且它们可在‘申W22’和‘申W48’间扩增出双亲互补带型。
再利用筛选出的9对AC-PCR引物对组合在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’等9个来自不同产区的糯玉米品种基因组DNA进行TD PCR扩增，筛选出6对引物对组合，可在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’和‘佳糥668’中扩增出与‘沪玉糯3号’中不同的条带的SNP分子标记，获得可用于‘沪玉糯3号’品种特异性鉴定的SNP分子标记SNP1-SNP6。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
利用本发明的SNP分子标记，以待鉴定品种的基因组DNA为模板，通过简单的TD-PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳，即可将单碱基水平的突变转换成扩增片段的大小差异，从而完成品种真实性鉴定。
利用本发明可在苗期完成对待测样品的鉴定，节省大量人力、物力、土地资源和时间；可从基因组水平上对样品进行鉴定，不受栽培措施和环境条件的影响，同时克服了田间表型鉴定带来的误差，重复性和稳定性较好；引物对组合SNP1、SNP3、SNP4、SNP5为共显性标记，能够将杂交种与亲本区分开。
利用本发明鉴定沪玉糯3号品种，检测时对DNA用量少，在8h内即可完成待测品种真实性鉴定，高效快速；可快速、准确检测‘沪玉糯3号’的品种真实性，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例2中引物对组合1的PCR扩增产物凝胶电泳图。
图2为本发明实施例2中引物对组合2的PCR扩增产物凝胶电泳图。
图3为本发明实施例2中引物对组合3的PCR扩增产物凝胶电泳图。
图4为本发明实施例2中引物对组合4的PCR扩增产物凝胶电泳图。
图5为本发明实施例2中引物对组合5的PCR扩增产物凝胶电泳图。
图6为本发明实施例2中引物对组合6的PCR扩增产物凝胶电泳图。
图1-6中，M为marker ladder，泳道1为marker ladder；泳道S1-1、S2-1、S3-1、S4-1、S5-1、S6-1中条带依次为引物对组合1-6中第1引物对的扩增片段电泳图谱；泳道S1-2、S2-2、S3-2、S4-2、S5-2、S6-2中条带依次为引物对组合1-6中第2引物对的扩增片段电泳图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
所述玉米6个SNP分子标记为‘沪玉糯3号’的杂合SNP位点；所述凝胶电泳分析所用Marker为50-500bp DNA ladder。
实施例1SNP分子标记的获得
对‘沪玉糯3号’及其亲本2b-RAD进行测序，获得SNP位点，从分布于玉米10条染色体上的SNP位点中筛选在‘申W48’和‘申W22’表现为不同的纯合基因型，且在‘沪玉糯3号’中表现为‘申W22’和‘申W48’杂合基因型的SNP位点1317个。
根据获得的1317个SNP位点，在玉米B73参考基因组上的侧翼序列设计了19对AC-PCR引物对组合对‘沪玉糯3号’进行基因型鉴定。
从19对AC-PCR引物对组合中筛选出9对引物对组合可在‘沪玉糯3号’及其亲本间扩增出稳定、清晰的差异条带，每对引物对组合在‘沪玉糯3号’中的扩增条带差异为19bp，且它们可在‘申W22’和‘申W48’间扩增出双亲互补带型。
利用筛选出的9对AC-PCR引物对组合在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’等9个来自不同产区的糯玉米品种基因组DNA进行TD PCR扩增，筛选出6对引物对组合，可在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’和‘佳糯668’中扩增出与‘沪玉糯3号’中不同的条带的SNP分子标记，获得可用于‘沪玉糯3号’品种特异性鉴定的SNP分子标记SNP1-SNP6，所述包括6个‘沪玉糯3号’的SNP位点序列的SNP分子标记SNP1-SNP6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-6所示。
所述分子标记SNP1上有位于玉米1号染色体第301098295位的SNP位点，碱基为G；所述分子标记SNP2上有位于玉米3号染色体第227351990位的SNP位点，碱基为C；所述分子标记SNP3上有位于玉米6号染色体第161291771位的SNP位点，碱基为T；所述分子标记SNP4上有位于玉米8号染色体第166765556位的SNP位点，碱基为A；所述分子标记SNP5上有位于玉米9号染色体第8362277位的SNP位点，碱基为T；所述分子标记SNP6上有位于玉米10号染色体第104117476位的SNP位点，碱基为A。
实施例2‘沪玉糯3号’的品种鉴定
利用本发明设计的引物对组合1-6分别对糯玉米品种‘沪玉糯3号’及其亲本‘申W48’和‘申W22’、糯玉米品种‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’等样品的基因组DNA进行PCR鉴定，具体过程如下：
1.提取基因组DNA
采用改良的CTAB法提取12份待测样品的基因组DNA。
2.引物设计
根据分子标记SNP1-SNP6中的SNP位点在参考基因组上的侧翼长序列设计AC-PCR引物，所述AC-PCR引物包括引物对组合1-6，每个引物对组合均分别包括两对引物对，具体引物序列见表1，其中，引物序列中带有下划线的碱基与分子标记SNP1-SNP6中的SNP位点相对应；
3.PCR扩增
分别利用6对引物对组合1-6，对待测样品的基因组DNA进行TD-PCR扩增。
其中，TD-PCR扩增体系为：采用10μl反应体系，包含10μg·mL-1基因组DNA，引物对中左、右引物各2μmol·L-1，2.5mmol·L-1dNTPs，2.5mmol·L-1MgCl2，1×PCR buffer(10mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.5，50mmol·L-1KCl)和0.5U Taq酶。
TD-PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环依次降低1℃、速度0.1℃/s、14个循环；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、22个循环；最后72℃延伸5min、4℃保存。
4.PCR产物鉴定
向步骤3)得到的扩增产物中加入2μL上样缓冲液，在80V恒定电压下，经3.5％琼脂糖凝胶电泳15～20min，利用凝胶成像系统拍照分析，12个糯玉米样品在不同位点的扩增指纹图谱如图1-6所示，由图1-6可见：
引物对组合1：在‘沪玉糯3号’第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)出现271bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道3)出现290bp条带；第1引物对在‘申W22’(泳道4)、以及第2引物对在‘申W48’(泳道7)中均有预期大小的片段条带(见表2)，如图1所示；第1引物对在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668’中均无扩增条带(泳道8，10，12，14，16，18，20，22，24)；而第2引物对可在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668’中扩增出预期大小的条带(泳道9，11，13，15，17，19，21，23，25)。
引物对组合2：在‘沪玉糯3号’第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)出现278bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道3)出现297bp条带；第1引物对在‘申W22’(泳道4)、以及第2引物对在‘申W48’(泳道7)中均有预期大小的片段条带(见表2)，如图2所示；引物对组合2在‘京科糯609’和‘天贵糯932’中扩增出预期大小的片段(泳道12，13，14，15)；在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668‘中扩增出与目标大小不同的条带(泳道8，9，10，11，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25)。
引物对组合3：在‘沪玉糯3号’第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)出现240bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道3)：出现259bp条带；第1引物对在‘申W22’(泳道4)、以及第2引物对在‘申W48’(泳道7)中均有预期大小的片段条带(见表2)，如图3所示；引物对组合2在‘申糯8号’和‘浙糯玉10号’中无扩增条带(泳道18，19，20，21)；引物对组合3在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668’中虽然有扩增条带，但条带大小与预期大小不同(泳道8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，22，23，24，25)。
引物对组合4：在‘沪玉糯3号’第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)出现288bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道3)出现307bp条带；第1引物对在‘申W22’(泳道4)、以及第2引物对在‘申W48’(泳道7)中均有预期大小的片段条带(见表2)，如图4所示；引物对组合4在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668’中均无预期大小扩增条带(泳道8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25)，但有非特异性扩增产物条带(泳道9，10，13，14，15，16，17，18，19，20，21，25)。
引物对组合5：在‘沪玉糯3号’第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)出现262bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道3)出现281bp条带；第1引物对在‘申W22’(泳道4)能扩增的出预期大小的电泳产物，在申W48(泳道6，7)中无扩增条带，如图5所示；引物对组合5在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668’中均无预期大小扩增条带(泳道8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25)，有非特异性扩增产物条带(泳道8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，20，22，24)。
引物对组合6：在‘沪玉糯3号’第1引物对的扩增产物指纹图谱(泳道2)出现255bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱(泳道3)出现274bp条带；引物对组合6在申W22(泳道4，5)，扩增得出预期大小的电泳产物；第2引物对在申W48(泳道7)有预期大小条带，如图6所示；引物对组合6在‘苏玉糯5号’、‘农科糯336’、‘京科糯609’、‘天贵糯932’、‘大玉糯2号’、‘申糯8号’、‘浙糯玉10号’、‘晋糯20号’及‘佳糯668’中均可扩增出条带，但它们与预期片段大小不同(泳道8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25)。
可见，上述6对引物对组合均能在‘沪玉糯3号’的不同位点上扩增出与预期大小相同的带型，各引物对组合中第1引物对的扩增产物条带比第2引物对中条带小19bp，‘沪玉糯3号’在6个位点均为杂合基因型，且与在其他来自不同地区的9份糯玉米品种的扩增条带均不相同。因此，本发明确定的SNP1-6分子标记，具有明显的品种特异性，可以将‘沪玉糯3号’与其他玉米材料进行区分，也为‘沪玉糯3号’的遗传分析和优异基因挖掘提供了数据基础。
综上所述，同一材料在6个SNP位点上的基因型不同，仅用一对引物对组合无法准确判断待测材料的真实性，因此，利用本发明的6对引物对组合，通过对所有SNP位点带型的检测和统计，可以对‘沪玉糯3号’品种的真实性进行准确鉴定。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记及其应用
<130> 1911003
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Zea mays L.certaina kulesh
<220>
<221> STS
<222> (13)..(13)
<400> 1
ggttattgga gcgcgtgtag ttctggt 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Zea mays L.certaina kulesh
<220>
<221> STS
<222> (16)..(16)
<400> 2
tgacattcca ctcgacctcc tacacat 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Zea mays L.certaina kulesh
<220>
<221> STS
<222> (25)..(25)
<400> 3
gtcactgcta cacaacctcc tatgttg 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Zea mays L.certaina kulesh
<220>
<221> STS
<222> (27)..(27)
<400> 4
acacctgcaa caccagctcc agcccaa 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Zea mays L.certaina kulesh
<220>
<221> STS
<222> (7)..(7)
<400> 5
gagctttgga gcacgcgttc tgtcctc 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Zea mays L.certaina kulesh
<220>
<221> STS
<222> (22)..(22)
<400> 6
agagcactaa ctcctactcc tatgaag 27

Claims (7)

1.用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的SNP分子标记，其包括：位于沪玉糯3号糯玉米1号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的分子标记SNP1、位于沪玉糯3号糯玉米3号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的分子标记SNP2、位于沪玉糯3号糯玉米6号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的分子标记SNP3、位于沪玉糯3号糯玉米8号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的分子标记SNP4、位于沪玉糯3号糯玉米9号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的分子标记SNP5和/或位于沪玉糯3号糯玉米10号染色体上核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的分子标记SNP6。
2.一组用于鉴定沪玉糯3号糯玉米的特异引物对，包括分别对应于如权利要求1所述分子标记SNP1-SNP6的引物对组合1-6，每个引物对组合均含有两组引物对，具体核苷酸序列如下所示：
其中，引物序列中带有下划线的碱基与分子标记SNP1-SNP6中的SNP位点相对应。
3.如权利要求1所述SNP分子标记在鉴定沪玉糯3号糯玉米中的应用。
4.一种利用权利要求1所述SNP分子标记进行沪玉糯3号糯玉米品种真实性鉴定的方法，包括以下步骤：
1)根据权利要求1所述SNP分子标记中SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5和SNP6的侧翼序列分别设计引物对组合1、引物对组合2、引物对组合3、引物对组合4、引物对组合5和引物对组合6，其中，每个引物对组合均含有两组引物对；
2)提取待鉴定糯玉米材料的基因组DNA；
3)根据步骤1)所述的引物对组合1-6分别对待鉴定材料的基因组DNA进行降落聚合酶链式扩增反应，获得扩增产物；
4)扩增产物多态性鉴定
对步骤3)得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，获得扩增产物的SNP位点指纹图谱，根据SNP位点指纹图谱进行判定：若扩增产物的SNP位点指纹图谱结果与下述结果完全一致，则待鉴定材料为糯玉米品种‘沪玉糯3号’：
引物对组合1：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现271bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现290bp条带；
引物对组合2：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现278bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现297bp条带；
引物对组合3：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现240bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现259bp条带；
引物对组合4：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现288bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现307bp条带；
引物对组合5：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现262bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现281bp条带；
引物对组合6：第1引物对的扩增产物指纹图谱：出现255bp条带；第2引物对的扩增产物指纹图谱：出现274bp条带。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述降落聚合酶链式扩增反应的反应体系中，各物质的终浓度为：模板DNA 10μg·mL-1，引物对中的左、右引物各2μmol·L-1，dNTPs 2.5mmol·L-1，MgCl22.5mmol·L-1，1×PCR buffer，Tris-HCl 10mmol·L-1，pH8.5，KCl 50mmol·L-1和Taq酶0.5U。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述降落聚合酶链式扩增反应的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，66-67℃退火30s，72℃延伸30s，之后每个循环依次降低1℃、速度0.1℃/s、共14个循环；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s、22个循环；最后72℃延伸5min、4℃保存。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中，扩增产物在3.0～4.0％的琼脂糖凝胶中进行电泳。
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