CN107475414A - 一种筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关的snp引物对 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的SNP引物对。通过486个个体的全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎6号染色体上的39个与糖原显著相关的SNP信号。针对该区域scaffold426_295，537碱基处的1个SNP位点，开发了相应的检测方法，同时所述该位点上下游500bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。同时该位点TT基因型个体相比较于CC基因型个体，糖原含量显著提高6.2％。筛选该位点的TT基因型亲贝，用于指导牡蛎育种。本发明有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，筛选该位点TT基因型亲贝，提高子代糖原含量。本研究结果是基于野生群体全基因组关联分析获得的SNP标记，效果更稳定。

Description

一种筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关的SNP引 物对

技术领域

本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及到一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法及其相关的SNP引物对。

背景技术

牡蛎是一种重要的海洋水产资源，也是世界上最重要的海水养殖贝类之一。我国的牡蛎养殖规模和产量多年都稳居世界首位，但是牡蛎出口价格偏低，难以进入国际高端市场。综合原因，主要是由于牡蛎营养品质含量偏低。所以，提高牡蛎的产品品质是提高我国养殖牡蛎的经济效益，实现产业由高产低效向高产高效模式的转型升级的重要途径。牡蛎素有海中牛奶之称，其中糖原等营养物质的含量高是牡蛎最主要的特色之一。糖原的含量影响牡蛎肥满度和产量，同时影响着牡蛎消费口感。进行糖原等营养品质性状的遗传改良，培养高糖原含量的牡蛎个体，是解决我国牡蛎产业改善高产低效现状的重要途径。

现如今，水产育种研究中，对品质性状的研究还比较少。而且大都采用传统的群体选育的方法进行，其主要缺点是周期长，见效慢。而近些年来，随着基因组学和育种技术的发展，分子标记辅助选育以及全基因组选择等育种技术得到了迅猛发展，大大提高了牡蛎的遗传育种水平，同时显著的提升了品质性状的选育效率和精度。利用分子标记辅助选择可以减少盲目性，缩短育种年限，提高育种的效率。利用分子标记辅助选择育种，最主要的是获得性状相关的分子标记。目前普遍采用的方法包括QTL定位及全基因组关联分析的方法。相比QTL定位，全基因组关联分析的方法能克服定位不准确的缺陷，在全基因组范围内对遗传变异基因进行总体关联分析，将关联位点定位于很小的区间内，显著提高了定位的准确度和精度，尤其适用于复杂性状的遗传解析。近年来，应用GWAS方法研究复杂数量性状基因定位并指导分子育种已成流行趋势。

尽管GWAS在作物和畜禽的农业生物研究中发挥了重要作用，但在水产动物中还仅有少量报道。尤其是在双壳贝类中，已有的标记的开发，主要依赖于候选基因的关联分析。这种分析是根据先验信息，在已知的功能基因上进行多态性位点的开发，标记相对数目不多，不一定能获得主效位点，且无法对表型的遗传调控机制有一个全面的认识。迄今为止，还未有基于全基因组关联分析的结果开发的SNP标记。随着长牡蛎全基因组测序的完成以及高密度遗传连锁图谱的获取，使得进行GWAS分析成为可能。本发明基于长牡蛎基因组，通过二代测序技术进行全基因组重测序，并针对糖原含量进行全基因组关联分析，获得控制糖原含量的主效多态性位点及关键基因。在此基础上开发糖原含量相关的SNP标记。与以往开发的SNP位点相比，基于GWAS获得的SNP信号，可信度更高，适用群体范围更广，同时具有简便，可移植性强的特征。

发明内容：

本发明的目的是提供一种鉴定长牡蛎高糖原含量个体的SNP标记检测方法，为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。

具体获取SNP方法如下：(1)实验材料的收集及同质化驯养：收集486个变异丰富的，不同海域长牡蛎野生个体，进行同质化养殖。(2)表型数据的测定：利用蒽酮比色发对486个长牡蛎个体进行糖原含量测定。(3)基因分型：采用IlluminaHiseq2500二代测序技术平台，对486个长牡蛎个体进行全基因组重测序，筛查SNPs位点并进行个体分型，获得用于关联分析的有效SNPs位点。(4)关联分析：利用混合线性模型进行全基因组关联分析，获得与性状显著关联的39个SNP位点(P-value<10^-6)，位于长牡蛎基因组scaffold 426的290,451-307,883kb范围内。通过LD block分析，67个SNP位点紧密连锁(LD＞0.7)。糖原含量相关的全基因组关联分析曼哈顿图如附图2所示。随后选取位于scaffold426_295,537kb位置处碱基，P-value为8.12×10^-7，作为本项目候选SNP位点。该位点存在T和C两个碱基形式。位于scaffold 426的290,451-307,883kb范围内的其它38个SNP位点都采用相同的鉴定方法。

本发明通过以下技术方案得以实现：

一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记：该标记位于长牡蛎基因组scaffold426_295,537kb的碱基处，此碱基存在T和C两个碱基形式。所述该位点上下游500kb的序列如SEQID No.1所示。主要检测步骤如下：

1)提取长牡蛎基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；

2)取步骤1)中所述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL(若基因组DNA浓度≤5ng/uL，可加4.6uL基因组DNA而不加灭菌双蒸水。另反应体系可同比放大)；

3)PCR扩增的反应程序为：

用于上述PCR扩增的正反向引物序列为：

F：5’-TTTTCCACCAAGGTCCGA-3’；

R：5’-AAGTCTGAGGGAGGAGGAAG-3’。

4)步骤3)所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标(等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5uM)各1uL，经过95℃退火5-10min；

5)待步骤4)所述的退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中所述长牡蛎SNP标记的基因型，具体方法为：

a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，若熔解曲线求导图为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃则SNP基因型为CC，若熔解曲线求图为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃则SNP基因型为TT，若熔解曲线求导后为双峰则SNP基因型为TC；

c)判断每个待测样本所述长牡蛎SNP标记基因型。

SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，

高温内标序列为：

低温内标序列为：

获得内标的具体方法为：

1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：

GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’

DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’

2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；

3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。

与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的潜在应用：本项目是基于全基因组关联分析GWAS的结果开发的SNP标记。相对于以往的标记开发，此标记的可信度更高，适应群体范围更广，效果更稳定。且基于HRM的检测方法，简便易行，可应用于群体多个个体数据的鉴定和筛选。在苗种繁育前，通过非致死性取样提取牡蛎基因组DNA，利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型，通过筛选TT基因型亲贝有效提高后代长牡蛎糖原含量。基因型的判定主要基于PCR产物熔解曲线。如图1所示，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。

附图说明

1.图1是上述包含的scaffold426_295,537位点的PCR产物熔解曲线求导图；

2.图2是长牡蛎糖原含量全基因组关联分析的曼哈顿图。

具体实施方式：

以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1：

a)样品的采集：2017年采集胶南同时孵苗的一龄牡蛎野生群体的288个个体，对其进行解剖，取闭壳肌和剩余组织，用液氮速冻后于-80℃保存备用。

b)DNA的提取：如说明书所述，提取288个样本的基因组DNA，同时利用Nanodrop2000仪器测定双链DNA的浓度，并利用灭菌水稀释至10-20ng/uL；

c)SNP位点基因型检测：如说明书所述取步骤1)中稀释的基因组DNA作为模板，使用引物F和R进行PCR扩增，反应体系如下：基因组DNA 1uL，引物F和R各0.2uL，PCR mix 5uL，灭菌双蒸水3.6uL；

PCR扩增的反应程序为：

正向引物为F：5’-TTTTCCACCAAGGTCCGA-3’；

反向引物为R：5’-AAGTCTGAGGGAGGAGGAAG-3’；

所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标各1uL，经过95℃-98℃退火5-10min；

退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中基因型：

a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。

c)判断每个待测样本所述长牡蛎SNP标记基因型。

内标为等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5uM。

SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，

高温内标序列为：

低温内标序列为：

获得内标的具体方法为：

1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：

GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’

DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’

2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；

3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。

反应结束后加入1μl内标(内标同上)和1μl LC-green染料，瞬时离心后95℃变性10min，冷却至室温。

d)HRM分型:取出96孔PCR反应板放入LightScanner 96机器进行HRM检测，收集55℃-95℃之间的荧光信号，运行完毕根据熔解曲线进行结果分析，统计个体的基因型。

e)结果分析:检测后，有第137个个体基因型为C/C，118个个体基因型为T/C，31个个体基因型为T/T，2个个体基因型为NN。

f)糖原含量的检测及关联分析：利用蒽酮比色法检测288个野生个体的糖原含量。图中数据显示，不同基因型糖原含量的顺序为TT>TC>CC。TT基因型糖原含量相较于CC型，糖原含量显著提高6.2％。所以，该位点的分型结果与糖原含量显著关联。育种中通过筛选TT型个体，可以显著提高后代糖原含量。

表1：288个个体糖原含量和基因分型分析。

序列表(1)SEQ ID NO.1的信息序列特征长度：1001bp

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线形

分子类型：DNA

来源：长牡蛎

序列描述：

CCCATTTAATACAATCATCTGATCCTTAGTTTGGGGAGGGTTTGTCAAAATTGGAATCAATTTGAATCTTTATGATAAAAGATTTCCGTGTTCTTAAATATTCAATTGAACAAATTCAAGATTAAAGAACCTAATGCATTGTTAAGATACCTATACACATAAGATTTTTAAAATGCAAATCTAGTCATCATATTGTTGTCGTCTGAATCAGAAAATTATGTGACATCCATTGCTCCTCCTATTAGTTTTTACATACTTGTTCCACATATCATCTCATCAATGTATATCTGGTGCAATGCCTGCTCTTCTGAAACTATTAATATCATAAAAATTAGTACACATTTCTCTCTATAACTGCCATGTTTAATGTACAAAAGGATAACTTTCTTGTGGCTCTATTATAGTTTTACTCATTAGCATTGCTTGTACATATTTTCACTGATTAAAGTAATTATTTCTTTACCACCAGCACATTCATTTTCCACCAAGGTCCGATATCTCTCATAATTAGCTCTCCTCTCCTCTTCCTCCTCCCTCAGACTTAATCTGGAAAAAACAAATTCAAACCATTATGGTTTCCTGGACGTCAATTTTATAAAAATATAAAGTATAATACATGATACTTAAATTTGTGGACAGTGGTTCAACCAATCAAAAGGAAATGCCTTACATTTGTGGAGTCACCAAATTGAATTTTGGCATAATGTCTAGATGGGCTCTAACATCAAATCTGTCAATCATGTTTTCTTTGTCTCCTTGCCATGGCATCCTGTAAACATAACAACTAACTTTGTCACTTTACTTATACGTAAACCAAGTCGCATCTCACAAAAACATTATAATTTAGCTTTGAAAATTCTGTACACATTTGATTACAAAATAGTTTTACTAACATGCTCTGTGGGCTTTCTGCTGCAATTGCCACAGCAGGATCCAAGTTCACTTTCACAGGGCGCCCATACACTCTTAAAAACTGAGTGGGGTCAAGTTTCTAAAAATGA。

本发明通过486个个体的全基因组关联分析，鉴定出位于长牡蛎6号染色体上的39个与糖原显著相关的SNP信号。针对该区域scaffold426_295,537碱基处的1个SNP位点，开发了相应的检测方法，同时所述该位点上下游500bp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。结果表明利用该方法可以简单迅速检测该SNP位点的基因分型。同时该位点TT基因型个体相比较于CC基因型个体，糖原含量显著提高6.2％。后续可以通过该方法，筛选该位点的TT基因型亲贝，用于指导牡蛎育种。本发明提供了一个与长牡蛎糖原含量显著相关的SNP标记及其潜在应用，其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，筛选该位点TT基因型亲贝，提高子代糖原含量。本研究结果是基于野生群体全基因组关联分析获得的SNP标记，其可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关的SNP引物对

<141> 2017-09-20

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> gene

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1001)

<400> 1

cccatttaat acaatcatct gatccttagt ttggggaggg tttgtcaaaa ttggaatcaa 60

tttgaatctt tatgataaaa gatttccgtg ttcttaaata ttcaattgaa caaattcaag 120

attaaagaac ctaatgcatt gttaagatac ctatacacat aagattttta aaatgcaaat 180

ctagtcatca tattgttgtc gtctgaatca gaaaattatg tgacatccat tgctcctcct 240

attagttttt acatacttgt tccacatatc atctcatcaa tgtatatctg gtgcaatgcc 300

tgctcttctg aaactattaa tatcataaaa attagtacac atttctctct ataactgcca 360

tgtttaatgt acaaaaggat aactttcttg tggctctatt atagttttac tcattagcat 420

tgcttgtaca tattttcact gattaaagta attatttctt taccaccagc acattcattt 480

tccaccaagg tccgatatct ctcataatta gctctcctct cctcttcctc ctccctcaga 540

cttaatctgg aaaaaacaaa ttcaaaccat tatggtttcc tggacgtcaa ttttataaaa 600

atataaagta taatacatga tacttaaatt tgtggacagt ggttcaacca atcaaaagga 660

aatgccttac atttgtggag tcaccaaatt gaattttggc ataatgtcta gatgggctct 720

aacatcaaat ctgtcaatca tgttttcttt gtctccttgc catggcatcc tgtaaacata 780

acaactaact ttgtcacttt acttatacgt aaaccaagtc gcatctcaca aaaacattat 840

aatttagctt tgaaaattct gtacacattt gattacaaaa tagttttact aacatgctct 900

gtgggctttc tgctgcaatt gccacagcag gatccaagtt cactttcaca gggcgcccat 960

acactcttaa aaactgagtg gggtcaagtt tctaaaaatg a 1001

Claims (5)

1.一种筛选高糖原含量长牡蛎亲贝相关的SNP标记的引物对，其特征在于：

正向引物为F：5′-TTTTCCACCAAGGTCCGA-3′；

反向引物为R：5′-AAGTCTGAGGGAGGAGGAAG-3′。

2.一种如权利要求1所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：

通过全基因组关联分析获得39个成簇SNP标记位于6号染色体scaffold426_290，451-307，883区域内；本项目选择scaffold426_295，537碱基处SNP位点进行标记开发；该位点存在T和C两个碱基形式，在苗种繁育前对亲贝进行该SNP标记位点基因型鉴定，不同基因型糖原含量高低的顺序为TT＞TC＞CC；通过筛选该位点TT基因型的亲贝，进行遗传育种，从而显著提高后代家系糖原含量；

包括步骤如下：

(1)所述长牡蛎基因组的提取，具体为提取长牡蛎基因组DNA，使用灭菌水或TE缓冲液稀释到10-20ng/uL；

(2)所述长牡蛎基因组DNA为模板，配制反应体系基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；

(3)PCR扩增的反应程序为：

(4)所述的PCR反应结束后，加入饱和荧光染料Lcgreen及内标各1uL，经过95℃-98℃退火5-10min；

(5)退火后自然降温至室温，进行高分辨率熔解曲线分析，鉴定待测样本中基因型：

a)利用内标的熔解曲线对所有待测样本的熔解曲线进行校正；

b)对校正后的所有待测样本熔解曲线进行分群，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度大于77.5℃时SNP基因型为CC，当熔解曲线求导后为单峰且峰值对应横坐标温度小于77.5℃时SNP基因型为TT，当熔解曲线求导后为双峰时SNP基因型为TC。

c)判断每个待测样本所述长牡蛎SNP标记基因型。

3.按照如权利要求2所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：

所述步骤(4)中，内标为等量混合的高温内标和低温内标，即两条具有不同GC含量的双链寡核苷酸，高、低温内标终浓度分别为2.5uM。

4.按照如权利要求3所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：

SNP基因型鉴定时所需的高、低内标序列，其中，

高温内标序列为：

低温内标序列为：

5.按照如权利要求3所述的筛选高糖原含量长牡蛎亲贝的方法，其特征在于：

获得内标的具体方法为：

1)委托公司合成四条寡核苷酸单链：

GWNB+：5’-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3’

GWNB-：5’-CGCCAGTCAGCCGGATCGCCATCGGTCGACGCCGTGACGCACTGCGAGTC-3’

DWNB+：5’-ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3’

DWNB-：5’-TAGCACTAAAGATATCAATAGATTCATCAACCGTAATTATTAAAGTAAAA-3’

2)用灭菌双蒸水溶解四条单链核苷酸使终浓度为10uM；

3)等体积混合四条单链核苷酸，得到高、低温内标终浓度分别为2.5uM的内标。