CN113151430A - 一种中国对虾雌性特异性引物及其应用 - Google Patents

一种中国对虾雌性特异性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国对虾雌性特异性引物及其应用。所述雌性特异性引物的序列为：Female‑specific‑F：5’‑GTTTCACCTACGCTTCACCC‑3’；Female‑specific‑R：5’‑TCCTTAATCCTGCTGCATCCA‑3’。利用该引物对待测对虾的基因组DNA进行PCR扩增，其产物电泳结果若出现210 bp和392 bp两条条带时判定为雌性中国对虾，若只出现392 bp条带时判定为雄性中国对虾。本发明还同时利用设计的对照引物来避免由模板出现问题而造成的鉴定结果误判，提高准确性。本发明的特异性引物特异性强，鉴定方法简单快速准确，尤其适合中国对虾早期遗传性别鉴定。

Description

一种中国对虾雌性特异性引物及其应用
技术领域
本发明属于海洋虾类性别鉴定技术，具体涉及一种中国对虾雌性特异性引物及其应用。
背景技术
中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳 纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、对虾科(Penaeidae)，又称东方对虾， 俗称对虾、明虾，主要分布于黄渤海以及东海北部的嵊泗列岛和舟山群岛一带， 是我国最具代表性的海水经济养殖动物之一，并在国际市场上享有较高的声誉。 中国对虾属广温、广盐性、一年生暖水性大型洄游虾类，在黄、渤海区有明显的 洄游习性，分为越冬洄游和生殖洄游，其产卵期在4～6月间，怀卵量30～100万 粒。近年来中国对虾的年养殖产量稳定在4-5万吨，养殖区域主要分布在长江以 北的江苏、山东、天津、河北和辽宁等黄渤海沿岸地区。
目前，中国对虾主要通过外观辨别雌雄。性成熟的雌虾体长在18cm~23cm，体重60g~80g，呈青绿色；成熟的雄虾体长在13cm~17cm，体重30g~40g，呈黄褐色；雌虾平均体重比雄虾重一倍以上，因而其市场价值也大大高于雄性个体。并且中国对虾上市规格、等级的不同，也会极大地影响养殖经济效益。因此，建立中国对虾单性育种和养殖技术，将有助于提高养殖产量，增加渔民收入。但是，中国对虾幼虾特别是发育早期的幼体很难通过外观辨别雌雄，也尚无通过分子技术对中国对虾进行性别鉴定的方法，这极大阻碍了其单性育种和养殖产业的发展。
发明内容
本发明提供了一种中国对虾雌性特异性引物及其应用。所述的中国对虾雌性特异性引物能够大规模快速准确地鉴定生长发育早期中国对虾的遗传性别。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种中国对虾雌性特异性引物，其核苷酸序列为：
Female-specific-F：5’-GTTTCACCTACGCTTCACCC-3’；
Female-specific-R：5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’。
本发明还提供了一种中国对虾遗传性别特异性鉴定方法，包括以下步骤：
（1）提取待鉴定的中国对虾个体的基因组DNA；
所述基因组DNA的提取方法为：采集中国对虾的肌肉组织或者幼体期的整个个体，在裂解液中进行匀浆，加入蛋白酶K，并于在55℃水浴锅中消化组织至澄清，再利用酚-氯仿抽提法或者试剂盒提取DNA，测定DNA浓度后稀释至100 ng/μL，于-20℃冰箱中保存备用；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA作为模板，利用所述的中国对虾雌性特异性引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）利用凝胶电泳检测步骤（2）的PCR产物，并观察电泳结果；若电泳结果出现两条条带，条带的大小分别为392bp和210bp，则中国对虾鉴定为雌性，若电泳结果仅出现一条大小为392bp的条带，则中国对虾鉴定为雄性。
进一步的，大小为392bp的条带为扩增条带，大小为210bp的条带为特异性扩增条带。
进一步的，所述步骤（2）中为了避免由模板出现问题而造成的鉴定结果误判，同时利用对照引物对基因组DNA进行PCR扩增，以此判断中国对虾遗传性别鉴定过程中的模板是否存在问题。
进一步的，所述对照引物的核苷酸序列为：
Control-F: 5’-GGGTGGGTGGTATGGAAAGT-3’；
Control-R: 5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’。
进一步的，若利用对照引物扩增模板得到PCR产物，经电泳后出现一条大小为392bp的条带，则判定基因组DNA模板不存在问题；若经电泳后得不到大小为392bp的条带，则判定基因组DNA模板存在问题。
进一步的，所述步骤（2）中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复35个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。
进一步的，所述步骤（2）中PCR扩增的反应体系包括7.5 μL 2×Taq PCR Mix、上下游引物各0 .3 μL、DNA模板1 μL，补足灭菌双蒸水至15 μL。
进一步的，所述中国对虾包括中国对虾活体和中国对虾冻存样本。
本发明还提供了所述的中国对虾雌性特异性引物在用于鉴定中国对虾早期遗传性别中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明获得的中国对虾雌性特异性引物对中国对虾的遗传性别鉴定具有很强的特异性。所述特异性引物对以及相应的中国对虾遗传性别鉴定方法能够快速准确对不同时期的中国对虾进行鉴定，且鉴定方法简单有效，只需通过对扩增产物的电泳结果进行观察即可，当扩增产物出现210 bp的特异性扩增条带和392 bp的扩增条带判定为雌性中国对虾，当扩增产物仅出现392 bp的扩增条带时判定为雄性中国对虾。并且，本发明的鉴定方法不局限于中国对虾的发育时期，尤其是能够在发育初期进行性别鉴别，克服了现在无法对中国对虾幼体进行性别鉴定的缺陷，而且无论是对虾的活体或者冻存样本也都能进行性别鉴定，因此本发明的适用范围广。本发明还设计了一对内参引物，将其同时与特异性异物一起扩增，即可简单的判断作为模板的基因组DNA是否存在问题，避免对鉴定结果的误判，提高鉴定的正确率。本发明不仅拓展了中国对虾遗传性鉴定的方法，并且非常有利于中国对虾单性育种和养殖产业的发展。
附图说明
图1是基于本发明对20尾已知性别的“黄海1号”中国对虾遗传性别鉴定的凝胶电泳图；其中M为Marker，左侧为雌性中国对虾，右侧为雄性中国对虾。
图2是基于本发明对12尾已知性别的海捕野生中国对虾遗传性别鉴定的凝胶电泳图；其中M为Marker，左侧为雌性中国对虾，右侧为雄性中国对虾。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
根据雌性中国对虾特异的DNA片段为目标序列，设计了一对中国对虾雌性特异性引物（Female-specific-F/Female-specific-R），其核苷酸序列如下：
Female-specific-F：5’-GTTTCACCTACGCTTCACCC-3’（SEQ ID No.1）；
Female-specific-R：5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’ （SEQ ID No.2）。
为了避免由于模板问题出现的未扩增出条带的情况，造成结果的误判，本发明还设计了一对内参引物作为对照，其核苷酸序列如下：
Control-F：5’-GGGTGGGTGGTATGGAAAGT-3’ （SEQ ID No.3）；
Control-R：5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’ （SEQ ID No.4）。
实施例2
供试样本：20尾已知性别的“黄海1号”中国对虾活体，其中雌雄各10尾。
1、取供试样本的肌肉组织，提取基因组DNA，测定浓度后稀释至100ng/μL；
所述基因组DNA的提取方法为：将样本的肌肉组织在裂解液中进行匀浆；加入蛋白酶K消化组织，在55℃水浴锅中消化至澄清；采用标准的酚-氯仿抽提法或者使用商业试剂盒提取DNA。
2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；其中，PCR扩增采用的中国对虾雌性特异性引物对的序列如下：
Female-specific-F：5’-GTTTCACCTACGCTTCACCC-3’（SEQ ID No.1）；
Female-specific-R：5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’ （SEQ ID No.2）；
PCR扩增采用的对照引物对的序列如下：
Control-F：5’-GGGTGGGTGGTATGGAAAGT-3’ （SEQ ID No.3）；
Control-R：5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’ （SEQ ID No.4）；
PCR扩增采用的反应体系为15 μL，包括7.5 μL 2×Taq PCR Mix（含dNTPs、TaqDNA聚合酶、MgCl2、反应缓冲液）、PCR对照或雌性特异性上下游引物各0.3 μL、DNA模板1 μL，补足灭菌双蒸水至15 μL；PCR扩增采用的反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复35个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。
3、完成PCR扩增后，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
电泳结果见图1，其中M为Marker，左侧10个泳道为雌性中国对虾，扩增出两个条带，大小分别为392bp和210bp，右侧10个泳道为雄性中国对虾，只扩增出一条大小为392bp的条带。
实施例3
供试样本：12尾已知性别的海捕野生中国对虾冻存样本，其中雌雄各6尾。
实施步骤和实验条件与实施例2相同。
电泳结果见图2，其中M为Marker，左侧6个泳道为雌性中国对虾，扩增出两个条带，大小分别为392bp和210bp，右侧6个泳道为雄性中国对虾，只扩增出一条大小为392bp的条带。
由上述的结果也能说明，本发明得到的中国对虾雌性特异性引物（Female-specific-F/Female-specific-R）的特异性强，该引物对以及相应的PCR检测方法能够快速准确对中国对虾活体或者冻存样本进行性别鉴定，并且简单易于操作，且不局限于中国对虾的发育时期，甚至是中国对虾发育早期的幼体也可以通过本发明的特异性引物鉴定出性别。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种中国对虾雌性特异性引物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtttcaccta cgcttcaccc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccttaatcc tgctgcatcc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtgggtgg tatggaaagt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccttaatcc tgctgcatcc a 21

Claims (10)

1.一种中国对虾雌性特异性引物，其特征在于，所述中国对虾雌性特异性引物的核苷酸序列为：
Female-specific-F：5’-GTTTCACCTACGCTTCACCC-3’；
Female-specific-R：5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’。
2.利用权利要求1所述的中国对虾雌性特异性引物鉴定中国对虾早期遗传性别的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待鉴定的中国对虾个体的基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA作为模板，利用所述的中国对虾雌性特异性引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
（3）利用凝胶电泳检测步骤（2）的PCR产物，并观察电泳结果；若电泳结果出现两条条带，则中国对虾鉴定为雌性，若电泳结果仅出现一条条带，则中国对虾鉴定为雄性。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（3）中电泳结果鉴定为雌性中国对虾的两条条带的大小分别为392bp和210bp；鉴定为雄性中国对虾的一条条带的大小为392bp。
4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）中同时利用对照引物对基因组DNA进行PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述对照引物的核苷酸序列为：
Control-F: 5’-GGGTGGGTGGTATGGAAAGT-3’；
Control-R: 5’-TCCTTAATCCTGCTGCATCCA-3’。
6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，若利用对照引物扩增模板得到PCR产物，经电泳后出现一条大小为392bp的条带，则判定基因组DNA模板不存在问题；若经电泳后得不到大小为392bp的条带，则判定基因组DNA模板存在问题。
7.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，重复35个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。
8.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的反应体系包括7.5 μL 2×Taq PCR Mix、上下游引物各0 .3 μL、DNA模板1 μL，补足灭菌双蒸水至15 μL。
9.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述中国对虾包括中国对虾活体和中国对虾冻存样本。
10.权利要求1所述的中国对虾雌性特异性引物在用于鉴定中国对虾早期遗传性别中的应用。
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