CN107746896B - 与桃果皮绒毛性状相关的snp标记及其应用 - Google Patents

与桃果皮绒毛性状相关的snp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与桃果皮绒毛性状相关的SNP标记及其应用。本发明提供了三个与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记及成套的KASP引物组合，可用于桃育种材料果皮性状及果实油桃和毛桃表型的快速鉴定。本发明的鉴定方法成本低、结果准确可靠、操作简单周期短，利于大样本量的检测，在桃新品种的果实绒毛性状及果实油桃和毛桃表型的预测上有重要的意义，能有效提升桃育种效率和准确性。

Description

与桃果皮绒毛性状相关的SNP标记及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体的说，涉及与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
桃(Prunus persica)是我国重要的果树类型之一，近年来随着育种技术的提升，越来越多的新品种育成并成功投放到市场上，一方面满足了人们日益增长的品质需求，更重要的是带来了可观的经济和社会效益。油桃品种起源于中国的西北部，由于其没有表皮的绒毛，可溶性固形物、可滴定酸的含量、去皮硬度、抗旱性、抗紫外辐射等性状都有所提升，因此油桃新品种已经成为桃育种研究的重要方向，利用油桃改善果实的品质和风味已经成为有效的手段。
近年来分子标记辅助育种技术不断用于桃的研究，遗传图谱定位、全基因组关联分析、混池测序分析、转录组分析等手段不断用于桃的性状定位研究，结果表明桃果皮的绒毛是单基因调控的性状，无毛是由隐性基因控制的，且是微小的结构变异导致，但是其机理还是不甚清楚，对于油桃品种的选育，也发展了部分的SSR、SNP等分子标记，其中SSR分子标记位点少、预测准确度低、实验繁琐；SNP分子标记由于遗传稳定、密度高等优点虽然是被认为分子标记辅助育种最有前景的标记，但是在桃表型性状关联上都是单个标记，对于表型的预测效率及准确性低。随着桃SNP分型的高通量测序技术的发展及高密度基因芯片的普及及应用，运用组合的SNP分子标记用于桃果实的表型鉴定的技术成为可能。其中，KASP(Kompetitive Allele Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)可以对基因组DNA的SNP和InDel进行精准的双等位基因分型，该技术具有成本低、高通量、速度快、灵敏度高、周期短等优点，使得其成为针对少量位点多个样本进行现代农业分子育种的有效手段。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质的新用途。
本发明提供了检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃中的应用。
本发明还提供了检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的产品中的应用。
本发明还提供了检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状中的应用。
本发明还提供了检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的方法包括如下步骤：
1)检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型，分别根据每个所述位点的基因型判断所述待测桃树的果实为油桃还是毛桃：
若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实为毛桃；
2)根据三个所述位点的基因型判断待测桃树的果实为油桃还是毛桃：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，若至少两个所述位点判断所述待测桃树果实为油桃，则该待测桃树的果实为或候选为油桃，否则该待测桃树果实为或候选为毛桃。
本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的方法包括如下步骤：
1)检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型，分别根据每个所述位点的基因型判断所述待测桃树的果实是否有绒毛：
若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实有绒毛；
2)根据三个所述位点的基因型判断待测桃树的果实为油桃还是毛桃：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，若至少两个所述位点判断所述待测桃树果实没有绒毛，则该待测桃树果实没有或候选没有绒毛，否则该待测桃树果实有或候选有绒毛。
上述方法中，所述检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的方法如下：以所述待测桃树的基因组DNA为模板，采用成套KASP引物组合进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判断各个位点的基因型；
所述成套KASP引物组合由检测g.13627556位点的引物组、检测g.16646429位点的引物组和检测g.16980999位点的引物组组成；
所述检测g.13627556位点的引物组由上游引物H1-fam-F、上游引物H1-hex-F及下游引物H1-R组成；所述上游引物H1-fam-F自5’端到3’端依次为标签序列A和序列1第22-53位所示的单链DNA；所述上游引物H1-hex-F自5’端到3’端依次为标签序列B和序列2第22-54位所示的单链DNA；所述下游引物H1-R为序列3所示的单链DNA；
所述检测g.16646429位点的引物组由上游引物H2-fam-F、上游引物H2-hex-F及下游引物H2-R组成；所述上游引物H2-fam-F自5’端到3’端依次为标签序列A和序列4第22-42位所示的单链DNA；所述上游引物H2-hex-F自5’端到3’端依次为标签序列B和序列5第22-44位所示的单链DNA；所述下游引物H2-R为序列6所示的单链DNA；
所述检测g.16980999位点的引物组由上游引物H3-fam-F、上游引物H3-hex-F及下游引物H3-R组成；所述上游引物H3-fam-F自5’端到3’端依次为标签序列A和序列7第22-47位所示的单链DNA；所述上游引物H3-hex-F自5’端到3’端依次为标签序列B和序列8第22-51位所示的单链DNA；所述下游引物H3-R为序列9所示的单链DNA。
上述方法中，所述标签序列A为序列1第1-21位所示的单链DNA；所述标签序列B为序列表中序列2第1-21位所示的单链DNA。
上述方法中，所述上游引物H1-fam-F为序列1所示的单链DNA；
所述上游引物H1-hex-F为序列2所示的单链DNA；
所述下游引物H1-R为序列3所示的单链DNA；
所述上游引物H2-fam-F为序列4所示的单链DNA；
所述上游引物H2-hex-F为序列5所示的单链DNA；
所述下游引物H2-R为序列6所示的单链DNA；
所述上游引物H3-fam-F为序列7所示的单链DNA；
所述上游引物H3-hex-F为序列8所示的单链DNA；
所述下游引物H3-R为序列9所示的单链DNA。
上述方法中，利用KrakenTM软件根据所述荧光信号判断各个位点的基因型；所述判断方法为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TT；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC；
(a2)若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TT；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG；
(a3)若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为CC；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经KrakenTM软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC。
本发明的第四个目的是提供如下(b1)-(b3)任一所述的产品：
(b1)上述成套KASP引物组合；
(b2)含有(b1)所述的PCR试剂；
(b3)含有(b1)所述的成套KASP引物组合或(b2)所述的PCR试剂的试剂盒。
上述产品中，所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A为与所述标签序列A一致的序列，5’末端连接1个荧光基团A；所述淬灭探针A为所述标签序列A的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团；
所述荧光探针B为与所述标签序列B一致的序列，5’末端连接1个荧光基团B；所述淬灭探针B为所述标签序列B的反向互补序列，3’末端连接淬灭基团。
上述产品中，所述荧光报告基团A为fam；所述荧光报告基团B为hex；所述荧光淬灭基团为bhq。
本发明的第五个目的是提供上述方法或上述产品的新用途。
本发明提供了上述方法或上述产品在如下(c1)-(c10)中任一种中的应用：
(c1)鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状；
(c2)制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的产品；
(c3)鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃；
(c4)制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的产品；
(c5)选育果实为毛桃或果实有绒毛的桃树；
(c6)制备选育果实为毛桃或果实有绒毛的桃树的产品；
(c7)选育果实为油桃或果实没有绒毛的桃树；
(c8)制备选育果实为油桃或果实没有绒毛的桃树的产品；
(c9)桃树育种；
(c10)制备桃树育种的产品。
本发明的最后一个目的是提供如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)所述的方法：
(d1)选育果实为油桃的桃树的方法，包括选择满足如下条件的桃树进行育种的步骤：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，至少两个所述位点判断桃树果实为油桃；根据所述位点判断桃树果实为油桃还是毛桃的方法如下：
若待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实为毛桃；
(d2)选育果实为毛桃的桃树的方法，包括选择不满足(d1)中所述条件的桃树进行育种的步骤；
(d3)选育果实没有绒毛的桃树的方法，包括选择满足如下条件的桃树进行育种的步骤：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，至少两个所述位点判断桃树果实没有绒毛；根据所述位点判断桃树果实是否有绒毛的方法如下：
若待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实有绒毛；
(d4)选育果实有绒毛的桃树的方法，包括选择不满足(d3)中所述条件的桃树进行育种的步骤；
所述g.13627556位点为5号染色体的第13627556位；
所述g.16646429位点为5号染色体的第16646429位；
所述g.16980999位点为5号染色体的第16980999位。
上述应用或方法或产品中，所述果实绒毛性状为果皮绒毛性状；果皮表面有绒毛的为毛桃，果皮表面没有绒毛的为油桃。
上述应用或方法或产品中，
所述g.13627556位点为桃基因组5号染色体的第13627556位，也即为序列10第21位；所述g.16646429位点为桃基因组5号染色体的第16646429位，也即为序列11第21位；所述g.16980999位点为桃基因组5号染色体的第16980999位，也即为序列12第21位。所述桃树基因组的版本号为Prunus_persica-genome.v1.0，下载的地址为ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0。
本发明提供了三个与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记及成套的KASP引物组合，可用于桃育种材料果皮性状及果实油桃和毛桃表型的快速鉴定，本发明的检测方法的检测成本低、结果准确可靠、操作简单周期短，利于大样本量的检测，在桃新品种的果实绒毛性状及果实油桃和毛桃表型的预测上有重要的意义，能有效提升桃育种效率和准确性。
附图说明
图1为本发明实施例2中H1标记位点的KASP分子标记在23份桃样本中的SNP分型结果图。其中CT为绿色，CC为蓝色，TT为红色，黑色(NTC)为空白对照。
图2为本发明实施例2中H2标记位点的KASP分子标记在23份桃样本中的SNP分型结果图。其中GT为绿色，GG为蓝色，TT为红色，黑色(NTC)为空白对照。
图3为本发明实施例2中H3标记位点的KASP分子标记在23份桃样本中的SNP分型结果图。其中CT为绿色，CC为蓝色，TT为红色，黑色(NTC)为空白对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记及成套KASP引物组合的开发
一、与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记
1、与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记
本发明提供了3个与桃果皮绒毛性状相关的SNP分子标记，3个SNP标记均位于桃参考基因组(版本号为Prunus_persica-genome.v1.0，下载的地址为ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Prunus_persica/Prunus_persica-genome.v1.0)的5号染色体上，分别将其命名为SNP分子标记H1、SNP分子标记H2和SNP分子标记H3。其中，SNP分子标记H1位于桃参考基因组5号染色体的第13627556位(g.13627556)，等位变异碱基为C或T；SNP分子标记H2位于桃参考基因组5号染色体的第16646429位(g.16646429)，等位变异碱基为G或T；SNP分子标记H3位于桃参考基因组5号染色体的第16980999位(g.16980999)，等位变异碱基为C或T(表1)。
对于SNP分子标记H1位点，将g.13627556位点的核苷酸均为T的桃树的基因型命名为TT基因型，将g.13627556位点的核苷酸均为C的桃树的基因型命名为CC基因型，将g.13627556位点的核苷酸均为T和C的桃树的基因型命名为TC基因型。
对于SNP分子标记H2位点，将g.16646429位点的核苷酸均为G的桃树的基因型命名为GG基因型，将g.16646429位点的核苷酸均为T的桃树的基因型命名为TT基因型，将g.16646429位点的核苷酸均为T和G的桃树的基因型命名为TG基因型。
对于SNP分子标记H3位点，将g.16980999位点的核苷酸均为T的桃树的基因型命名为TT基因型，将g.16980999位点的核苷酸均为C的桃树的基因型命名为CC基因型，将g.16980999位点的核苷酸均为T和C的桃树的基因型命名为TC基因型。
表1、SNP分子标记信息及其KASP引物序列信息
Figure BDA0001479244860000071
Figure BDA0001479244860000081
注：斜体字母为fam荧光序列和hex荧光序列；加粗碱基为等位变异碱基
2、探针序列
根据步骤1中的3个SNP标记在参考基因组上的物理位置，分别提取上下游20bp的序列，分别得到探针序列H1、探针序列H2和探针序列H3，序列信息如下(方括号内为等位变异碱基)：
探针序列H1：AATCATGATATAGTAATTAT[C/T]TTTTTAAGTAACAGAAGATT(序列10)；
探针序列H2：AGCACAAGGATTCAATAAAA[G/T]AACAGAACAGCTGGCTTGGG(序列11)；
探针序列H3：ATATTGTTTGGCCTTGTTTC[C/T]GTCTTAAAGGACGTGACTTT(序列12)。
二、成套KASP引物组合的开发
根据步骤一中的SNP分子标记的探针序列，利用KrakenTMsoftware system软件开发用于检测SNP分子标记的KASP引物。每个标记有三条引物，SNP分子标记的上游有两条正向引物，5’端分别连接fam荧光序列和hex荧光序列(fam荧光序列：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；hex荧光序列：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’)，3′端为等位变异碱基；下游有一条反向引物，引物序列如表1所示。上述引物均由艾吉析科技(上海)有限公司合成。
针对SNP分子标记H1设计的KASP引物组合H1由上游引物H1_fam-F和H1_hex-F及下游引物H1_R组成。
针对SNP分子标记H2设计的KASP引物组合H2由上游引物H2_fam-F和H2_hex-F及下游引物H2_R组成。
针对SNP分子标记H3设计的KASP引物组合H3由上游引物H3_fam-F和H3_hex-F及下游引物H3_R组成。
用于检测桃果皮绒毛性状的成套KASP引物组合由KASP引物组合H1、KASP引物组合H2和KASP引物组合H3组成。
三、基于成套KASP引物组合预测桃果皮绒毛性状及油桃还是毛桃表型的方法
1、检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型；分别根据每个位点的基因型判断待测桃树的果实为油桃还是毛桃，判断方法如下：
若待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树果实为油桃(果皮没有绒毛)，若待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实为毛桃(果皮有绒毛)；
若待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树果实为油桃(果皮没有绒毛)，否则为毛桃(果皮有绒毛)；
若待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树果实为油桃(果皮没有绒毛)，否则为毛桃(果皮有绒毛)；
2、根据三个位点的基因型判断待测桃树果实为油桃还是毛桃：
若至少两个上述位点判断待测桃树果实为油桃，则该待测桃树果实为或候选为油桃(果皮没有绒毛)，否则该待测桃树果实为或候选为毛桃(果皮有绒毛)。
实施例2、成套KASP引物组合在鉴定桃果皮绒毛性状及油桃和毛桃表型中的应用
一、样本的收集
本发明的待测样本采集于国家果树种质北京桃和草莓圃资源的23株不同品种桃树的幼叶组织，采集后放置于锡箔纸中，于80℃冰箱内保存备用。
二、表型鉴定
表型鉴定按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T 2341-2013)——《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南桃》进行，本发明对此不另做限定。
在果实的成熟期，采用群体目测的方法进行果面绒毛性状的测定，果面有绒毛的为毛桃，果面完全没有绒毛的为油桃。
三、采用KASP技术进行SNP分子标记位点基因分型
1、提取基因组DNA
采用CATB方法提取基因组总DNA。具体方法如下：
1)新鲜叶片于2ml EP管中液氮研磨；
2)水浴65℃预热DNA提取液；
3)每管加入600μl提取液，10μlβ-巯基乙醇，2μl蛋白酶K，混匀；
4)65℃水浴加热，期间每10min温和混匀一次，40min后取出，室温冷却10min；
5)加入600μl酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，剧烈震荡混匀，静置2-3min；
6)12000rpm，离心10min，上清液移入新管中；
7)重复5)，6)步骤；
8)加入2/3体积的异丙醇，混匀，-20℃放置大于30min；
9)4℃12000rpm，离心20min；
10)加200μl TE重溶，加2μl RNase A，37℃水浴30min；
11)加200μl氯仿：异戊醇(24：1)混匀，12000rpm，离心10min；
12)上清移入新管中，加100μl 7.5M乙酸铵，混匀，加400μl无水乙醇，混匀，-20℃放置大于30min；
13)4℃12000rpm，离心20min；
14)70％乙醇洗涤3次，晾干；
15)加50μl TE重溶。
500ml提取液配方10g CTAB，50ml 1M Tris.HCl(pH8.0)，20ml 0.5M EDTA，140ml5M NaCl和290ml H2O组成。
2、PCR扩增
PCR扩增反应在LGC SNPline基因分型平台上进行，其配套试剂均由英国LGC公司生产。以步骤1中提取的基因组DNA为模板，加入实施例1中的开发的KASP Primer mix(KASP引物组合H1或KASP引物组合H2或KASP引物组合H3)和通用的KASP Master mix进行PCR扩增。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性60s(第一次的复性温度为61℃，每个循环降温0.6℃)，共10个循环；94℃变性20s，55℃复性60s，共27个循环；10℃保存。
PCR反应体系如表2所示。其中，KASP Primer mix中，两条上游引物和下游引物稀释到10μM，并按体积比为12:12:30的比例混合。2×KASP Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团fam；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团bhq；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团bhq。
表2、PCR反应体系
DNA(20ng/μL) 1μL
2×KASP Master mix 1μL
KASP Primer mix 1μL
Total volume 3μL
3、采用KASP技术进行SNP分子标记位点基因分型
采用荧光检测仪PHERAstar检测PCR扩增产物的荧光信号，fam激发波长为485nm，发射波长为520nm，hex激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm。
利用KrakenTM软件(具体操作参见软件说明书)根据荧光信号进行SNP分子标记位点的基因分型。其中，显示为蓝色的样本基因型为fam荧光标签序列的基因型，绿色的样本基因型为杂合型基因型，红色的样本基因型为hex荧光标签序列的基因型，黑色的样本为空白对照，23个待检测样本在三个SNP位点的分型结果分别如图1、图2和图3所示。23份桃不同品种的材料的基因分型结果如表3所示。
对于SNP分子标记H1位点，从检测结果可以看出：23个桃品种中，共有8个品种的基因型为CC，2个品种的基因型为TC，13个品种的基因型为TT。
对于SNP分子标记H2位点，从检测结果可以看出：23个桃品种中，共有9个品种的基因型为GG，2个品种的基因型为TG，12个品种的基因型为TT。
对于SNP分子标记H3位点，从检测结果可以看出：23个桃品种中，共有10个品种的基因型为TT，3个品种的基因型为TC，10个品种的基因型为CC。
表3、3个SNP分子标记的KASP分型结果及表型预测结果
Figure BDA0001479244860000111
Figure BDA0001479244860000121
四、3个SNP分子标记的基因型与桃果皮绒毛性状的相关性分析
1、用SNP分子标记H1进行桃果皮绒毛性状预测
用SNP分子标记H1根据g.13627556位点的基因型按照实施例1步骤三中的1所述方法对桃果皮绒毛性状进行预测，预测的结果如表3中的“SNP标记单位点预测表型”中的H1所示。
用SNP分子标记H1进行桃果皮绒毛性状预测时，实际表型为毛桃的10份材料中，2个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，8个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为80％；实际表型为油桃的13份材料中，0个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，13个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为100％。
2、用SNP分子标记H2进行桃果皮绒毛性状预测
用SNP分子标记H2根据g.16646429位点的基因型按照实施例1步骤三中的1所述方法对桃果皮绒毛性状进行预测，预测的结果如表3中的“SNP标记单位点预测表型”中的H2所示。
用SNP分子标记H2进行桃果皮绒毛性状预测时，实际表型为毛桃的10份材料中，1个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，9个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为90％；实际表型为毛桃的13份材料中，0个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，13个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为100％。
3、用SNP分子标记H3进行桃果皮绒毛性状预测
用SNP分子标记H3根据g.16980999位点的基因型按照实施例1步骤三中的1所述方法对桃果皮绒毛性状进行预测，预测的结果如表3中的“SNP标记单位点预测表型”中的H3所示。
用SNP分子标记H3进行桃果皮绒毛性状预测时，实际表型为毛桃的10份材料中，1个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，9个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为90％；实际表型为油桃的13份材料中，0个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，13个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为100％。
4、用SNP分子标记H1、H2、H3同时进行桃果皮绒毛性状预测
用SNP分子标记H1、H2、H3根据g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型按照实施例1步骤三中所述方法对桃果皮绒毛性状进行预测，预测的结果如表3中的“组合SNP标记预测表型”所示。
用SNP分子标记H1、H2、H3同时进行桃果皮绒毛性状预测时，实际表型为毛桃的10份材料中，1个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，9个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为90％；实际表型为油桃的13份材料中，0个样本的基因型预测结果和实际表型不一致，13个样本基因型预测结果和实际表型一致，基因型与表型数据的一致性为100％。
综上所述，本发明的基于成套KASP引物组合鉴定桃果皮绒毛性状或果实为毛桃还是油桃的效果高于单个SNP分子标记的预测准确性，可直接用于鉴定或辅助鉴定待测桃果皮绒毛性状或待测桃树的果实为毛桃还是油桃，且本发明提供的3个分子标记准确、高效、可靠，检测方法具有高度可行性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但是在本发明的基础上，可以对之作一些修改或者改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的这些修改或者改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京农林科学院
<120>与桃果皮绒毛性状相关的SNP标记及其应用
<160>12
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gaaggtgacc aagttcatgc tgacagaggt aaaatcatga tatagtaatt atc 53
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
gaaggtcgga gtcaacggat tagacagagg taaaatcatg atatagtaat tatt 54
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
tacggtcatc cataatcatc agaaactaaa 30
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
gaaggtgacc aagttcatgc tcccaagcca gctgttctgt tc 42
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gaaggtcgga gtcaacggat tatcccaagc cagctgttct gtta 44
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
gatagcaaaa cagcacaagg attcaataaa 30
<210>7
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
gaaggtgacc aagttcatgc tttgataaag tcacgtcctt taagacg 47
<210>8
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
gaaggtcgga gtcaacggat taaatttgat aaagtcacgt cctttaagac a 51
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
ttgctgtttt catattgttt ggccttgttt 30
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<213>n=c 或t
<400>10
aatcatgata tagtaattat ntttttaagt aacagaagat t 41
<210>11
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<213>n=g或t
<400>11
agcacaagga ttcaataaaa naacagaaca gctggcttgg g 41
<210>12
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<213>n=c 或t
<400>12
atattgtttg gccttgtttc ngtcttaaag gacgtgactt t 41

Claims (11)

1.检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃中的应用；
或，检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的产品中的应用；
所述g.13627556位点为桃基因组5号染色体的第13627556位，多态性类型为C/T；
所述g.16646429位点为桃基因组5号染色体的第16646429位，多态性类型为G/T；
所述g.16980999位点为桃基因组5号染色体的第16980999位，多态性类型为C/T。
2.检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状中的应用；
或，检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的产品中的应用；
所述g.13627556位点为桃基因组5号染色体的第13627556位，多态性类型为C/T；
所述g.16646429位点为桃基因组5号染色体的第16646429位，多态性类型为G/T；
所述g.16980999位点为桃基因组5号染色体的第16980999位，多态性类型为C/T。
3.一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的方法，包括如下步骤：
1）检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型，分别根据每个所述位点的基因型判断所述待测桃树的果实为油桃还是毛桃：
若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实为毛桃；
2）根据三个所述位点的基因型判断待测桃树的果实为油桃还是毛桃：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，若至少两个所述位点判断所述待测桃树果实为油桃，则该待测桃树的果实为或候选为油桃，否则该待测桃树果实为或候选为毛桃。
4.一种鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的方法，包括如下步骤：
1）检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型，分别根据每个所述位点的基因型判断所述待测桃树的果实是否有绒毛：
若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实有绒毛；
2）根据三个所述位点的基因型判断待测桃树的果实为油桃还是毛桃：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，若至少两个所述位点判断所述待测桃树果实没有绒毛，则该待测桃树果实没有或候选没有绒毛，否则该待测桃树果实有或候选有绒毛。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
所述检测待测桃树基因组的g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点的基因型的方法如下：以所述待测桃树的基因组DNA为模板，采用成套KASP引物组合进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，根据所述荧光信号判断各个位点的基因型；
所述成套KASP引物组合由检测g.13627556位点的引物组、检测g.16646429位点的引物组和检测g.16980999位点的引物组组成；
所述检测g.13627556位点的引物组由上游引物H1-fam-F、上游引物H1-hex-F及下游引物H1-R组成；所述上游引物H1-fam-F自5’端到3’端依次为标签序列A和序列1第22-53位所示的单链DNA；所述上游引物H1-hex-F自5’端到3’端依次为标签序列B和序列2第22-54位所示的单链DNA；所述下游引物H1-R为序列3所示的单链DNA；
所述检测g.16646429位点的引物组由上游引物H2-fam-F、上游引物H2-hex-F及下游引物H2-R组成；所述上游引物H2-fam-F自5’端到3’端依次为标签序列A和序列4第22-42位所示的单链DNA；所述上游引物H2-hex-F自5’端到3’端依次为标签序列B和序列5第22-44位所示的单链DNA；所述下游引物H2-R为序列6所示的单链DNA；
所述检测g.16980999位点的引物组由上游引物H3-fam-F、上游引物H3-hex-F及下游引物H3-R组成；所述上游引物H3-fam-F自5’端到3’端依次为标签序列A和序列7第22-47位所示的单链DNA；所述上游引物H3-hex-F自5’端到3’端依次为标签序列B和序列8第22-51位所示的单链DNA；所述下游引物H3-R为序列9所示的单链DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述标签序列A为序列1第1-21位所示的单链DNA；所述标签序列B为序列表中序列2第1-21位所示的单链DNA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述上游引物H1-fam-F为序列1所示的单链DNA；
所述上游引物H1-hex-F为序列2所示的单链DNA；
所述下游引物H1-R为序列3所示的单链DNA；
所述上游引物H2-fam-F为序列4所示的单链DNA；
所述上游引物H2-hex-F为序列5所示的单链DNA；
所述下游引物H2-R为序列6所示的单链DNA；
所述上游引物H3-fam-F为序列7所示的单链DNA；
所述上游引物H3-hex-F为序列8所示的单链DNA；
所述下游引物H3-R为序列9所示的单链DNA；
或，利用Kraken™软件根据所述荧光信号判断各个位点的基因型；所述判断方法为如下（a1）或（a2）或（a3）：
（a1）若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TT；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC；
（a2）若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TT；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG；
（a3）若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现蓝色，则所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现红色，则所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为CC；若所述待测桃树的扩增产物的荧光信号数据经Kraken™软件分析呈现绿色，则所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC。
8.如下（b1）-（b3）任一所述的产品：
（b1）权利要求5中所述的成套KASP引物组合；
（b2）含有（b1）所述的成套KASP引物组合的 PCR试剂；
（b3）含有（b1）所述的成套KASP引物组合或（b2）所述的PCR试剂的试剂盒。
9.权利要求要求8所述的产品在如下（c1）-（c10）中任一种中的应用：
（c1）鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状；
（c2）制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状的产品；
（c3）鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃；
（c4）制备鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃的产品；
（c5）选育果实为毛桃或果实有绒毛的桃树；
（c6）制备选育果实为毛桃或果实有绒毛的桃树的产品；
（c7）选育果实为油桃或果实没有绒毛的桃树；
（c8）制备选育果实为油桃或果实没有绒毛的桃树的产品；
（c9）桃树育种；
（c10）制备桃树育种的产品。
10.权利要求3-7任一所述的方法在如下（c1）或（c3）或（c5）或（c7）或（c9）中任一种中的应用：
（c1）鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实绒毛性状；
（c3）鉴定或辅助鉴定待测桃树的果实为油桃还是毛桃；
（c5）选育果实为毛桃或果实有绒毛的桃树；
（c7）选育果实为油桃或果实没有绒毛的桃树；
（c9）桃树育种。
11.如下（d1）或（d2）或（d3）或（d4）所述的方法：
（d1）选育果实为油桃的桃树的方法，包括选择满足如下条件的桃树进行育种的步骤：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，至少两个所述位点判断桃树果实为油桃；根据所述位点判断桃树果实为油桃还是毛桃的方法如下：
若待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实为毛桃；
若待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实为油桃，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实为毛桃；
（d2）选育果实为毛桃的桃树的方法，包括选择满足如下条件的桃树进行育种的步骤：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，仅有一个所述位点或没有所述位点判断桃树果实为油桃；根据所述位点判断桃树果实为油桃还是毛桃的方法如（d1）所述；
（d3）选育果实没有绒毛的桃树的方法，包括选择满足如下条件的桃树进行育种的步骤：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，至少两个所述位点判断桃树果实没有绒毛；根据所述位点判断桃树果实是否有绒毛的方法如下：
若待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为CC，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.13627556位点的基因型为TC或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为GG，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16646429位点的基因型为TG或TT，则该待测桃树的果实有绒毛；
若待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TT，则该待测桃树的果实没有绒毛，若所述待测桃树基因组的g.16980999位点的基因型为TC或CC，则该待测桃树的果实有绒毛；
（d4）选育果实有绒毛的桃树的方法，包括选择满足如下条件的桃树进行育种的步骤：在g.13627556位点、g.16646429位点和g.16980999位点中，仅有一个所述位点或没有所述位点判断桃树果实没有绒毛；根据所述位点判断桃树果实是否有绒毛的方法如（d3）所述；
所述g.13627556位点为桃基因组5号染色体的第13627556位；
所述g.16646429位点为桃基因组5号染色体的第16646429位；
所述g.16980999位点为桃基因组5号染色体的第16980999位。
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