CN107400715A - 十倍体长穗偃麦草专化分子标记与探针的开发及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了十倍体长穗偃麦草专化分子标记与探针的开发及其应用。本发明利用特异性长度扩增片段测序技术(SLAF‑seq)对普通小麦、普通小麦‑十倍体长穗偃麦草易位系和十倍体长穗偃麦草进行测序，通过序列数据比对分析获得十倍体长穗偃麦草特异序列，并以十倍体长穗偃麦草特异序列为基础，开发了长穂偃麦草的专化分子标记和专化荧光探针。本发明开发的分子标记不仅可以用于快速检测十倍体长穂偃麦草染色质及长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定，而且为分子标记辅助选择改良小麦遗传特性提供重要途径，也为小麦分子育种、系统进化和种质资源鉴定提供重要的应用基础。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及十倍体长穗偃麦草专化分子标记与探针的开发及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivm)是世界上种植面积最大，产量仅次于玉米的第二大粮食作物。近半个世纪来，世界小麦的总产量已经增加两倍多，其中优良的小麦品种对提高小麦产量发挥了决定性的作用。小麦野生近缘物种中存在着大量的小麦缺乏的有利遗传资源，充分开发和利用这些优良基因资源培育小麦新品种已经成为小麦育种的目标之一。长穂偃麦草(Thinopyrum ponticum，2n＝10x＝70)是多年生草本植物，属于禾本科偃麦草属，是小麦重要的野生近缘种。它具有长穗多花、适应性广、耐逆性强等优良性状，蕴藏着许多普通小麦所不具备的优良基因(Shannon，1978；Cox，1991)，且易与小麦杂交结实，是改良现有小麦品种的宝贵资源库。近年来，随着工作的深入，许多新型的长穂偃麦草抗病、抗逆基因不断被发现，使得人们意识到目前开发利用的只不过是其中极少的一部分。例如，它含有小麦锈病抗性基因，能够抵抗近年来在非洲肆虐的新型小麦秆锈病菌Ug99(Xu et al.,2009；Zheng et al.,2014)；它还进化出一套高效控制盐分吸收、转运和分泌的调控机制，能够提高小麦耐盐特性(Chen et al.,2004)。
通过远缘杂交及染色体工程从野生近缘种属转移优良基因已被证明是小麦遗传改良的一条卓有成效的途径。早在50年代我国就成功进行了小麦与偃麦草属的杂交，其中小偃麦品种“小偃6号”年种植面积曾达67万hm2以上，且在生产上使用长达20多年的时间。在小麦-长穂偃麦草杂交后代中，检测源于长穗偃麦草的外源染色质成为至关重要的问题。虽然一些遗传学手段，如染色体分带、原位杂交等技术，能够用于小麦遗传背景下长穂偃麦草遗传物质的检测，但这些技术费时、费力，对操作技巧或仪器设备的要求也较高，而且这些实验手段不适于进行高通量筛选与规模化鉴定。
分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记，在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。利用长穂偃麦草染色体专化分子标记进行标记辅助选择(MAS)对于利用偃麦草优异基因，加速小麦分子育种进程具有重大意义。例如，利用来源于长穂偃麦草抗秆锈病基因Sr24、Sr25、Sr26及Sr43的连锁标记，能够开展抗病种质资源的筛选、外源遗传物质的鉴定、抗病基因的定位，有效地提高了分子标记辅助选择育种的效率(Ayala-Navarrete et al.,2007；Margo et al.,2005；Niu et al.,2014；Yu et al.,2010；Zhenget al.,2014)。
截止目前，科学家已经利用多种技术手段开发了长穗偃麦草特异性分子标记，如限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)(Autrique etal.,1995；Liu et al.,1999)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)(Prins et al.,2001；Zhang et al.,2008)、随机扩增多态性(RandomAmplified Polymorphic DNA，RAPD)(Liu et al.,1998；You et al.,2002)、简单重复序列(Simple sequence repeats，SSR)(Li et al.,2005；Jauhar et al.,2009；Shen et al.,2004；You et al.,2002；You et al.,2003；Niu et al.,2014)、序列标志位点(SequenceTagged Sites，STS)(Mago et al.,2005；Zhang et al.,2008)、抗病基因类似物标记(Resistance Gene Analogs Polymorphism，RGAP)(Chen et al.,2007)、靶位区域扩增多态性(Target Region Amplified Polymorphism，TRAP)(Jauhar et al.,2009)、抑制消减杂交(Suppression Subtraction Hybridization,SSH)(Ge et al.,2012)、酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplification Polymorphism Sequence，CAPS)(Shen et al.,2004；Liet al.,2007)、序列特异性扩增区(Sequence-characterized Amplified Region，SCAR)(You et al.,2002；Prabhu et al.,2004；Yan et al.,2009)。
然而，在分子生物学飞速发展的今天，长穂偃麦草分子标记的开发工作相对滞后，标记来源也主要集中于其二倍体种。由于十倍体长穂偃麦草基因组庞大，加之其基因组与小麦基因组具有高度同源性，又缺乏基因组全序列信息，使得十倍体长穂偃麦草分子标记的开发研究存在耗时长、成本高、效率低的缺点，无法批量获得染色体专化分子标记，严重阻碍了长穗偃麦草基因资源的开发和应用。
SLAF-seq(Specific-locus Amplified Fragment sequencing)是基于高通量测序技术发展而来的大规模基因分型技术(Sun et al.,2013)。该技术主要通过生物信息学设计方案，构建SLAF-seq文库，筛选特异性长度片段，高通量测序获得序列信息，软件定义和评估等步骤，筛选到海量的序列标签，进一步根据序列开发特异的分子标记。应用SLAF-seq技术可以开发高密度全基因组分子标记，构建高密度遗传连锁图谱，进行高精度QTL定位。该方法具有通量高、准确性高、成本低、周期短等优点，在遗传定位、分子育种、种质资源鉴定等研究领域得以应用。SLAF-seq技术适用物种范围广，已在农作物、蔬菜、林木、水产等多个物种中成功实践(Zhang,et al.,2013)。应用SLAF-seq技术，成功获得了20个二倍体长穂偃麦草1E染色体和89个二倍体长穂偃麦草7E染色体的分子标记(陈士强等，2013；Chenet al.,2013)。它对整个基因组进行有效的简化，筛选基因组上均匀分布且避开重复序列的片段进行测序，避免了对重复序列区域的测序投入。当缺乏物种基因组信息时，同样可以利用该技术降低物种复杂度，获得可靠的序列标签。因此，SLAF-seq技术的发展对长穂偃麦草染色体专化分子标记的挖掘带来了新的机遇。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种长穗偃麦草染色体分子标记。
本发明提供的长穗偃麦草染色体分子标记为如下A1)或A2)：
A1)是以长穗偃麦草的基因组DNA为模板，采用引物对64进行扩增得到的DNA分子：
A2)是以长穗偃麦草的基因组DNA为模板，采用如下引物对1-引物对67中的任一对进行扩增得到的DNA分子：
所述引物对1由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对9由序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对10由序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对11由序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子组成；
所述引物对12由序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子组成；
所述引物对13由序列25所示的单链DNA分子和序列26所示的单链DNA分子组成；
所述引物对14由序列27所示的单链DNA分子和序列28所示的单链DNA分子组成；
所述引物对15由序列29所示的单链DNA分子和序列30所示的单链DNA分子组成；
所述引物对16由序列31所示的单链DNA分子和序列32所示的单链DNA分子组成；
所述引物对17由序列33所示的单链DNA分子和序列34所示的单链DNA分子组成；
所述引物对18由序列35所示的单链DNA分子和序列36所示的单链DNA分子组成；
所述引物对19由序列37所示的单链DNA分子和序列38所示的单链DNA分子组成；
所述引物对20由序列39所示的单链DNA分子和序列40所示的单链DNA分子组成；
所述引物对21由序列41所示的单链DNA分子和序列42所示的单链DNA分子组成；
所述引物对22由序列43所示的单链DNA分子和序列44所示的单链DNA分子组成；
所述引物对23由序列45所示的单链DNA分子和序列46所示的单链DNA分子组成；
所述引物对24由序列47所示的单链DNA分子和序列48所示的单链DNA分子组成；
所述引物对25由序列49所示的单链DNA分子和序列50所示的单链DNA分子组成；
所述引物对26由序列51所示的单链DNA分子和序列52所示的单链DNA分子组成；
所述引物对27由序列53所示的单链DNA分子和序列54所示的单链DNA分子组成；
所述引物对28由序列55所示的单链DNA分子和序列56所示的单链DNA分子组成；
所述引物对29由序列57所示的单链DNA分子和序列58所示的单链DNA分子组成；
所述引物对30由序列59所示的单链DNA分子和序列60所示的单链DNA分子组成；
所述引物对31由序列61所示的单链DNA分子和序列62所示的单链DNA分子组成；
所述引物对32由序列63所示的单链DNA分子和序列64所示的单链DNA分子组成；
所述引物对33由序列65所示的单链DNA分子和序列66所示的单链DNA分子组成；
所述引物对34由序列67所示的单链DNA分子和序列68所示的单链DNA分子组成；
所述引物对35由序列69所示的单链DNA分子和序列70所示的单链DNA分子组成；
所述引物对36由序列71所示的单链DNA分子和序列72所示的单链DNA分子组成；
所述引物对37由序列73所示的单链DNA分子和序列74所示的单链DNA分子组成；
所述引物对38由序列75所示的单链DNA分子和序列76所示的单链DNA分子组成；
所述引物对39由序列77所示的单链DNA分子和序列78所示的单链DNA分子组成；
所述引物对40由序列79所示的单链DNA分子和序列80所示的单链DNA分子组成；
所述引物对41由序列81所示的单链DNA分子和序列82所示的单链DNA分子组成；
所述引物对42由序列83所示的单链DNA分子和序列84所示的单链DNA分子组成；
所述引物对43由序列85所示的单链DNA分子和序列86所示的单链DNA分子组成；
所述引物对44由序列87所示的单链DNA分子和序列88所示的单链DNA分子组成；
所述引物对45由序列89所示的单链DNA分子和序列90所示的单链DNA分子组成；
所述引物对46由序列91所示的单链DNA分子和序列92所示的单链DNA分子组成；
所述引物对47由序列93所示的单链DNA分子和序列94所示的单链DNA分子组成；
所述引物对48由序列95所示的单链DNA分子和序列96所示的单链DNA分子组成；
所述引物对49由序列97所示的单链DNA分子和序列98所示的单链DNA分子组成；
所述引物对50由序列99所示的单链DNA分子和序列100所示的单链DNA分子组成；
所述引物对51由序列101所示的单链DNA分子和序列102所示的单链DNA分子组成；
所述引物对52由序列103所示的单链DNA分子和序列104所示的单链DNA分子组成；
所述引物对53由序列105所示的单链DNA分子和序列106所示的单链DNA分子组成；
所述引物对54由序列107所示的单链DNA分子和序列108所示的单链DNA分子组成；
所述引物对55由序列109所示的单链DNA分子和序列110所示的单链DNA分子组成；
所述引物对56由序列111所示的单链DNA分子和序列112所示的单链DNA分子组成；
所述引物对57由序列113所示的单链DNA分子和序列114所示的单链DNA分子组成；
所述引物对58由序列115所示的单链DNA分子和序列116所示的单链DNA分子组成；
所述引物对59由序列117所示的单链DNA分子和序列118所示的单链DNA分子组成；
所述引物对60由序列119所示的单链DNA分子和序列120所示的单链DNA分子组成；
所述引物对61由序列121所示的单链DNA分子和序列122所示的单链DNA分子组成；
所述引物对62由序列123所示的单链DNA分子和序列124所示的单链DNA分子组成；
所述引物对63由序列125所示的单链DNA分子和序列126所示的单链DNA分子组成；
所述引物对64由序列127所示的单链DNA分子和序列128所示的单链DNA分子组成；
所述引物对65由序列129所示的单链DNA分子和序列130所示的单链DNA分子组成；
所述引物对66由序列131所示的单链DNA分子和序列132所示的单链DNA分子组成；
所述引物对67由序列133所示的单链DNA分子和序列134所示的单链DNA分子组成。
本发明的第二个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的探针。
本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的探针为如下B1)或B2)：
B1)所述探针为序列135所示的DNA分子；
B2)所述探针是以长穗偃麦草染色体的基因组DNA为模板，采用上述引物对64或引物对18或引物对40或引物对43或引物对66进行扩增得到的DNA分子。
上述探针中，所述探针标记有荧光基团；所述荧光基团具体为绿色荧光基团。
本发明的第三个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的引物对。
本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的引物对为上述引物对1-引物对67中的任一对。
上述引物对中，每个所述引物对中的各条引物的摩尔量比为1:1。
本发明的第四个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的PCR试剂。
本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的PCR试剂包括上述引物对。
上述PCR试剂中，每个所述引物对中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。
本发明的第五个目的是提供用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的试剂盒。
本发明提供的用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的试剂盒包括上述引物对或上述PCR试剂。
本发明的第六个目的是提供上述分子标记或上述探针或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述分子标记或上述探针或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在如下1)-10)中任一种中的应用：
1)检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段；
2)制备检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段的产品；
3)检测或辅助检测待测植物中是否含有长穗偃麦草染色体或其片段；
4)制备检测或辅助检测待测植物中是否含有长穗偃麦草染色体或其片段的产品；
5)追踪长穗偃麦草染色体或其片段；
6)制备追踪长穗偃麦草染色体或其片段的产品；
7)分子标记辅助选择育种；
8)制备分子标记辅助选择育种的产品；
9)小麦分子育种；
10)制备小麦分子育种的产品。
上述分子标记或上述探针或上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述应用中，所述长穗偃麦草为十倍体长穗偃麦草。
本发明的第七个目的是提供一种检测或辅助检测待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法包括如下步骤：用上述探针对待测植物进行原位杂交，若出现杂交信号，则表示待测植物中含有或候选含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段。
上述方法中，所述原位杂交是指探针与待测植物根尖体细胞有丝分裂中期分裂相进行原位杂交；所述原位杂交不含有封阻的步骤。
上述方法中，所述待测植物为含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的小麦属植物；所述含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的小麦属植物具体可为八倍体小偃麦“小偃68”。
在本发明的具体实施例中，以含有12条完整的十倍体长穂偃麦草染色体及2条普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位染色体的八倍体小偃麦“小偃68”作为待测植物，用上述探针对其根尖体细胞有丝分裂中期分裂相进行原位杂交时，杂交信号弥散分布于长穂偃麦草染色体或染色体片段上，可清晰观察到小偃麦中的十倍体长穂偃麦草染色体及普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位染色体。
本发明的第八个目的是提供一种检测或辅助检测待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法。
本发明提供的检测或辅助检测待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法包括如下步骤：用上述引物对待测植物进行扩增，若实现成功扩增，则表示待测植物中含有或候选含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段。
上述方法中，所述成功扩增是指扩增得到特异性条带。
本发明利用特异性长度扩增片段测序技术(Specific-locus AmplifiedFragment sequencing，SLAF-seq)对普通小麦、普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系和十倍体长穗偃麦草进行测序，通过序列数据比对分析获得十倍体长穗偃麦草特异序列。并以十倍体长穗偃麦草特异序列为基础，开发了十倍体长穂偃麦草的专化分子标记和专化荧光探针。本发明开发的分子标记和探针不仅可以快速检测十倍体长穂偃麦草染色体，用于长穗偃麦草向小麦转移染色体片段过程中的易位系鉴定，而且为分子标记辅助选择改良小麦遗传特性提供重要途径，也为小麦分子育种、系统进化和种质资源鉴定提供重要的应用基础。
附图说明
图1为十倍体长穗偃麦草专化分子标记EA2-31在普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系EA、中国春(CS)和十倍体长穗偃麦草Th.ponticum(10x)中的扩增结果。M：MarkerII；1：普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系EA；2：中国春(CS)；3：十倍体长穗偃麦草Th.ponticum(10x)。
图2为八倍体小偃麦“小偃68”根尖体细胞中期染色体原位杂交图。A为十倍体长穗偃麦草全基因组探针；B为十倍体长穗偃麦草专化荧光探针pThp3.93。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的普通小麦中国春(CS，2n＝6x＝42)、十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)和八倍体小偃麦“小偃68”(Xiaoyan 68，2n＝8x＝56)均在文献“Q.Zheng,Z.Lv,Z.Niu,B.Li,H.Li,S.S.Xu,F.Han,Z.Li,Molecular cytogeneticcharacterization and stem rust resistance of five wheat-Thinopyrumponticumpartial amphiploids,J Genet Genomics 41(11)(2014)591-599.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
下述实施例中的普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系(EA，2n＝6x＝42)，系谱为小偃81/4/小偃81/3/小偃81//陕229/小偃68，该易位染色体存在于八倍体小偃麦“小偃68”中。其中，“小偃81”是由中国科学院遗传与发育生物学研究所选育，2005年通过河北省农作物品种委员会审定，审定编号：冀审麦2005006号，“陕229”是由陕西省农业科学院粮作所选育，1994年通过江苏省农作物品种委员会审定，审定编号：苏种审字227号。
实施例1、十倍体长穗偃麦草专化分子标记的开发及应用
1、基因组DNA的提取和纯化
利用CTAB法分别提取普通小麦中国春、十倍体长穂偃麦草、八倍体小偃麦“小偃68”和普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位系的基因组DNA，具体操作步骤如下：
(1)取适量幼嫩组织，在液氮中冷冻后迅速研磨成粉末并装入2mL离心管中。
(2)加入65℃预热的CTAB提取液800μL，剧烈振荡，65℃水浴40-60min，间或轻轻摇匀。
(3)取出离心管，每管加入800μL氯仿:异戊醇(24:1)，上下颠倒充分混匀，室温，12000rpm/min，离心15min。
(4)吸取上清液约600μL转移至新的1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃低温放置30min。
(5)室温，12000rpm/min离心10min，弃上清。
(6)加75％乙醇700μL，上下颠倒洗涤沉淀，4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
(7)65℃烘箱干燥3-5min，溶于适量含有RNase(10mg/mL)的1×TE中，37℃消化RNA1h，电泳检测DNA的质量，-20℃保存。
2、基于SLAF-seq技术获得特异序列标签
用SLAF-seq的方法对普通小麦中国春、十倍体长穂偃麦草、普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位系的基因组DNA进行测序(由北京百迈客生物科技有限公司完成)，得到各样品的序列标签。利用Blast方法将普通小麦-十倍体长穂偃麦草易位系序列标签与中国春序列标签及已知的小麦基因组序列进行比对，剔除与小麦序列相似度在50％以上的序列标签；余下的序列标签再与十倍体长穂偃麦草序列标签进行比对，获取相似度在50％以上的序列标签为十倍体长穗偃麦草特异SLAF序列标签。最终共获得十倍体长穗偃麦草特异序列标签585个。
3、十倍体长穗偃麦草专化分子标记的开发
根据SLAF-seq技术获得的序列标签，任意选择171个特异SLAF序列标签利用Primer Premier 5.0软件各设计引物1对。在生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，用HAP方式纯化。
4、PCR反应
以普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系(EA)及亲本普通小麦中国春(CS)、十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)为模板，根据测序获得的长穗偃麦草特异序列设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如表1所示，PCR反应程序如表2所示。
表1.PCR反应体系
| PCR反应组分 | 体积(μL) |
| 2×Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司) | 10 |
| H2O | 6.6 |
| DMSO | 0.8 |
| 引物F(10μM) | 0.8 |
| 引物R(10μM) | 0.8 |
| DNA(150ng/μL) | 1 |
| 总计 | 20 |
表2.PCR反应程序
5、琼脂糖凝胶电泳及PCR反应产物的纯化与测序
PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶，120V稳定电压下进行电泳20分钟，电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后，观察结果、拍照分析并对PCR产物进行纯化(生工生物工程(上海)股份有限公司试剂盒)与测序。若普通小麦-长穗偃麦草易位系及十倍体长穗偃麦草有扩增条带，而中国春没有扩增条带，则认为此标记为十倍体长穗偃麦草专化分子标记。
结果表明，171对引物中有67对引物在普通小麦-长穗偃麦草易位系和十倍体长穗偃麦草中均有扩增条带，而普通小麦中国春均没有扩增条带。本发明的67个十倍体长穗偃麦草专化分子标记均具有良好的准确性、可靠性和专化性，67个十倍体长穗偃麦草专化分子标记如表3所示。图1为专化分子标记EA2-31在普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系、中国春、十倍体长穗偃麦草中的扩增结果。从图1中可以看出：EA2-31在普通小麦-十倍体长穗偃麦草易位系(EA)和十倍体长穗偃麦草中均扩增得到大小为500bp的条带，而普通小麦中国春没有扩增条带。
表3.67个十倍体长穗偃麦草专化分子标记
实施例2、十倍体长穗偃麦草弥散重复序列特异探针的开发及应用
以十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum，2n＝10x＝70)为模板，采用实施例1中获得的67个专化分子标记进行PCR扩增，得到PCR产物。所得的PCR产物经纯化后标记成FISH探针，对八倍体小偃麦“小偃68”根尖体细胞有丝分裂中期分裂相进行原位杂交。选择在十倍体长穂偃麦草染色体上有特异杂交信号，而在小麦染色体上无杂交信号的探针作为十倍体长穂偃麦草专化荧光探针。同时以利用十倍体长穂偃麦草全基因组DNA做探针进行GISH分析作为对照，利用十倍体长穂偃麦草全基因组DNA做探针进行GISH分析的具体步骤参照文献“Q.Zheng,Z.Lv,Z.Niu,B.Li,H.Li,S.S.Xu,F.Han,Z.Li,Molecular cytogeneticcharacterization and stem rust resistance of five wheat-Thinopyrumponticumpartial amphiploids,J Genet Genomics 41(11)(2014)591-599.”中的方法。
1、荧光探针的制备
以十倍体长穗偃麦草基因组DNA为模板，分别采用实施例1中获得的67个专化分子标记进行PCR扩增，得到PCR产物，PCR产物纯化后，按照表4中的体系进行标记，分别制备得到荧光探针。标记的具体步骤如下：
1)按照表4中的浓度和组分配制标记体系，其中，标记的-dNTPs为Alexa Fluor-488-dUTP(绿光，购自Invitrogen公司)；未标记的-dNTPs购自Invitrogen公司；DNA聚合酶(浓度为10U/μL)购自Invitrogen公司；Dnase(浓度为100mU/μL)购自北京全式金生物技术有限公司；10×Nick translation buffer(溶剂为水)中含有500mM Tris，50mM MgCl2，pH＝7.8。
表4.标记体系
| 十倍体长穗偃麦草专化标记PCR产物DNA | 10μL |
| 10×Nick translation buffer | 2μL |
| 标记的-dNTP(1nM) | 0.5μL |
| 未标记的-dNTPs(每种2mM混合) | 2μL |
| DNA聚合酶(10U/μL) | 5μL |
| DNase(100mU/μL) | 0.5μL |
2)用枪头反复吹打步骤1)获得的标记体系，混匀，不能涡旋，15℃保温2小时。置于金属浴仪(H203-PRO，中国)中15℃反应2小时。13000rpm离心30-40min，弃上清，收集沉淀。
3)分别用70％乙醇和无水乙醇洗一次步骤2)获得的沉淀，避光晾干。然后向沉淀中加10μL缓冲液(10μL缓冲液由0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠，10mM Tris，1mM EDTA和水组成，化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司)，使探针终浓度为200ng/μL。
2、原位杂交
(1)根尖体细胞有丝分裂中期分裂相的制片
1)N2O处理根尖细胞
选择成熟饱满的种子，放入垫有潮湿滤纸的培养皿中，用水淋湿并保持一定的湿度，在23℃恒温培养箱内培养，待根尖长到1-2厘米时，剪取根尖，放入湿润的离心管中，盖上盖子后放入气室中处理2h，压强为10ATM(1.01Mpa)。
2)根尖固定
90％乙酸固定根尖10分钟，蒸馏水冲洗2次，每次5min。
3)酶解
用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入20μL混合酶溶液(1％的果胶酶Y-23和2％纤维素酶Onozuka R-10溶于1×柠檬酸缓冲液，均购于日本JapanYakult公司)，37℃水浴40-60min。
4)滴片镜检
70％酒精冲洗酶解后的根尖2次，余200μL的70％酒精在离心管里，捣碎根尖，低速离心10sec左右，将酒精倒干，根据植物根尖大小加冰乙醇(每个根尖20-40μL)悬浮根尖细胞；将干净的载玻片放入湿盒，将6-7μL的根尖细胞悬浮液滴到载玻片上，盖上盒盖，5分钟以后镜检，将染色体制片标本保存在冰箱中备用。
(2)原位杂交
将待杂交的载玻片放入紫外交联仪(code-No.CL-1000，购自美国UVP公司)中，UV能量为0.125J/cm2。将制片放在冰上，将探针与封阻按合适比例制备杂交液，每张载玻片上加杂交液6μL，盖上盖玻片，90℃变性5min，55℃湿盒内杂交过夜。取出制片，迅速放入2×SSC中使盖玻片滑落，用吸水纸把片子背面擦干，滴加抗褪色剂(含DAPI，H-1200，购自美国Vector Labs公司)，盖上24×50mm的盖玻片后，在荧光显微镜下检测、照相。
结果共开发得到如下5个十倍体长穗偃麦草专化荧光探针：pThp2.31、pThp2.77、pThp2.83、pThp3.93和pThp5.84探针，这5个专化荧光探针的SLAF序列及引物见表5，并对专化荧光探针在八倍体小偃麦“小偃68”上的杂交信号进行分析(图2)。分析结果表明：当利用十倍体长穗偃麦草基因组DNA做探针，普通小麦中国春DNA做封阻，对小偃68根尖染色体进行荧光原位杂交时(图2A)，探针与封阻的比例为1:200，6对来自长穗偃麦草的外源染色体以及1对含有小麦-长穗偃麦草易位染色体有明显的杂交信号，部分普通小麦染色体的中部出现明显的交叉杂交信号，说明长穂偃麦草的E、St染色体组与小麦A、B、D染色体组亲缘关系很近。交叉杂交现象普遍存在于小偃麦后代的GISH分析中，只能通过调整杂交过程中封阻DNA与探针DNA的比例，降低其强度，难以避免和根除。当利用十倍体长穗偃麦草荧光探针pThp3.93对小偃68进行荧光原位杂交分析时(图2B)，杂交信号弥散分布于长穂偃麦草染色体或染色体片段上，交叉杂交现象明显减弱，小麦-长穗偃麦草易位染色体中的偃麦草染色体片段更加明显。说明利用长穂偃麦草专化序列分析小偃麦杂交后代，不仅能有效降低基因组间非特异交叉杂交，免去摸索封阻与探针比例，而且还能获得比GISH分析更加清晰的效果，提高小偃麦中外源染色质鉴定效率。
十倍体长穗偃麦草荧光探针pThp2.31、pThp2.77、pThp2.83和pThp5.84的原位杂交结果与pThp3.93结果无显著性差异，均可用于检测或辅助检测十倍体长穗偃麦草染色体或其片段。
表5.长穗偃麦草专化荧光探针SLAF序列及引物
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 十倍体长穗偃麦草专化分子标记与探针的开发及其应用
<160> 134
<210> 1
<211> 25bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atctgtatcc ctagagtcgc tcatc 25
<210> 2
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
ccacttcttg gtgtagcagt gac 23
<210> 3
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
acacccgcca ctgctaagc 19
<210> 4
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ccatcactcc cacaacccat c 21
<210> 5
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
aggaaccttg aatttatggc acag 24
<210> 6
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
tgacaagtcg tgcagatttt cact 24
<210> 7
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
cagattatgt ggacttactc ggca 24
<210> 8
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
tccaaaacct gttgtctaga gcct 24
<210> 9
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
cgaaagactg gcacggataa g 21
<210> 10
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
tgagtcggca ataccccaac 20
<210> 11
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
actaaaggaa catgcggtca cac 23
<210> 12
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
ttgttagtga cttaacggtg gcac 24
<210> 13
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
agtttcaggt tccgacagaa t 21
<210> 14
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
cagttgttct tgctgtggct 20
<210> 15
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
gttgataatc ttggagatga t 21
<210> 16
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
tgacaaactc atgcctctag g 21
<210> 17
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
ccattcatgt cggaccaaaa 20
<210> 18
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
cgctgcatgg cgtgattgat 20
<210> 19
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
gaagagaagg agaaggacgg g 21
<210> 20
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
tgtaatgact aggtgtttgg c 21
<210> 21
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
tcaggtctcg gcatctcatc t 21
<210> 22
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
ttatatttcc ctttgtttgc a 21
<210> 23
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
ggtttgagaa aaacaacatg a 21
<210> 24
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
atcgatcaca aggagaaacg 20
<210> 25
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
accgtggggg tggataag 18
<210> 26
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
cgagaaactg cattaagtaa a 21
<210> 27
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
ctcagtggta gcagcctc 18
<210> 28
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
cagcgacttg caagtcttgc 20
<210> 29
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
catcaccaca tggctttcaa 20
<210> 30
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
taatattttg actagcatgc g 21
<210> 31
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
aaagacaaag acagtgatta c 21
<210> 32
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
tcataatatc atgtatgcc 19
<210> 33
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
cagcccagag aattttttt 19
<210> 34
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
agtgaggttt acttaagcaa c 21
<210> 35
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 35
ttatagcgaa ggtcaccgta c 21
<210> 36
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 36
cgttcatgat tggatcagaa g 21
<210> 37
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 37
agctgctgca accccagcct 20
<210> 38
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 38
cacgtctaac agccaacagt t 21
<210> 39
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 39
gaagatacgc tatcggttca a 21
<210> 40
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 40
cgttcataaa caacggagca 20
<210> 41
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 41
tacatttgat cagctgagca acc 23
<210> 42
<211> 24bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 42
aaacataact gtggtttagt aaag 24
<210> 43
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 43
ctgatcttcg tcgtgggtca t 21
<210> 44
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 44
agtgtacatc cactcacaat cc 22
<210> 45
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 45
aggtgttctg tgcactactc tg 22
<210> 46
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 46
aagaaggtgg tatgccctct ta 22
<210> 47
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 47
caggttagtt ggtgatttat tt 22
<210> 48
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 48
atgtgcattt atgttcacag a 21
<210> 49
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 49
ggctcctctc ttttgagggg tta 23
<210> 50
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 50
agtattacaa agaaaacaaa ga 22
<210> 51
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 51
aagaaggtga cgcgtttttt tc 22
<210> 52
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 52
tagctgttaa gctacagcat ag 22
<210> 53
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 53
acacatgacc ctccaactgc a 21
<210> 54
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 54
ttgaagatgt gaatgccaat c 21
<210> 55
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 55
actgatgttt tactttttta ttt 23
<210> 56
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 56
atcactgtgt ctcaatgctt cca 23
<210> 57
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 57
gctagtgggt ggacctgctc 20
<210> 58
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 58
ccatgctcgc cagcacct 18
<210> 59
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 59
cttgctctag agcaaaaact ag 22
<210> 60
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 60
ttacacgtac ctttcacaaa gca 23
<210> 61
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 61
agggtgatat acagcctatc 20
<210> 62
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 62
cacccctaat taaacctgtt tag 23
<210> 63
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 63
tgcttcaatg cttgctcatc 20
<210> 64
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 64
ttaaggtttt ttttttgggg tag 23
<210> 65
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 65
acaagagttg gggtctgata tgg 23
<210> 66
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 66
aggttcaact aaggatccat c 21
<210> 67
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 67
agggggattt acagcctatc taa 23
<210> 68
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 68
cacccctaat taacccaa 18
<210> 69
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 69
cctataaatc aaatatcgtc tag 23
<210> 70
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 70
agtgttcccc aaatatccat ctc 23
<210> 71
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 71
acaataagac cactcgacaa a 21
<210> 72
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 72
gtattaatga ggtcaaaaag tgt 23
<210> 73
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 73
tggtttgcga cacttgaa 18
<210> 74
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 74
tgagttccag gctgcttttc at 22
<210> 75
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 75
tttttcattt ttcctttttc tgt 23
<210> 76
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 76
ctctgtaaca ccccatgtca tt 22
<210> 77
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 77
tcccattcgg cgaggcttca tta 23
<210> 78
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 78
ctttgggtga gatcatagaa tca 23
<210> 79
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 79
ctgttgactg gtcagctga 19
<210> 80
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 80
tcgggagcta cggcgacgt 19
<210> 81
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 81
attctctgga catgcattgt tgc 23
<210> 82
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 82
cacattgcaa atggatggga 20
<210> 83
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 83
atgtatatcg aaggcaaaca tac 23
<210> 84
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 84
actttgtagt tagaaacaga gga 23
<210> 85
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 85
ggcatcccat tcttcccgta 20
<210> 86
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 86
tctatatgta cctgcttcaa 20
<210> 87
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 87
ccatgagagc gaagatgat 19
<210> 88
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 88
acttgtgcat atttgtaaaa tgt 23
<210> 89
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 89
ttagattgta acgcaacctg gg 22
<210> 90
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 90
aacgacatta tcttgctttg ct 22
<210> 91
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 91
aaaggacgac tataagggtc aca 23
<210> 92
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 92
tgataggaat gttttggtga gg 22
<210> 93
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 93
aggttcacct caggatccat ct 22
<210> 94
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 94
aaaagatttg gggtctaatg cag 23
<210> 95
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 95
cctcttcttt ctcttagttg ccc 23
<210> 96
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 96
atgtattcat ctcttgggta c 21
<210> 97
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 97
tgataaaccc tccgctgcca a 21
<210> 98
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 98
agcctcgttg agcccagt 18
<210> 99
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 99
ctccgagttc caaacggcta 20
<210> 100
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 100
agtgtacgac tcctctgggc att 23
<210> 101
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 101
cttagttata tgcaaactta gca 23
<210> 102
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 102
ctctaatgcc atccatgtcg aa 22
<210> 103
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 103
ccaggggtct cttttccctc ata 23
<210> 104
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 104
acagtcatgc ttgatacaag cag 23
<210> 105
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 105
aaaagatttg gggtctaatg cag 23
<210> 106
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 106
aggttcacct caggatccat ct 22
<210> 107
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 107
cagtctgagt ttactgtttt aaa 23
<210> 108
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 108
aggtgactca tgatcaacca ac 22
<210> 109
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 109
ctctcatgcc atccatgttg aa 22
<210> 110
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 110
ccctccgcac tgcactctt 19
<210> 111
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 111
cactgtgaca cccggtttgt aat 23
<210> 112
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 112
aggggaggtt tcgtccacat t 21
<210> 113
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 113
gcctgtcaca catacttcag tcg 23
<210> 114
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 114
tgcagcttgt tcaggagagg 20
<210> 115
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 115
agtgaataaa ctaatagatc aaa 23
<210> 116
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 116
cacataactt cctcggattg c 21
<210> 117
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 117
atccatttcc cctacatcca ac 22
<210> 118
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 118
catttggggc gcattttt 18
<210> 119
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 119
tgcgtctcat ttgccacat 19
<210> 120
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 120
ggcgacgccg acggaagc 18
<210> 121
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 121
aaggaactag tccagatttc ca 22
<210> 122
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 122
accacaatga tcttgtgatt g 21
<210> 123
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 123
gttggcaccg tcaatggc 18
<210> 124
<211> 23bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 124
agactagtac tccctcggtt cca 23
<210> 125
<211> 18bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 125
cgtcggagag gcgtagcg 18
<210> 126
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 126
accgaactcc gtcacacgtt 20
<210> 127
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 127
atgtattcat ctcttgggta c 21
<210> 128
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 128
cctcttcttt ctcttagttg cc 22
<210> 129
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 129
atcctacgtc gcccggtaca aa 22
<210> 130
<211> 19bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 130
cccaaatccg ggatggtgt 19
<210> 131
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 131
gatataccgg agcattggga 20
<210> 132
<211> 21bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 132
acccacagac agactctgcc t 21
<210> 133
<211> 22bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 133
ttcacgggta actcatgttg gt 22
<210> 134
<211> 20bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 134
accggactcg gtgctacttg 20
<210> 135
<211> 469bp
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 135
atgtattcat ctcttgggta ccttcatggt caacccgaat ccacttcact cgcgggtacc 60
cctaggggcc gacccgactt taatcagtat cagtagtaaa gtcatagtaa ccgtgtgtcc 120
aaaacatcaa ggaggaatct gaggaatcac cctcgttgga ctcccactag atgtatccgt 180
caaggtgaat ccagaggaat caccctcgat ggcattcaca cttacggggt tgcacgacag 240
aagcttcatc ggaggtggtg aaagaggaat caccctcgga aacccacaac tgactagctg 300
tactacaaag acaacatcaa gagtgagata agaggtatca ccctcggcac tcaatattag 360
ctctgcagag tggagcaact taggtgcggt gatgtgctag tctcagcccg ttcgatcaca 420
tcgatcgggg cacaggtact aaagcggggc aactaagaga aagaagagg 469
Claims (10)
1.一种长穗偃麦草染色体分子标记，为如下A1)或A2)：
A1)是以长穗偃麦草的基因组DNA为模板，采用引物对64进行扩增得到的DNA分子：
A2)是以长穗偃麦草的基因组DNA为模板，采用如下引物对1-引物对67中的任一对进行扩增得到的DNA分子：
所述引物对1由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；
所述引物对2由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；
所述引物对3由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对4由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成；
所述引物对5由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成；
所述引物对6由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；
所述引物对7由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对8由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；
所述引物对9由序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子组成；
所述引物对10由序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子组成；
所述引物对11由序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子组成；
所述引物对12由序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子组成；
所述引物对13由序列25所示的单链DNA分子和序列26所示的单链DNA分子组成；
所述引物对14由序列27所示的单链DNA分子和序列28所示的单链DNA分子组成；
所述引物对15由序列29所示的单链DNA分子和序列30所示的单链DNA分子组成；
所述引物对16由序列31所示的单链DNA分子和序列32所示的单链DNA分子组成；
所述引物对17由序列33所示的单链DNA分子和序列34所示的单链DNA分子组成；
所述引物对18由序列35所示的单链DNA分子和序列36所示的单链DNA分子组成；
所述引物对19由序列37所示的单链DNA分子和序列38所示的单链DNA分子组成；
所述引物对20由序列39所示的单链DNA分子和序列40所示的单链DNA分子组成；
所述引物对21由序列41所示的单链DNA分子和序列42所示的单链DNA分子组成；
所述引物对22由序列43所示的单链DNA分子和序列44所示的单链DNA分子组成；
所述引物对23由序列45所示的单链DNA分子和序列46所示的单链DNA分子组成；
所述引物对24由序列47所示的单链DNA分子和序列48所示的单链DNA分子组成；
所述引物对25由序列49所示的单链DNA分子和序列50所示的单链DNA分子组成；
所述引物对26由序列51所示的单链DNA分子和序列52所示的单链DNA分子组成；
所述引物对27由序列53所示的单链DNA分子和序列54所示的单链DNA分子组成；
所述引物对28由序列55所示的单链DNA分子和序列56所示的单链DNA分子组成；
所述引物对29由序列57所示的单链DNA分子和序列58所示的单链DNA分子组成；
所述引物对30由序列59所示的单链DNA分子和序列60所示的单链DNA分子组成；
所述引物对31由序列61所示的单链DNA分子和序列62所示的单链DNA分子组成；
所述引物对32由序列63所示的单链DNA分子和序列64所示的单链DNA分子组成；
所述引物对33由序列65所示的单链DNA分子和序列66所示的单链DNA分子组成；
所述引物对34由序列67所示的单链DNA分子和序列68所示的单链DNA分子组成；
所述引物对35由序列69所示的单链DNA分子和序列70所示的单链DNA分子组成；
所述引物对36由序列71所示的单链DNA分子和序列72所示的单链DNA分子组成；
所述引物对37由序列73所示的单链DNA分子和序列74所示的单链DNA分子组成；
所述引物对38由序列75所示的单链DNA分子和序列76所示的单链DNA分子组成；
所述引物对39由序列77所示的单链DNA分子和序列78所示的单链DNA分子组成；
所述引物对40由序列79所示的单链DNA分子和序列80所示的单链DNA分子组成；
所述引物对41由序列81所示的单链DNA分子和序列82所示的单链DNA分子组成；
所述引物对42由序列83所示的单链DNA分子和序列84所示的单链DNA分子组成；
所述引物对43由序列85所示的单链DNA分子和序列86所示的单链DNA分子组成；
所述引物对44由序列87所示的单链DNA分子和序列88所示的单链DNA分子组成；
所述引物对45由序列89所示的单链DNA分子和序列90所示的单链DNA分子组成；
所述引物对46由序列91所示的单链DNA分子和序列92所示的单链DNA分子组成；
所述引物对47由序列93所示的单链DNA分子和序列94所示的单链DNA分子组成；
所述引物对48由序列95所示的单链DNA分子和序列96所示的单链DNA分子组成；
所述引物对49由序列97所示的单链DNA分子和序列98所示的单链DNA分子组成；
所述引物对50由序列99所示的单链DNA分子和序列100所示的单链DNA分子组成；
所述引物对51由序列101所示的单链DNA分子和序列102所示的单链DNA分子组成；
所述引物对52由序列103所示的单链DNA分子和序列104所示的单链DNA分子组成；
所述引物对53由序列105所示的单链DNA分子和序列106所示的单链DNA分子组成；
所述引物对54由序列107所示的单链DNA分子和序列108所示的单链DNA分子组成；
所述引物对55由序列109所示的单链DNA分子和序列110所示的单链DNA分子组成；
所述引物对56由序列111所示的单链DNA分子和序列112所示的单链DNA分子组成；
所述引物对57由序列113所示的单链DNA分子和序列114所示的单链DNA分子组成；
所述引物对58由序列115所示的单链DNA分子和序列116所示的单链DNA分子组成；
所述引物对59由序列117所示的单链DNA分子和序列118所示的单链DNA分子组成；
所述引物对60由序列119所示的单链DNA分子和序列120所示的单链DNA分子组成；
所述引物对61由序列121所示的单链DNA分子和序列122所示的单链DNA分子组成；
所述引物对62由序列123所示的单链DNA分子和序列124所示的单链DNA分子组成；
所述引物对63由序列125所示的单链DNA分子和序列126所示的单链DNA分子组成；
所述引物对64由序列127所示的单链DNA分子和序列128所示的单链DNA分子组成；
所述引物对65由序列129所示的单链DNA分子和序列130所示的单链DNA分子组成；
所述引物对66由序列131所示的单链DNA分子和序列132所示的单链DNA分子组成；
所述引物对67由序列133所示的单链DNA分子和序列134所示的单链DNA分子组成。
2.用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的探针，为如下B1)或B2)：
B1)所述探针为序列135所示的DNA分子；
B2)所述探针是以长穗偃麦草染色体的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述的引物对64或引物对18或引物对40或引物对43或引物对66进行扩增得到的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：
所述探针标记有荧光基团；
或，所述荧光基团具体为绿色荧光基团。
4.用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的引物对，为权利要求1中所述的引物对1-引物对67中的任一对。
5.用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的PCR试剂，包括权利要求4所述的引物对。
6.用于检测或辅助检测长穗偃麦草染色体的试剂盒，包括权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR试剂。
7.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的探针或权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在如下1)-10)中任一种中的应用：
1)检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段；
2)制备检测或辅助检测长穗偃麦草染色体或其片段的产品；
3)检测或辅助检测待测植物中是否含有长穗偃麦草染色体或其片段；
4)制备检测或辅助检测待测植物中是否含有长穗偃麦草染色体或其片段的产品；
5)追踪长穗偃麦草染色体或其片段；
6)制备追踪长穗偃麦草染色体或其片段的产品；
7)分子标记辅助选择育种；
8)制备分子标记辅助选择育种的产品；
9)小麦分子育种；
10)制备小麦分子育种的产品。
8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的探针或权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒或权利要求7所述的应用，其特征在于：所述长穗偃麦草为十倍体长穗偃麦草。
9.一种检测或辅助检测待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法，包括如下步骤：用权利要求2或3所述的探针对待测植物进行原位杂交，若出现杂交信号，则表示待测植物中含有或候选含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段；
所述原位杂交不含有封阻的步骤。
10.一种检测或辅助检测待测植物中是否含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段的方法，包括如下步骤：用权利要求4所述的引物对待测植物进行扩增，若实现成功扩增，则表示待测植物中含有或候选含有十倍体长穗偃麦草染色体或其片段。
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| CN110029188A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-19 | 四川农业大学 | 一种四倍体长穗偃麦草1e染色体分子标记及其应用 |
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