CN113637765B - 鉴定大口黑鲈遗传性别的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定大口黑鲈遗传性别的分子标记及应用，分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明从大口黑鲈中筛选获得了性别差异的DNA片段，将基因组序列为SEQ ID NO:1的SNP分子标记用于大口黑鲈遗传性别鉴定，并根据差异的片段设计检测引物，从而可以快速、准确的区分大口黑鲈的性别。利用本发明的SNP位点，在生产上可快速对大口黑鲈遗传进行鉴定，在大口黑鲈单性育种方面具有重要的应用价值，同时在定位性别决定基因及性别决定机制研究中也具有重要应用前景。与之前解剖检测或生殖孔观察相比，该技术具有目的性强、准确度高的优点，且操作简单、检测快速，对鱼体伤害少，易于推广。

Description

鉴定大口黑鲈遗传性别的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及鉴定大口黑鲈遗传性别的分子标记及应用。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus Salmodes L.)，俗名加州鲈，原产于北美洲的淡水湖泊和河流，具有无肌间刺、肉质鲜美、生长迅速、养殖周期短等优点。自1983年引入我国后，历经三十余年的发展，现已成为我国重要的淡水养殖品种。近些年其养殖区域呈现由南向北，由沿海向内陆转移的趋势，其中湖南、湖北、河南等地增加最为明显。但在大口黑鲈养殖产业快速发展的同时，也面临一些产业关键问题。在广东地区，气温较高，大口黑鲈养殖时间较长，养殖周期较短，一般当年(8月龄)便可达到上市规格。但在内陆地区如河南、湖南，气温偏低，养殖周期较长，一般需要次年才可达到上市规格。尽管前期研究发现雌性和雄性大口黑鲈在生长速度上无显著差异，但饲养至6月龄时，卵巢便开始发育，性腺指数维持在2％，饲养至次年3～5月份时性腺指数高达4～8％，导致雌性大口黑鲈生长速度变慢、饵料系数增高。通过性逆转技术培育全雄的大口黑鲈是解决上述问题最为有效的方法之一。具体方法为：使用外源性雄激素将XY雄性大口黑鲈逆转为XY生理雌鱼，再与正常的XY雄鱼进行配对，生产YY超雄大口黑鲈苗种，进而与XX正常雌鱼进行交配，生产XY正常雄鱼。其中XY生理雌鱼的鉴定是上述技术成功的关键。
与大多数鱼类相似，大口黑鲈的性别在生殖季节之前难以通过外部特征进行区分，到目前为止，与大口黑鲈遗传性别相关的研究较少。基于大口黑鲈雌性和雄性个体的重测序结果，本发明通过开发与大口黑鲈遗传性别鉴定相关的分子标记，在早期对大口黑鲈进行性别鉴定，尤其是性逆转过程中XY伪雌鱼鉴定，便于进行育种亲本的挑选，加快选育进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大口黑鲈性别相关的分子标记及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种与大口黑鲈性别相关的分子标记，所述分子标记位于7号染色体的第3356245位至第3356830位之间。
在本发明的一些实施方式中，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述SEQ ID NO：1序列自5’端起第226和/或392位碱基为SNP位点，其中第226位碱基为C或者G，第392位碱基为A或者T。
本发明的第二个方面，提供一种引物，所述引物用于扩增本发明第一方面所述的分子标记。
在本发明的一些实施方式中，所述引物的序列如下所示：
P1：5'-ATTGTTCCTGCCACTGT-3'(SEQ ID NO:2)；
P2：5'-TGCCACTCTGTAGGTTAAG-3'(SEQ ID NO:3)。
本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第二方面所述的引物。
本发明还提供本发明第一方面所述的分子标记在鉴定或辅助鉴定大口黑鲈遗传性别或辅助育种中的应用。
本发明还提供本发明第二方面所述的引物在鉴定或辅助鉴定大口黑鲈遗传性别或辅助育种中的应用。
本发明还提供本发明第三方面所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定大口黑鲈遗传性别或辅助育种中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种鉴定大口黑鲈遗传性别的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品基因组DNA；
(2)以提取得到的DNA为模板，利用本发明第二方面所述的引物或本发明第三方面所述试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定样品中的SEQ ID NO:1的第226位和/或第392位碱基处的基因型，若第226位碱基处为CC基因型则为雌性，CG基因型则为雄性；若第392位碱基处为AA则为雌性，AT基因型则为雄性。
本发明的有益效果是：
本发明从大口黑鲈中筛选获得了性别差异的DNA片段，将基因组序列为SEQ IDNO:1的SNP分子标记用于大口黑鲈遗传性别鉴定，所述SNP标记由位于大口黑鲈SEQ ID NO:1序列的第226和392位的SNP位点组成。并根据差异的片段设计检测引物，从而可以快速、准确的区分大口黑鲈的性别。
利用本发明的SNP位点，在生产上可快速对大口黑鲈北方遗传进行鉴定，在大口黑鲈单性育种方面具有重要的应用价值，同时在定位性别决定基因及性别决定机制研究中也具有重要应用前景。而且对家系建立，控制养殖群体的雌雄性别比例，推动大口黑鲈养殖业可持续健康发展具有重要意义和应用价值。与之前解剖检测或生殖孔观察相比，该技术具有目的性强、准确度高的优点，且操作简单、检测快速，对鱼体伤害少，便于广泛推广使用等优点。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1大口黑鲈遗传性别鉴定相关SNP的获得
根据大口黑鲈的基因组数据，分别对雌性大口黑鲈和雄性大口黑鲈进了重测序分析，在雌雄鱼间发现了大量的SNP分子标记。随机对其中的部分SNP分子标记进行了筛选，其中一个SNP分子标记在雌雄个体基因组中分别对应的位点信息如表1所示。
表1筛选得到的SNP分子标记信息
实施例2PCR产物测序验证SNP位点准确性
大口黑鲈的基因组序列如SEQ ID NO:1所示，其中第226位碱基为C或者G，存在两种基因型CC和CG，第392位碱基为A或者T，存在两种基因型AA和AT：
TGTGGTGTTATGTACATGCGGTGGATTTGGTATGCAGTATAAACAATATAAAATATTTGAAATAAGTGTTAACAGCTCTGAAAGAGAGAATGATGAATAAATAACCAGTAAACAGGTGCTGATTAGAGGCAGAGTTACTGGGTTACTGCACAGGAATTGTTCCTGCCACTGTGAGTCAGAGTCAGCTGTTCATCAGAGTGATGGCTTGTGGGAAGGAACTGTCCC[C/G]GAGTCTGTTGGTTTTGGCGTACAGTGCTCTGTAGCGCCTACCAGAGGGGAGGAGCTGGAACAGGTCGTGTCCGGGGTGAGATGGATCTGCAGTGATGTTTCCTGCCAGTTTCCTGACTCTGGAAATGTAGAAGTCCCGACTGTCCGTTGTAGTCTGCTCCTGTCC[A/T]TTGACAGACAGACAATCTAAGGGGCCAGCTCAGTTGTAGGAAATTCAGTTTCATACCTGTGTTAAACACAGGGGGCCATCGTCCCTTATAATGACTCACCCGTACGCACCTCTATTTTTTGGGTAAAGAAAATCCATGAGGAGACTTAACCTACAGAGTGGCATTTTGTTCAGGACCTTCAGGTG(SEQ ID NO:1)。
本实例所采用30尾来源于3个群体(遗传性别已确定)的大口黑鲈样本进行雌雄鉴定。群体1为珠江水产研究所内保留的大口黑鲈“优鲈1号”群体(雌雄各5尾)，群体2为佛山市养殖户养殖的“优鲈3号”群体(雌雄各5尾)，群体3为2020年清远市阳山县利阳水产公司养殖群体(雌雄各5尾)。
1)将试验鱼剪取尾部鳍条提取基因组DNA
利用酒精消毒后的剪刀剪取大口黑鲈部分尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇中常温保存。通过海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)对鳍条基因组DNA进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，利用紫外分光光度计(Eppendorf，AG2231型)检测浓度，-20℃保存备用。
2)所述PCR扩增反应体系为：
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
3)结果
将PCR产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，对测序结果的SNP位点及其峰图进行统计，结果见表2。大口黑鲈遗传性别鉴定相关的SNP标记的核苷酸序列SEQ ID NO:1第226和392位碱基处的SNP位点信息见表2。
表2第226和392位SNP位点在三个大口黑鲈群体的统计结果
实施例3SNaPshot SNP分型验证SNP位点的准确性
通过SNaPshot方法对上述SNP位点的准确性进行鉴定，包括如下步骤：
本实验所采用74尾来源于5个群体(遗传性别已确定)的大口黑鲈样本进行雌雄鉴定。群体1为珠江水产研究所内保留的大口黑鲈“优鲈1号”群体(雌雄各8尾)，群体2为佛山市养殖户养殖的“优鲈3号”群体(雌雄各8尾)，群体3为2020年清远市阳山县利阳水产公司养殖群体(雌雄各8尾)，群体4为广东梁氏水产种业有限公司英德基地养殖群体(雌雄各8尾)，群体5为2020年采集的大口黑鲈“中国台湾”养殖群体样本(雌雄各5尾)。
1)引物序列
根据大口黑鲈的基因组序列(SEQ ID NO:1)设计SNaPshot延伸引物：
P1：5'-ATTGTTCCTGCCACTGT-3'(SEQ ID NO:2)；
P2：5'-TGCCACTCTGTAGGTTAAG-3'(SEQ ID NO:3)。
2)将试验鱼剪取尾部鳍条提取基因组DNA
利用酒精消毒后的剪刀剪取大口黑鲈部分尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇中常温保存。通过海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)对鳍条基因组DNA进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，利用紫外分光光度计(Eppendorf，AG2231型)检测浓度，-20℃保存备用。
3)多重PCR扩增
1.将合成好的引物用1×TE溶解到10pmol，将一组中的引物加到引起，混匀，离心。
初次PCR体系如下：
将上述配置的PCR总管分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2μl DNA样品，离心。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环，72℃延伸10min。
2.PCR产物纯化
PCR扩增后取3μl PCR产物用ExoI和FastAP纯化，ExoI主要作用为去除反应产物中的剩余引物，FastAP主要作用为去除反应产物中剩余的dNTP。体系如下：
反应条件为：37℃15min，80℃15min，纯化好后进行延伸反应，预先混合延伸引物。
3.延伸反应
延伸反应体系如下：
反应条件为：
94℃1min；94℃30s，52℃5s，60℃30s，30个循环。
4.取1μl延伸引物，加入9μl Hidi，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪3730XL。
在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测，确定待测样本的核苷酸序列SEQ ID NO:1的第226位碱基处的SNP位点是否为CC或者CG，若是CC，则为雌性，若是CG，则为雄性。确定待测样本的核苷酸序列SEQ ID NO:1的第392位碱基的SNP位点是否为AA或者AT，若是AA，则为雌性，若是AT，则为雄性。结果如表3所示。
表3第226和392位SNP位点在五个大口黑鲈群体的SNaPshot统计结果
SNaPshot SNP分型结果与实施例2中的PCR产物测序结果相一致，说明SEQ ID NO:1的两个位点可为大口黑鲈遗传性别的鉴定提供可靠依据。样本数量较少时可直接通过PCR产物测序对大口黑鲈雌雄鱼进行鉴定，该方法快捷、准确；样本数量较多时可通过SNaPshot方法对大口黑鲈雌雄鱼进行鉴定，成本较低，适合推广使用。
综上所述，在大口黑鲈性别鉴定相关的SNP分子标记的核苷酸序列SEQ ID NO:1的第226和第392位碱基处分别发现一个SNP位点，均可用于快速、准确的对大口黑鲈的遗传性别进行鉴定。其中，第226位的SNP位点在雌性个体中为CC基因型，在雄性个体中为CG基因型；第392位的SNP位点在雌性个体中为AA基因型，在雄性个体中为AT基因型。
在检测的5个群体中，以第226位的SNP位点基因型为例，雌性大口黑鲈全为CC基因型，雄性大口黑鲈均全为CG基因型，与之前的研究结果相同，表明该SNP位点可以快速准确的鉴定大口黑鲈遗传性别。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 鉴定大口黑鲈遗传性别的分子标记及应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 大口黑鲈
<220>
<221> misc_feature
<222> (226) ..(226)
<223> S为G或C
<220>
<221> misc_feature
<222> (392) ..(392)
<223> W为A或T
<400> 1
tgtggtgtta tgtacatgcg gtggatttgg tatgcagtat aaacaatata aaatatttga 60
aataagtgtt aacagctctg aaagagagaa tgatgaataa ataaccagta aacaggtgct 120
gattagaggc agagttactg ggttactgca caggaattgt tcctgccact gtgagtcaga 180
gtcagctgtt catcagagtg atggcttgtg ggaaggaact gtcccsgagt ctgttggttt 240
tggcgtacag tgctctgtag cgcctaccag aggggaggag ctggaacagg tcgtgtccgg 300
ggtgagatgg atctgcagtg atgtttcctg ccagtttcct gactctggaa atgtagaagt 360
cccgactgtc cgttgtagtc tgctcctgtc cwttgacaga cagacaatct aaggggccag 420
ctcagttgta ggaaattcag tttcatacct gtgttaaaca cagggggcca tcgtccctta 480
taatgactca cccgtacgca cctctatttt ttgggtaaag aaaatccatg aggagactta 540
acctacagag tggcattttg ttcaggacct tcaggtg 577
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
attgttcctg ccactgt 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgccactctg taggttaag 19

Claims (6)

1.与大口黑鲈性别相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述SEQ ID NO：1序列自5’端起第226和/或392位碱基为SNP位点，其中第226位碱基为C或者G，第392位碱基为A或者T；若第226位碱基处为CC基因型则为雌性，CG基因型则为雄性；若第392位碱基处为AA则为雌性，AT基因型则为雄性。
2.检测权利要求1所述的分子标记的引物在鉴定大口黑鲈遗传性别或性别鉴定的辅助育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如下所示：
P1：5'- ATTGTTCCTGCCACTGT -3'；
P2：5'- TGCCACTCTGTAGGTTAAG -3'。
4.检测权利要求1所述分子标记的试剂盒在鉴定大口黑鲈遗传性别或性别鉴定的辅助育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的引物。
6.一种鉴定大口黑鲈遗传性别的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待检样品基因组DNA；
（2）以提取得到的DNA为模板，利用权利要求3所述的引物或权利要求5所述的试剂盒进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果确定样品中的SEQ ID NO:1的第226位和/或第392位碱基处的基因型，若第226位碱基处为CC基因型则为雌性，CG基因型则为雄性；若第392位碱基处为AA则为雌性，AT基因型则为雄性。
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大口黑鲈NPY基因多态性及与生长的关联分析;李胜杰 等;《基因组学与应用生物学》;第37卷(第10期);第4274-4277页 *

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