CN113502334B - 一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记c27449及其应用 - Google Patents

一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记c27449及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449及其应用。所述分子标记C27449的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，用于检测所述分子标记C27449的引物对的核苷酸序列分别为：C27449F：TCATCCAAGTTCCAGCCT和C27449R：GGTCCCCCACAACATACA。所述分子标记C27449可以不受日本对虾组织特异性及环境的影响，使用步骤简单，结果明显，将日本对虾的基因组DNA与引物对进行PCR反应后电泳检测，若在120bp出现条带，则为雌性日本对虾，若无条带，则为雄性日本对虾，该分子标记还可以促进日本对虾全雌或高雌苗种培育技术的建立，具有广阔的应用前景。

Description

一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449及其应用
技术领域
本发明属于DNA分子标记技术领域，具体涉及一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449及其应用。
背景技术
日本对虾（ Penaeus japonicus）属甲壳纲、十足目、对虾科、对虾属动物，又称车虾、花虾、花尾虾等，在我国主要分布在江苏以南沿海地区。日本对虾具有生长迅速、抗病力强、干露存活时间长、长途运输成活率高的特点，再因其具有的较高经济价值，且市场价格高，所以是我国沿海地区一种重要的经济对虾种类。在养殖过程中，日本对虾的成熟雌虾要大于雄虾，因此如果能够实现高效的单性养殖，将显著提高日本对虾的养殖经济效益。然而，目前尚没有高效的日本对虾性别控制技术。
分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记具有显著的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；生物发育不同阶段、不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记检测简单、迅速。开发与日本对虾性别鉴定相关的分子标记，可以实现日本对虾的单性育种，提高养殖户的经济收益，对日本对虾的养殖和育种具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449及其应用。本发明通过比较组学和生物信息学分析方法筛选到性别特异区段，并进而筛选得到一个新的鉴定日本对虾遗传性别分子标记C27449，该分子标记鉴定效率及准确率高，还能够用于全雌或高雌性比日本对虾的苗种培育，有助于日本对虾的养殖发展。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449，所述分子标记C27449的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了用于检测所述的分子标记C27449的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
C27449F：TCATCCAAGTTCCAGCCT，
C27449R：GGTCCCCCACAACATACA。
本发明还提供了所述的分子标记C27449在用于快速鉴定日本对虾遗传性别中的应用。
进一步：利用所述分子标记C27449快速鉴定日本对虾遗传性别中的步骤如下：
（1）合成核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对C27449F和C27449R；
（2）提取日本对虾样本中的基因组DNA；
（3）以步骤（2）中提取的基因组DNA作为模板，利用引物对C27449F和C27449R进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
（4）对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果；若电泳结果在120bp出现扩增目的条带，则日本对虾为雌性，若电泳结果无扩增目的条带出现，则日本对虾为雄性。
进一步：所述步骤（3）中PCR扩增反应的条件为94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，重复32个循环；72℃，10min。
进一步：所述步骤（3）中PCR扩增反应的体系为：基因组DNA 1μL，Mix1 5.0μL，上下游引物各0.2μL，灭菌水补至10μL。
本发明还提供了所述的分子标记C27449在用于全雌或高雌性比日本对虾苗的育种中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明提供的快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449可以不受日本对虾组织特异性及环境的影响，性别鉴定简便快捷，对样品的要求低，并且鉴定结果准确性高，不仅能够用于鉴定日本对虾遗传性别，还可以促进全雌或高雌性比日本对虾苗种培育技术的建立，进而有利于日本对虾养殖的发展和提高养殖经济收益，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：日本对虾雌性特异性标记图；其中，M：标准分子量；1-10和21-29为雌虾；11-20和30-38为雄虾。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、DNA抽提
由诺禾致源公司提取日本对虾的DNA，雌雄各30个个体。
2、DNA混合池构建
将个体DNA等量混合，制备雌雄DNA混合池，浓度为292.8ng/μl~363.3ng/μl，每个混合池中包含30个个体，用于后续实验。
3、引物设计
通过比较组学和生物信息学分析方法筛选到性别特异区段，然后从性别特异区段中筛选并验证性别标记。利用Primer Premier 5.0软件，对性别候选Contig设计引物，筛选到标记DNA序列（如SEQ ID No.1所示，编号为C27449），并设计该序列的检测引物。
引物的设计标准为：
1）引物退火温度50-60℃，
2）尽量避免引物本身、引物之间形成稳定的二聚体和发夹结构。
本实施例所用引物信息见表1：
表1：引物信息
4、混合模板PCR扩增及电泳
用混合DNA为模板，利用北京全式金公司的HiFi酶进行PCR扩增，设置反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，32个循环；72℃，10min。PCR体系如下：
试剂 用量
DNA模板 1μL
 Mix1 5.0μL
引物(上下游) 各0.2μL
灭菌水 补至10μL
将混合模板PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，在雄性混合DNA池中未扩增出目的条带，而在雌性混合池中均扩增出目的条带。
5、雌雄个体PCR扩增及电泳
提取38个日本对虾个体的组织DNA作为模板进行PCR，PCR引物为C27449F：TCATCCAAGTTCCAGCCT（SEQ ID No.2）；C27449R：GGTCCCCCACAACATACA（SEQ ID No.3）；PCR体系和PCR扩增反应程序均与上述相同。扩增后，将得到的个体模板PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示（图1）：在检测的所有雄性个体中均未扩增出目的条带，而在检测的所有雌性个体中均在120bp处扩增出目的条带。
研究结果表明，本发明获得的分子标记C27449能够准确辨别日本对虾遗传性别，应用步骤简单来说为：提取日本对虾样本中的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用分子标记的扩增引物C27449F和C27449R进行PCR扩增反应；对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果电泳结果显示在120bp处出现目的条带，日本对虾则为雌性，若无条带出现则为雄性。分子标记C27449还能够用于全雌或高雌性比日本对虾的苗种培育，有助于日本对虾的养殖发展。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
                         序列表
<110>  中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120>  一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449及其应用
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  392
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
ataagaggtt aggacttagc agagtttgca caaattttag ggcacagatg tgtgagagat  60
caaatgtttc taactaaggc aggagtccca gtgtttcctt gctacagcta gagacatctt 120
aagttgacta gctcagtgga atataccccg ctaacaggaa ggataggtgg agatcatcca 180
agttccagcc taggttccta tggcctgatt agtgggactt ggggtcagaa cattttaatg 240
gtctaccttt tgagcagtct ctgagggtga tttttgtatg ttgtggggga ccaaattctc 300
aggaaggact gcaacgtatt ttctctgatt cctgtgtgat atgtgaaacc cagttgttaa 360
gatcatgtct gtgtattgta tgtatatgtt ta                               392
<210>  2
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
tcatccaagt tccagcct                                                18
<210>  3
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
ggtcccccac aacataca                                                18

Claims (7)

1.一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记C27449，其特征在于，所述分子标记C27449的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.用于检测权利要求1所述的分子标记C27449的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：
C27449F：TCATCCAAGTTCCAGCCT；
C27449R：GGTCCCCCACAACATACA。
3.权利要求1所述的分子标记C27449在用于快速鉴定日本对虾遗传性别中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用所述分子标记C27449快速鉴定日本对虾遗传性别的步骤如下：
（1）合成核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对C27449F和C27449R；
（2）提取日本对虾样本中的基因组DNA；
（3）以步骤（2）中提取的基因组DNA作为模板，利用引物对C27449F和C27449R进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
（4）对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果；若电泳结果在120bp处出现扩增目的条带，则日本对虾为雌性，若电泳结果在120bp处无扩增目的条带出现，则日本对虾为雄性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中PCR扩增反应的条件为94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，重复32个循环；72℃，10min。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中PCR扩增反应的体系为：基因组DNA 1μL，Mix1 5.0μL，上下游引物各0.2μL，灭菌水补至10μL。
7.权利要求1所述的分子标记C27449在用于全雌或高雌性比日本对虾苗的育种中的应用。
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