CN113355449A

CN113355449A - 一种长穗偃麦草3e染色体特异共显性kasp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN113355449A
Application number: CN202110785666.2A
Authority: CN
Inventors: 陈静; 张紫晋; 江迪; 粟永英; 杨婷; 赵爽
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-07-12
Also published as: CN113355449B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种长穗偃麦草3E染色体特异共显性KASP分子标记及其应用。具体技术方案为：KASP分子标记包括TWK3EL1和TWK3ES1，TWK3EL1的引物包括小麦等位型下游引物3EL1‑R1、长穗偃麦草等位型下游引物3EL1‑R2和共用上游引物3EL1‑F。TWK3ES1的引物包括小麦等位型下游引物3ES1‑R1、长穗偃麦草等位型下游引物3ES1‑R2和共用上游引物3ES1‑F。本发明提供的分子标记遗传稳定性好、分辨率高，为高通量检测和追踪不同小麦背景下不同来源的长穗偃麦草3E染色体、加快长穗偃麦草3EL或3ES上优异基因的转移和利用提供了有力工具，可有效应用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

Description

一种长穗偃麦草3E染色体特异共显性KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种长穗偃麦草3E染色体特异共显性KASP分子标记及其应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一。传统的杂交育种导致小麦品种遗传基础变窄，极大降低了育种中可用遗传资源的多样性；新出现的病害及气候变化对小麦的安全生产造成严重威胁。部分小麦近缘物种具有抗寒、抗旱、耐盐碱、抗多种小麦病害(赤霉病、锈病、白粉病等)等各种优良特性，是小麦遗传改良的宝贵基因资源。因此，通过种间杂交将野生近缘物种所携带的优异基因转移到普通小麦是解决小麦品种遗传基础变窄这一问题的有效途径。

长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum(Host)D.R.Dewey)系禾本科、小麦族、偃麦草属植物，其染色体组包含多种倍性，基本染色体组为E。目前已鉴定的主要有二倍体(2n＝2x＝14，EE，)、四倍体(2n＝4x＝28，EEEE)和十倍体(2n＝10x＝70，EEEEEEStStStSt)。长穗偃麦草具有高产(大穗和多花多粒)、抗病(叶锈、条锈、秆锈、白粉、赤霉和黄矮病等)、抗逆(耐寒、耐旱、耐盐碱、耐湿和耐贫瘠)和高蛋白等多种重要的优异农艺性状，是拓宽小麦基因库的优良候选物种。例如，长穗偃麦草7E染色体长臂上携带高抗赤霉病基因Fhb7，1E和6E染色体上有抗叶枯病基因，3E染色体上含有抗黄矮病基因和耐盐基因。

分子标记是鉴定小麦远缘杂交种质的有效工具，可以快速准确地鉴定和追踪导入小麦背景中的外源遗传物质，从而加速优良种质资源的规模化筛选，有效提高分子标记辅助选择育种的效率。目前针对二倍体、四倍体和十倍体长穗偃麦草已经开发了众多类型的长穗偃麦草染色体特异的分子标记，但均为基于实验室凝胶电泳检测PCR扩增片段多态性的分子标记技术，无法实现自动化、平台化筛选，且在长穗偃麦草不同倍性物种之间不通用，难以广泛用于不同来源长穗偃麦草杂交育种后代群体的大规模鉴定筛选，阻碍了长穗偃麦草优异基因资源的有效开发和应用。

单核苷酸的多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)是指在基因组水平上单个核苷酸的变异(转换、颠换、缺失和插入)所引起的DNA序列多态性。SNP具有遗传稳定性高、位点丰富、分布广泛、适于高通量分析检测等优点，已成为第三代分子标记，大大提升了目标位点的选择效率。KASP标记是基于竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele-Specific PCR，KASP)技术的SNP基因分型方法，具有通量化程度高、低成本、遗传稳定性好、数据自动化采集等特点，能够快速准确、高通量、平台化地实现基因分型。

目前，应用于小麦背景下长穗偃麦草染色体检测的共显性KASP标记尚未见报道，尤其3E染色体上携带的黄矮病毒抗性基因和耐盐基因未得到有效利用。基于长穗偃麦草基础基因组E上与小麦基因组特异的SNP位点，开发不同倍性长穗偃麦草通用的3E染色体长臂3EL和短臂3ES的共显性特异KASP分子标记，能够快速准确、低成本、高通量、自动化地实现小麦-长穗偃麦草导入系中3E染色体的检测，对加速长穗偃麦草3E上优异基因向小麦的转移利用和提高分子标记辅助选择育种效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种长穗偃麦草3E染色体特异共显性KASP分子标记及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记，包括KASP分子标记TWK3EL1，所述KASP分子标记TWK3EL1的引物包括小麦等位型下游引物3EL1-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，包括长穗偃麦草等位型下游引物3EL1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，包括共用上游引物3EL1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述KASP分子标记TWK3EL1的引物基于小麦参考基因TraesCS3A02G338600第3037处的SNP位点设计获得，分子标记多态性为G/A。

优选的，还包括KASP分子标记TWK3ES1，所述KASP分子标记TWK3ES1的引物包括小麦等位型下游引物3ES1-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，包括长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，包括共用上游引物3ES1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述KASP分子标记TWK3ES1基于小麦参考基因TraesCS3A02G177500第3690处的SNP位点设计获得，分子标记多态性为G/T。

相应的，一种长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记，包括KASP分子标记TWK3ES1，所述KASP分子标记TWK3ES1的引物包括小麦等位型下游引物3ES1-R1，其核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，包括长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，包括共用上游引物3ES1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述KASP分子标记TWK3ES1的引物基于小麦TraesCS3A02G177500基因第3690号位点设计获得，分子标记多态性为G/T。

相应的，一种利用所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记鉴定是否含有长穗偃麦草3EL和3ES染色体的方法，具体包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA，作为模板；

(2)利用KASP分子标记TWK3EL1和/或TWK3ES1的引物分别对DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；

(3)分析扩增产物，利用KASP分子标记TWK3EL1只检测出碱基G，则鉴定为含有3E染色体长臂，利用KASP分子标记TWK3EL1只检测出碱基A，则鉴定为不含3E染色体长臂，利用KASP分子标记TWK3EL1同时检测出碱基G、A，则鉴定为小麦背景下含有3E染色体长臂；

利用KASP分子标记TWK3ES1只检测出碱基G，则鉴定为含有3E染色体短臂，利用KASP分子标记TWK3ES1只检测出碱基T，则鉴定为不含3E染色体短臂，利用KASP分子标记TWK3EL1同时检测出碱基G、T，则鉴定为小麦背景下含3E染色体短臂。

优选的，步骤(2)所述PCR扩增的扩增体系为：100ng/μL DNA 1μL、2×KASPMaseter Mix 5μL、引物混合液0.7μL、ddH₂O 3.3μL，总体系10μL；

所述引物混合液的制备方法为：吸取工作浓度为10μM的共用上游引物0.4μL、长穗偃麦草等位型下游引物0.15μL、小麦等位型下游引物0.15μL，混合均匀，各上游引物和下游引物分别使用TWK3EL1和TWK3ES1的各上下游引物。

优选的，步骤(2)所述PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65.7℃梯度退火并延伸1min，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；94℃变性20s，57℃退火并延伸1min，42个循环。

相应的，含有所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记或利用所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记制备的检测/鉴定试剂、检测/鉴定试剂盒、检测/鉴定试纸。

相应的，所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记在小麦育种中的应用。

优选的，所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记在选育抗黄矮病毒小麦和/或选育耐盐小麦中的应用。

优选的，所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记在鉴定小麦-长穗偃麦草材料中是否存在长穗偃麦草3EL或3ES染色体的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明利用二代测序技术对含有E染色体组的二倍体、四倍体和十倍体3种长穗偃麦草进行转录组测序，通过序列数据比对分析获得3种长穗偃麦草共有的E组序列，将共有序列与中国春参考基因组(IWGSCReference Sequence v2.0)进行比对，发现长穗偃麦草3E染色体长臂3EL和短臂3ES上与小麦基因组特异的SNP位点，并根据这些位点首次开发出染色体臂特异的共显性KASP标记TWK3EL1和TWK3ES1。利用这两个标记对不同小麦品种、不同倍性的长穗偃麦草、小麦-长穗偃麦草3E、3EL或3ES导入系进行验证，均能正确分型、准确无误。利用该标记可以精确鉴定导入外源染色体的长臂或短臂，还能检测出含有目标SNP位点的外源小片段，对于染色体工程育种中小片段易位系的检测和追踪尤为重要。

具体而言，首先，本发明开发的长穗偃麦草染色体特异KASP标记，相比于传统基于普通PCR扩增的分子标记，无需实验室凝胶电泳便可实现快速、高通量、平台化检测和追踪小麦-长穗偃麦草衍生后代中的3E染色体或片段，可提高分子标记辅助选择育种的效率。

同时，本发明开发的KASP标记基于SNP位点，遗传稳定性好、分辨率高，只要含有该SNP位点的外源片段都可以检测出来，对于染色体工程育种中小片段易位系的检测和追踪尤为重要。

而且，本发明开发的2个KASP标记分别基于3E染色体长臂3EL和短臂3ES上的SNP位点，是共显性分子标记，小麦-长穗偃麦草3E、3EL或3ES导入系呈现杂合型，而小麦和长穗偃麦草呈现不同的等位型，不仅可以有效鉴别追踪小麦背景中的外源染色体或片段，确定外源优良基因的染色体(臂)来源，而且可以分析小麦和长穗偃麦草染色体结构的变化。

最后，本发明开发的KASP标记所针对的SNP位点，在不同倍性长穗偃麦草之间、不同小麦品种之间具有保守性，从而为高效转移利用不同来源偃麦草3E染色体上的优良性状，并将外源优良基因快速转育到不同小麦背景，提供了一种通用的分子标记选择技术。

综上，本发明提供了一个能够准确鉴定不同来源长穗偃麦草3EL和3ES染色体的共显性KASP标记。该标记基于不同倍性长穗偃麦草、不同小麦品种间保守的SNP位点开发，遗传稳定性好、分辨率高，为高通量检测和追踪不同小麦背景下不同来源的长穗偃麦草3E染色体、加快长穗偃麦草3EL或3ES上优异基因的转移和利用提供了有力工具，可有效应用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

附图说明

图1为分子标记TWK3EL1鉴定16组供试材料分型结果示意图；

图2为分子标记TWK3ES1鉴定16组供试材料分型结果示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种长穗偃麦草通用的3E染色体特异共显性KASP分子标记。所述KASP分子标记包括3E染色体长臂3EL特异共显性KASP分子标记TWK3EL1和3E染色体短臂3ES特异共显性KASP分子标记TWK3ES1。

其中，所述KASP分子标记TWK3EL1的引物包括小麦等位型下游引物3EL1-R1(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)、长穗偃麦草等位型下游引物3EL1-R2(其核苷酸序列如SEQID NO:2所示)和共用上游引物3EL1-F(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)；所述KASP分子标记TWK3ES1的引物包括小麦等位型下游引物3ES1-R1(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)、长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2(其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)和共用上游引物3ES1-F(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)。上述各序列碱基方向从左至右为：5'到3'。

本发明还提供了用所述KASP分子标记鉴定小麦-长穗偃麦草导入系中是否含有长穗偃麦草3EL和3ES染色体的方法，具体包括如下步骤：

1、提取待测样品的DNA，作为模板。

2、利用KASP分子标记TWK3EL1和TWK3ES1的引物分别对DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物。

3、采用荧光定量PCR检测仪分析扩增产物基因型，采集荧光信号，并采用软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1读取分型结果。利用KASP分子标记TWK3EL1只检测出碱基G，则鉴定为含有3E染色体长臂，利用KASP分子标记TWK3EL1只检测出碱基A，则鉴定为不含3E染色体长臂，利用KASP分子标记TWK3EL1同时检测出碱基G、A，则鉴定为小麦背景下含有3E染色体长臂；

利用KASP分子标记TWK3ES1只检测出碱基G，则鉴定为含有3E染色体短臂，利用KASP分子标记TWK3ES1只检测出碱基T，则鉴定为不含3E染色体短臂，利用KASP分子标记TWK3EL1同时检测出碱基G、T，则鉴定为小麦背景下含有3E染色体短臂。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：KASP分子标记TWK3EL1的获得

1、基因组DNA的提取和纯化。试验材料包括如下16种：3个小麦品种(中国春、泰山5号、蓉麦4号)，3种长穗偃麦草(二倍体、四倍体和十倍体长穗偃麦草，均含有基础的E基因组)，10个经过基因组原位杂交GISH(Genomic in situ hybridization)鉴定并确认外缘染色体存在的小麦-长穗偃麦草导入系，包括八倍体小偃麦(2n＝56，AABBDDEE，含有小麦A、B、D组和长穗偃麦草E组的全部染色体)、整套小麦-长穗偃麦草1E-7E二体附加系(2n＝44，在小麦全部染色体组基础上附加一对相同的外源染色体)、小麦-长穗偃麦草3EL端体附加系(2n＝44，在小麦全部染色体组基础上附加一对相同的3E染色体长臂3EL)和小麦-长穗偃麦草3ES端体附加系(2n＝44，在小麦全部染色体组基础上附加一对相同的3E染色体长臂3EL)。其中，小麦品种为国内通用的常规品种资源，三种长穗偃麦草征集自中国农科院作物科学研究所。小麦-长穗偃麦草导入系征集自中科院遗传发育所。

利用常规CTAB法提取上述所有材料的基因组DNA，具体操作步骤包括：将CTAB提取液置于65℃水浴锅预热，并加入2％的巯基乙醇备用。将各供试材料新鲜叶片分别放入2mL离心管中，液氮冷冻后研磨成粉末；向离心管中加入已预热的CTAB提取液800μL，65℃水浴20min，每隔5min轻轻颠倒混匀。再向离心管中加入560μL的氯仿-异戊醇(24:1，V:V)，颠倒混匀，1000rpm离心10min，转移上清液至新的1.5mL离心管中。加入1％体积的RNase A(10mg/mL)，混匀后37℃放置30min。随后加入300μL的氯仿-异戊醇(24:1，V:V)，颠倒混匀，1000rpm离心10min。再转移上清液至新的1.5mL离心管中；加入4℃预冷的400μL异丙醇，轻轻颠倒混匀至絮状DNA出现，4℃静置1h。8000rpm离心5min，弃上清，加入75％乙醇1mL洗涤DNA。再8000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤一次，DNA沉淀常温自然干燥。再加入50μLμL 1×TE缓冲液，将DNA沉淀充分溶解。利用分光光度计检测DNA溶液的浓度与纯度，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。根据所测浓度，用超纯水配置浓度为100ng/μL的DNA工作液，用做PCR扩增模板。

2、长穗偃麦草共有的3EL上特异SNP位点的获得。长穗偃麦草与小麦的亲缘关系较近，将步骤1试验材料中含有E组染色体的二倍体、四倍体和十倍体3种长穗偃麦草的叶片送至百迈克生物科技有限公司，采用二代测序技术进行转录组测序。初始数据处理后获得高质量的序列数据，基于长穗偃麦草参考基因组(Thinopyrum elongatum genome D-3458)数据，通过序列比对分析获得3EL染色体上三种长穗偃麦草共有的核苷酸序列，将共有序列与中国春参考基因组(IWGSCReference Sequence v2.0)第三同源群长臂上的参考基因序列进行比对，生物信息学分析选择相似度＞95％的长穗偃麦草序列中与小麦基因组特异的SNP位点。

以小麦TraesCS3A02G339900和TraesCS3A02G338600为参考基因，获得的11个SNP位点，具体如下表1所示。

表1不同倍性长穗偃麦草染色体3EL上的通用SNP位点

从表1可以看出，这些位点在上述不同倍性的长穗偃麦草E组中具有一致的等位型，而在小麦A、B、D亚组中均为另一种等位型，因此可用于长穗偃麦草通用的3EL染色体特异共显性KASP标记的开发。

3、KASP标记TWK3EL1的开发。

在已知表1规律的情况下，KASP引物设计好坏是KASP分型成功与否的关键。为提高成功率，基于长穗偃麦草参考基因组和小麦参考基因组序列，对引物设计进行如下优化：

(1)对SNP位点前后序列进行分析，选择引物GC含量要适当，且上、下游引物GC含量相近，以保证引物在同一退火温度下能稳定结合DNA单链，进而扩增。

(2)设计的引物应在小麦A、B、D三个亚基因组和长穗偃麦草E基因组中唯一存在，以保证扩增片段单一且特异。

(3)设计的引物应在不同倍性长穗偃麦草中均能特异性扩增，以保证引物的通用性。

(4)分别检测设计的各引物的自身互补性、两两配对后的引物互补性，确保所有互补后需解链的自由能＜±3Kcal/mol,在扩增过程中不易形成引物二聚体。

经如上引物设计优化后，选择表1中编号3EL_10的SNP(小麦TraesCS3A02G338600参考基因序列第3037处的单碱基多态性)用于设计KASP标记的引物。该位点在小麦中的等位型为A，在长穗偃麦草中的等位型均为G。以该SNP位点设计的引物能同时在长穗偃麦草二倍体、四倍体和十倍体中成功分型。其余SNP位点有些不能设计引物，有些SNP位点能设计引物但实际检测时分型不成功(失败的原因可能与SNP位点有关，也可能与基于SNP位点设计的引物相关)。后续开发TWK3ES1标记时的SNP位点选择基于同样理由进行，不再赘述。

引物包括：含有FAM荧光接头序列的小麦等位型下游引物3EL-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；含有VIC荧光接头序列的长穗偃麦草等位型下游引物3EL1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；共用上游引物3EL1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。其中，各下游引物中的荧光接头目的在于后续分型鉴定时便于快速通过不同的荧光颜色获得分型结果，实践中可以选择其他的荧光接头或能实现等同效果的其他接头。后同，不再赘述。

PCR扩增体系为：100ng/μL DNA 1μL、2×KASP Maseter Mix 5μL、引物混合液0.7μL、ddH₂O 3.3μL，总体系10μL。引物混合液的制备方法为：吸取工作液浓度为10μM的共用上游引物3EL1-F 0.4μL、长穗偃麦草等位型下游引物3EL1-R2 0.15μL、小麦等位型下游引物3EL1-R10.15μL，混合均匀。

PCR扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65.7℃梯度退火并延伸1min，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；94℃变性20s，57℃退火并延伸1min，42个循环。

需要说明的是：PCR扩增体系及反应程序直接关系到结果的成败，且体系、程序中各参数并非常规调整、选择即可获得的。任意调整参数，很可能导致扩增失败。发明人在建立所述扩增体系时，使用定量PCR设备设定一个较多循环次数的PCR程序，实时检测FAM和VIC荧光，观察PCR扩增曲线，在确定大部分样本进入平台期后，得到最佳循环次数。循环数过多或过少均会导致分型变差或失败，最后将循环数定为42个循环。后续涉及的PCR扩增体系及反应程序基于相同原因，同样不能随意调整各参数，不再赘述。

采用上述方法，将获得的引物对供试材料的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物，使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃时对扩增产物进行荧光采集，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型。分型结果如图1所示。

因专利递交要求，各附图均为黑白色，无法显示荧光颜色，对应荧光颜色均在文中进行阐述。图1中，横轴远端样品群(右下角椭圆内，AL1-Allele A)为不同小麦品种和不含有3E或3EL的小麦-长穗偃麦草二体附加系或端体附加系，等位型为“Allele A/Allele A”，荧光读取呈现红色。纵轴远端样品群(左上角椭圆内，AL2-Allele G)为不同倍性的长穗偃麦草麦，等位型为“Allele G/Allele G”，荧光读取呈现蓝色。中间样品群(中间位置，Allele A/G)为小麦-长穗偃麦草导入系(八倍体小偃麦、小麦-长穗偃麦草3E二体附加系、小麦-长穗偃麦草3EL端体附加系)，荧光读取呈现绿色，等位型为“Allele A/Allele G”。近原点处(NTC)三个黑点代表无模板对照。从图1可以看出，TWK3EL1标记分型结果准确，在不同倍性长穗偃麦草间、不同小麦品种间的保守性较高，可用于小麦背景下不同长穗偃麦草来源的3EL染色体的检测。

实施例二：KASP分子标记TWK3ES1的获得

1、使用与实施例一相关的试验材料和方法获得同样16种样品的基因组DNA。

2、采用实施例一的方法，获得三种长穗偃麦草共有的3ES染色体上的特异SNP位点。参考基因为小麦TraesCS3A02G183900和TraesCS3A02G177500。结果如表2所示。

表2不同倍性长穗偃麦草染色体3ES的通用SNP位点

表2中的各位点在上述不同倍性的长穗偃麦草E组中具有一致的等位型，而在小麦A、B、D亚组中均为另一种等位型，可用于长穗偃麦草通用的3ES染色体特异共显性KASP标记的开发。

3、KASP标记TWK3ES1的开发。采用实施例一的方法进行KASP引物设计和优化，选择编号3ES_8的SNP(小麦TraesCS3A02G177500参考基因序列第3690处的单碱基多态性)用于设计KASP标记引物，该位点在小麦中的等位型为T，在长穗偃麦草中的等位型均为G。设计引物包括：含有FAM荧光接头序列的小麦等位型下游引物3ES1-R1，其核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；含有VIC荧光接头序列的长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；共用上游引物3ES1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

PCR扩增体系为：100ng/μL DNA 1μL、2×KASP Maseter Mix 5μL、引物混合液0.7μL、ddH₂O 3.3μL，总体系10μL。引物混合液的制备方法为：吸取工作浓度为10μM的共用上游引物3ES1-F 0.4μL、长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2 0.15μL、小麦等位型下游引物3ES1-R1 0.15μL，混合均匀。

采用上述方法，将获得的引物对供试材料的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物，使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃时对扩增产物进行荧光采集，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型。分型结果如图2所示。

图2中，横轴远端样品群(右下角，AL1-Allele T)为不同小麦品种和不含有3E或3ES的小麦-长穗偃麦草二体附加系或端体附加系，等位型为“Allele T/Allele T”，荧光读取呈现红色。纵轴远端样品群(左上角，AL2-Allele G)为不同倍性的长穗偃麦草麦，等位型为“Allele G/Allele G”，荧光读取呈现蓝色。中间样品群(中间位置Allele T/G)为小麦-长穗偃麦草导入系(八倍体小偃麦、小麦-长穗偃麦草3E二体附加系、小麦-长穗偃麦草3ES端体附加系)，荧光读取呈现绿色，等位型为“Allele T/Allele G”。近原点处(NTC)三个黑点代表无模板对照。结果显示，TWK3ES1标记分型结果准确，在不同倍性长穗偃麦草间、不同小麦品种间的保守性较高，可用于小麦背景下不同长穗偃麦草来源3ES染色体的检测。

实施例三：KASP分子标记TWK3EL1和TWK3ES1的联合应用

1、小麦-长穗偃麦草远缘杂交后代的鉴定。

待测材料包括174份育成的小麦-长穗偃麦草杂交的高代衍生材料(编号为：S1-S174)和SNP不同等位型的参考材料。参考材料包括中国春在内的小麦品种7份和3份小麦-长穗偃麦草导入系：八倍体小偃麦、小麦-长穗偃麦草3EL附加系和3ES附加系，每份材料进行三次平行检测。采用实施例一的方法提取上述各材料的基因组DNA为模板，并分别利用所述KASP分子标记TWK3EL1和TWK3ES1的引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系为：100ng/μL DNA 1μL、2×KASP Maseter Mix 5μL、引物混合液0.7μL、ddH₂O 3.3μL，总体系10μL。引物混合液的制备方法为：吸取工作浓度为10μM的共用上游引物0.4μL、长穗偃麦草等位型下游引物0.15μL、小麦等位型下游引物0.15μL，混合均匀。各上游引物和下游引物分别使用TWK3EL1和TWK3ES1的各上、下游引物。

使用ABI实时荧光定量PCR仪在60℃时对扩增产物进行荧光收集，利用生物信息学软件QuantStudio Design&Analysis Software v1.5.1对PCR产物进行分型。

因检测样品较多，检测结果示意图和相关数据未在文中一一展示。根据长穗偃麦草3EL染色体的分型结果，共检测到含有3EL染色体的小麦-长穗偃麦草杂交衍生材料7份，编号为S11、S92、S121、S123、S142、S153、S171。根据长穗偃麦草3ES染色体的分型结果，共检测到含有3ES染色体的小麦-长穗偃麦草杂交材料6份，编号为S11、S92、S121、S142、S171、S174。综合上述检测结果，材料编号S11、S92、S121、S142、S171同时含有3E染色体的长臂和短臂，而材料S123、S153仅含有染色体长臂3EL，S174仅含有染色体短臂3ES，参考材料分型结果与预期一致，其中7份小麦品种均为纯合的小麦基因型。

2、KASP分子标记鉴定结果的验证。

待测材料：步骤1鉴定出的含有3E染色体长臂和短臂的小麦-长穗偃麦草3E导入系材料5份(S11、S92、S121、S142、S171)，含有3E染色体长臂的小麦-长穗偃麦草3EL导入系材料2份(S123、S153)，以及含有3E染色体短臂的小麦-长穗偃麦草3ES导入系材料1份(S174)，小麦品种中国春和四倍体长穗偃麦草各1份。采用测序的方法进一步验证KASP分子标记的鉴定结果。

根据3EL染色体上SNP分子标记所在的长穗偃麦草与小麦基因组序列，利用geneious 8.0.2软件设计一对通用的上、下游引物(3EL-F，3EL-R)。该引物能特异扩增包含SNP位点所在的469bp大小的小麦基因组片段和长穗偃麦草E基因组片段。

引物3EL-F核苷酸序列为5’-AGCTCCTTGATGAGGTTGTGA-3’，引物3EL-R的核苷酸序列为5’-CTCCAAAGCTGGGGAAGATAAC-3’。

PCR扩增体系：100ng/μL DNA 5μL，Pfu Mix 25μL，上、下游引物各2.5μL，ddH₂O 15μL，总体系50μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。

将扩增PCR产物送有康生物科技有限公司进行测序。测序结果显示，小麦中国春扩增片段目标SNP位点处的碱基为A，四倍体长穗偃麦草扩增片段目标SNP位点处的碱基为G，而小麦-长穗偃麦草3E、3EL导入系(S11、S92、S121、S142、S171、S123、S153)产生2种扩增片段，在目标SNP位点处的碱基分别为A和G。测序结果与KASP分子标记检测结果一致。

类似地，根据3ES染色体上SNP分子标记所在的长穗偃麦草与小麦基因组序列，利用geneious 8.0.2软件设计两对引物(因为没找到可以同时扩增2个物种且符合引物设计参数要求的序列，所以此步骤分开设计2个物种的引物)。第一对引物(3ES-CS-F/3ES-CS-R)仅从小麦基因组中特异扩增目标SNP位点所在的398bp片段，第二对引物(3ES-YM-F/3ES-YM-R)仅从长穗偃麦草E组特异扩增目标SNP位点所在的398bp片段。

其中，引物3ES-CS-F核苷酸序列：5’-TAGCTCTGGCGAAGAAGGT-3’；引物3ES-CS-R核苷酸序列：5’-CCTGTTGTTGCTGCCCAG-3’。引物3ES-YM-F核苷酸序列：5’-TAGCTCTGGCGAAGAAGGG-3’；引物3ES-YM-R核苷酸序列：5’-CCTGTTGTTGCTGCCCAA-3’。

将扩增PCR产物送有康生物科技有限公司进行测序。测序结果显示，小麦中国春扩增片段目标SNP位点处的碱基为T，四倍体长穗偃麦草扩增片段目标SNP位点处的碱基为G，小麦-长穗偃麦草3E和3ES导入系(S11、S92、S121、S142、S171、S174)均产生2种扩增片段，在目标SNP位点处的碱基分别为T和G，与KASP分子标记检测结果一致。

因此，本发明提供的3EL与3ES染色体特异共显性KASP标记TWK3EL1与TWK3ES1，可用于快速准确、高通量、自动化地鉴定追踪小麦背景下的长穗偃麦草3EL与3ES染色体，高效用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种长穗偃麦草3E染色体特异共显性KASP分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(3EL-R1)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tagccctctt ttagtgcaag t 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(3EL1-R2)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tagccctctt ttagtgcaag c 41

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(3EL1-F)

<400> 3

agctccttga tgaggttgtg a 21

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(3ES1-R1)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc taggttccag gtgttgctga a 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(3ES1-R2)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat taggttccag gtgttgctga c 41

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 核苷酸序列(3ES1-F)

<400> 6

cccgactcta cgttcttcca 20

Claims

1.一种长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记，其特征在于：包括KASP分子标记TWK3EL1，所述KASP分子标记TWK3EL1的引物包括小麦等位型下游引物3EL1-R1，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，包括长穗偃麦草等位型下游引物3EL1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，包括共用上游引物3EL1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的一种长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记，其特征在于：还包括KASP分子标记TWK3ES1，所述KASP分子标记TWK3ES1的引物包括小麦等位型下游引物3ES1-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，包括长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，包括共用上游引物3ES1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.一种长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记，其特征在于：包括KASP分子标记TWK3ES1，所述KASP分子标记TWK3ES1的引物包括小麦等位型下游引物3ES1-R1，其核苷酸序列如SEQID NO:4所示，包括长穗偃麦草等位型下游引物3ES1-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，包括共用上游引物3ES1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.一种利用权利要求1～3任意一项所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记鉴定是否含有长穗偃麦草3EL和3ES染色体的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA，作为模板；

5.根据权利要求4所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记鉴定是否含有长穗偃麦草3EL和3ES染色体的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增的扩增体系为：100ng/μL DNA 1μL、2×KASP Maseter Mix5μL、引物混合液0.7μL、ddH₂O 3.3μL，总体系10μL；

6.根据权利要求5所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记鉴定是否含有长穗偃麦草3EL和3ES染色体的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65.7℃梯度退火并延伸1min，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.7℃；94℃变性20s，57℃退火并延伸1min，42个循环。

7.含有权利要求1～3任意一项所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记或利用权利要求1～3任意一项所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记制备的检测/鉴定试剂、检测/鉴定试剂盒、检测/鉴定试纸。

8.权利要求1～3任意一项所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记在小麦育种中的应用。

9.根据权利要求8所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记在小麦育种中的应用，其特征在于：在选育抗黄矮病毒小麦和/或选育耐盐小麦中的应用。

10.根据权利要求9所述长穗偃麦草3E染色体KASP分子标记在小麦育种中的应用，其特征在于：在鉴定小麦-长穗偃麦草材料中是否存在长穗偃麦草3EL或3ES染色体的应用。