CN108424958A - 一种大黄鱼遗传性别相关的snp标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大黄鱼遗传性别相关的SNP标记及其引物和应用。大黄鱼遗传性别相关的SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第201位碱基是T或C。当所述SNP标记为CC基因型的个体为雌性大黄鱼，SNP标记为CT基因型的个体为雄性大黄鱼。通过鉴别该分子标记，具有快速、简便、准确鉴别大黄鱼遗传性别的特点，同时也为顺利开展大黄鱼的性别控制育种工作、发展单性养殖，以及开展大黄鱼基因组选择育种和性别决定分子机制研究建立基础。

Description

一种大黄鱼遗传性别相关的SNP标记及其引物和应用

技术领域

本发明涉及SNP领域，尤其涉及一种大黄鱼遗传性别相关的SNP标记及其引物和应用

背景技术

在生命科学研究领域，性别研究一直是一个热点命题，吸引着众多研究者的关注。鱼类在动物进化中处于承前启后的地位，且物种数量丰富。同大多数脊椎动物类似，不少鱼类也是雌雄异体，具有性别二态性，即在形态和生理上表现出显著的雌雄两性差异。而且，一些鱼类物种的个体生长等重要经济性状及经济价值与性别密切相关。因此，开发这些鱼类的单性育种与养殖技术在鱼类养殖产业上具有重大的意义。许多鱼类尽管在生长上存在性别二态性，但在外部形态上雌雄鱼却没有显著差异，尤其是在性腺尚未发育成熟时，其性别往往难以区分；甚至有一些鱼类存在天然的性反转现象，在不同的环境或者通过人工诱导可以改变其生理性别，但性别改变前后没有形态上的差异，无法通过外部形态识别其遗传性别。这些问题的存在给单性育种、基因组选择育种、养殖及相关的遗传学基础研究带来很大的困扰，尤其是性别决定分子机制研究。因此，针对这些鱼类物种开发可以准确鉴定其遗传性别的分子标记，不仅对这些鱼类遗传学相关的研究，而且对开展单性育种、基因组选择育种与养殖从而提高鱼产量、增加水产养殖收益都有着非常重要的意义。

大黄鱼(Larimichthys crocea)隶属脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，分布于东亚沿海，兼具食用和药用价值。大黄鱼具有显著的雌雄生长二态性，同时期的大黄鱼雌鱼生长速度显著快于雄鱼，且达到成熟时的雌鱼个体较雄鱼个体大，开发大黄鱼单性育种及单性养殖技术具有重要的产业意义。但在性腺发育成熟之前，很难从外部形态上加以区分雌鱼和雄鱼，胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上几乎没有区别；据已有的研究表明，大黄鱼不存在异形性染色体，也无法从细胞学角度鉴定其遗传性别；这给其单性育种技术的开发带来了很大困难，也给大黄鱼基因组选择育种中分别计算雌雄候选亲本数量性状的基因组育种值带来了困难，也阻碍了需要在性腺发育分化之前进行遗传性别识别的性别决定分子机制研究的开展。因此，开发一种可以准确鉴别其遗传性别的分子标记用于大黄鱼性别控制育种具有极大的生产应用价值，对于大黄鱼基因组选择育种和性别决定分子机制的研究也将起到促进作用。

随着分子生物学技术的发展，目前已有多种类型的DNA分子标记技术，其中主要包括：(1)限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)；(2)随机扩增多态性DNA(RandomAmplification Polymorphism DNA，RAPD)；(3)扩增片段长度多态性(AmplifiedFragment Length polymorphism，AFLP)；(4)微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STRs)或简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)；(5)单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)。利用上述DNA分子标记技术，已经有许多物种的性别特异的分子标记被开发出来，但不同物种其基因组DNA序列结构不同，没有一个物种的性别特异分子标记可以被用于对其他物种的遗传性别进行鉴定，只能针对不同物种分别进行开发。中国专利申请CN201710576189.2利用的是Y染色体上Dmrt1基因内含子中的一个15bp的缺失作为分子标记来鉴定(鉴别)大黄鱼遗传性别。但在实际引用中，偶尔存在个别个体扩增效果不好、难以判别遗传性别的现象。

等位基因特异性扩增(Allele-Specific PCR,AS-PCR)，又称为扩增阻滞突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)，是SNP检测和分型常用的方法。其基本原理是利用普通TaqDNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶的活性，不能修复DNA引物在3’末端单个碱基的错配，因而当引物的3’端核苷酸与SNP等位基因序列互补时，DNA模板得以扩增，反之，如果3’端核苷酸与SNP等位基因序列发生错配时，则模板不被扩增或扩增效率低下。其中，每个SNP位点的检测，都需要根据SNP位点的等位基因组成来设计特异性的引物，其中一条链(普通链)按常规方法来设计，而另一条链(特异链)的3’端与SNP位点处的碱基互补或相同。利用特异引物有无扩增产物和条带的大小，通过琼脂糖凝胶电泳等方法即可鉴定出SNP的基因型。AS-PCR技术的特点是针对已知的不同的SNPs，设计合适的引物，通过PCR和电泳图直接实现区分野生型和突变型的目的，且过程操作简单，简洁快速，费用较为低廉。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记，通过鉴别该分子标记，可快速、简便、准确鉴别大黄鱼遗传性别，同时也为顺利开展大黄鱼的性别控制育种工作、发展单性养殖，以及开展大黄鱼基因组选择育种和性别决定分子机制研究建立基础。

为实现上述目的，本发明提供一种大黄鱼遗传性别相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第201位碱基是T或C。

进一步，所述SNP标记为CC基因型的个体为雌性大黄鱼，SNP标记为CT基因型的个体为雄性大黄鱼。

本发明还提供一种用于检测所述的SNP标记的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。

本发明还提供一种用于检测所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含所述的引物组。

本发明还提供所述的SNP标记，所述的引物组或所述的试剂盒在鉴别大黄鱼遗传性别中的用途。

本发明还提供一种鉴别大黄鱼遗传性别的方法，其特征在于，通过对待测大黄鱼进行所述的SNP标记的检测，确定所述待测大黄鱼的遗传性别。

进一步，通过对待测大黄鱼进行所述的SNP标记的检测，确定所述待测大黄鱼的遗传性别；进一步包括：

提取待测大黄鱼的基因组DNA；

利用所述的引物组，将所述待测大黄鱼的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据PCR扩增条带的数目及大小来确定大黄鱼的遗传性别。

进一步，所述PCR扩增条带为大小分别为348bp和194bp的两条条带，则所述SNP标记为CT基因型，该个体为遗传雄性大黄鱼；所述PCR扩增条带为大小348bp的一条条带时，SNP标记为CC基因型，该个体为遗传雌性大黄鱼。

本发明涉及到的序列如下：

TGACCCCCAAGATAATTCCCATAATCCATATCTGTCAACCACTGTATCATCTGCTCCAGT

CATACAGACAGGTCATAGCTTCCCATCACCTGATCTGCCGCTTCCAGCCTCTGATCCAAC

TCTCACACTGAACCCTTACTCCACCCCCATCACATCCCTACCTCCCAGGTGTCAGTCACA

TCCCATCCCCAGACCTCCAC(C/T)CATTCCCCTTCAGTCTCAGTGCTTAGAGGAGACCTGTCC

TGACCTGGAGTGCGCCATCTGCTTCAGCCAGTTCAATAATGTCTTCCGCTGTCCCAAGAT

GCTTCAATGCAAGCACACGTTCTGCCTGGAGTGCCTGGCACGTATGAACGTCAAGTCAGC

TCAGCCAAACGCCATCCAGTGCCCACTGTGCCGCGGCTTCA SEQ ID NO:1

LYC-SSS1F:5' ATCTGTCAACCACTGTATCATCTG 3' SEQ ID NO:2；

LYC-SSS1R:5' GGATGGCGTTTGGCTGAG 3' SEQ ID NO:3；

LYC-SSS1FT:5' CATCCCCAGACCTCCACT 3' SEQ ID NO:4。

本发明的电泳检测结果，用LYC-SSS1F、LYC-SSS1R和LYC-SSS1FT三条引物同时进行扩增，雄性个体有两条扩增条带，雌性个体只有一条扩增条带。非常容易判断。

本发明与现有的鉴别大黄鱼遗传性别的方法相比，具有明显的优势：只需剪取大黄鱼的部分组织或提取部分血液用来提取基因组DNA，进而从最小程度上减少对鱼体的伤害。然后用所提供的引物，只需要做一次PCR，结合电泳检测，即可快速、准确地鉴定不同生长阶段的大黄鱼不同个体的遗传性别。

附图说明

图1为本发明公开的一处大黄鱼雌雄鱼基因组SNP差异的序列比较及引物设计图。

图2a为实施例1所示15尾雌性大黄鱼所示SNP位点的测序峰图(图中箭头处为SNP位点)。

图2b为实施例1所示15尾雄性大黄鱼所示SNP位点的测序峰图(图中箭头处为SNP位点)。

图3为实施例2的大黄鱼遗传性别鉴定电泳结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：大黄鱼性别特异SNP标记的发现与验证

大黄鱼是二倍体生物且为XX/XY型性别决定系统，雌性为XX，雄性为XY。通过对6组雌雄大黄鱼全基因组重测序数据进行比对分析，结果显示来自雄鱼的序列中在图1所示SNP位点上有T或C两种碱基，来自雌鱼的序列在该位点则不存在SNP多态性，所有序列在该位点的碱基都是C。对6组雌雄大黄鱼全基因组重测序数据中含有该位点的读段(reads)进行统计，结果见表1。

表1大黄鱼6个重测序样本9号连锁群1个SNP位点的基因型

注：大黄鱼6个重测序样本分别为雌鱼混样(50尾雌鱼)、雄鱼混样(50尾雄鱼)混合建库测序，雌1、雌2和雄1、雄2则为单个体测序。

鉴于雄鱼X染色体的序列同于雌鱼两条X染色体的序列，且该SNP只在雄鱼中出现，雌鱼中不出现，推测雄鱼中在该SNP位点上碱基为T的reads可能是来源于雄鱼Y染色体。为了对此进行验证，取养殖大黄鱼通过解剖观察性腺确认其生理性别，然后随机取15尾雄鱼、15尾雌鱼从胸鳍中提取DNA，用LYC-SSS1F和LYC-SSS1R扩增获得含有该SNP位点的序列进行Sanger测序。结果15尾雌鱼在该位点的基因型全部为CC纯合体，如图2a所示；15尾雄鱼在该位点全部表现为C/T杂合体，如图2b所示。由此可见，该SNP位点确实是雄性大黄鱼特有的SNP位点，在该位点碱基为T的序列是雄性大黄鱼所特有，因此是可以识别大黄鱼遗传性别的分子标记。为此，进一步设计了LYC-SSS1FT，配合LYC-SSS1F和LYC-SSS1R用以简便地检测该分子标记。

实施例2、大黄鱼遗传性别的识别与鉴定

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细的说明。

1)引物的设计：根据本发明所公开的一处大黄鱼雌鱼与雄鱼基因组序列(SNP)的差异，分别设计了三条引物LYC-SSS1F、LYC-SSS1R和LYC-SSS1FT。其中，引物LYC-SSS1F和LYC-SSS1R分别在该SNP差异位点的两边，LYC-SSS1FT的3’端碱基与Y染色体上该SNP位点的碱基相一致。请参阅图1。

LYC-SSS1F:5' ATCTGTCAACCACTGTATCATCTG 3' SEQ ID NO:2；

LYC-SSS1R:5' GGATGGCGTTTGGCTGAG 3' SEQ ID NO:3；

LYC-SSS1FT:5' CATCCCCAGACCTCCACT 3' SEQ ID NO:4。

2)基因组DNA的提取：随机剪取48尾待测大黄鱼的部分鳍条，放入95％的酒精溶液中，-20℃保存；利用DNA提取试剂盒分别提取基因组DNA，所得的基因组DNA分别稀释到30ng/μl左右作为模板备用；

3)PCR扩增：引物为LYC-SSS1F、LYC-SSS1R和LYC-SSS1FT，模板为步骤2)中的基因组DNA分别进行PCR扩增。

PCR反应体系：反应总体积为10μl，具体反应体系为：1μl 10×PCRbuffer(含Mg^2﹢)，0.8μl 2.5mM dNTPs，1μl 30ng/μl DNA，浓度为10mΜ的上述三条引物各0.2μl，0.1μl 5u/μl的TaqDNA聚合酶，最后以ddH₂O补齐。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

4)琼脂糖凝胶电泳检测及结果分析。

用LYC-SSS1F、LYC-SSS1R和LYC-SSS1FT同时进行扩增的PCR产物，电泳检测可采用3％的琼脂糖凝胶，电压120V，电流120A，电泳时间60min。该三条引物组合能够在所有雄性个体的基因组DNA中扩增出两条特异条带，一条约348bp，一条约194bp，而在所有雌性个体的基因组DNA中只可以扩增出一条约348bp的特异条带。与实际情况完全一致。如图3所示。说明采用本发明的三条引物能准确的鉴定出大黄鱼的遗传性别，准确度达到100％。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种大黄鱼遗传性别相关的SNP标记及其引物和应用

<130> JMDX-18018-CNI

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> 大黄鱼

<220>

<221> SNP位点

<222> (201)..(201)

<223> X为T或C

<220>

<221> SNP位点

<222> (201)..(201)

<223> c还可以是T

<400> 1

tgacccccaa gataattccc ataatccata tctgtcaacc actgtatcat ctgctccagt 60

catacagaca ggtcatagct tcccatcacc tgatctgccg cttccagcct ctgatccaac 120

tctcacactg aacccttact ccacccccat cacatcccta cctcccaggt gtcagtcaca 180

tcccatcccc agacctccac ccattcccct tcagtctcag tgcttagagg agacctgtcc 240

tgacctggag tgcgccatct gcttcagcca gttcaataat gtcttccgct gtcccaagat 300

gcttcaatgc aagcacacgt tctgcctgga gtgcctggca cgtatgaacg tcaagtcagc 360

tcagccaaac gccatccagt gcccactgtg ccgcggcttc a 401

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atctgtcaac cactgtatca tctg 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggatggcgtt tggctgag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

catccccaga cctccact 18

Claims (8)

1.一种大黄鱼遗传性别相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为SEQ ID NO:1所示序列自5’端起第201位碱基是T或C。

2.如权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记为CC基因型的个体为雌性大黄鱼，SNP标记为CT基因型的个体为雄性大黄鱼。

3.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-4所示。

4.一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的引物组。

5.权利要求1或2所述的SNP标记，权利要求3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在鉴别大黄鱼遗传性别中的用途。

6.一种鉴别大黄鱼遗传性别的方法，其特征在于，通过对待测大黄鱼进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测大黄鱼的遗传性别。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，通过对待测大黄鱼进行权利要求1或2所述的SNP标记的检测，确定所述待测大黄鱼的遗传性别；进一步包括：

提取待测大黄鱼的基因组DNA；

利用权利要求3所述的引物组，将所述待测大黄鱼的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据PCR扩增条带的数目及大小来确定大黄鱼的遗传性别。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增条带为大小分别为348bp和194bp的两条条带，则所述SNP标记为CT基因型，该个体为遗传雄性大黄鱼；所述PCR扩增条带为大小348bp的一条条带时，SNP标记为CC基因型，该个体为遗传雌性大黄鱼。