CN102888400A - 基于SLAF-seq开发的长穗偃麦草7E染色体特异分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物遗传育种领域，具体为根据基于新一代测序技术和生物信息学原理而发展的特异性长度扩增片段测序技术，对普通小麦和普通小麦-长穗偃麦草附加系的特异片段进行测序，获得海量普通小麦、长穗偃麦草序列，利用计算机软件进行序列数据比对分析，获得大量长穗偃麦草7E染色体特异片段序列，从而开发出10个长穗偃麦草7E染色体特异分子标记。这些标记不仅可用于长穗偃麦草7E染色体的检测，还可为小麦抗性育种中的分子标记辅助选择。此外，基于SLAF-seq技术开发长穗偃麦草染色体特异分子标记的成功，也为该技术应用于其它物种的分子标记开发提供了重要借鉴，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要的应用基础。

Description

基于SLAF-seq开发的长穗偃麦草7E染色体特异分子标记及应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，具体为根据基于新一代测序技术和生物信息学原理而发展的特异性长度扩增片段测序技术（Specific Length Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）对普通小麦和普通小麦-长穗偃麦草附加系的特异片段进行测序，获得海量普通小麦、长穗偃麦草序列，利用计算机软件进行序列数据比对分析，获得大量长穗偃麦草7E染色体特异片段序列，从而开发出大量长穗偃麦草7E染色体特异分子标记。这些标记不仅可用于长穗偃麦草7E染色体的检测，还可为小麦抗性育种中的分子标记辅助选择提供重要的理论与标记基础。此外，基于SLAF-seq技术开发长穗偃麦草特异染色体分子标记的成功，也为该技术应用于其它物种的分子标记开发提供了重要借鉴，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要的应用基础。 

背景技术

 1小麦育种目标和其野生近缘种

小麦（Triticum aestivum）是世界上总产量仅次于玉米的第二大粮食作物，是人类的主食之一。随着人口的急剧增长、耕地面积的减少，提高小麦产量已成为全世界面临的一个严峻问题。目前小麦育种的主要目标仍然是高产、抗逆和优质，分子标记辅助选择、外源优良基因的应用、多基因聚合是现代小麦育种研究热点(何中虎等, 2006)。在育种过程中频繁地使用少数几个亲本，使小麦品种的遗传组成趋向单一化，遗传变异日益贫乏，某种程度上限制了小麦产量的提高（贾继增等，2001）。许多小麦野生近缘物种中存在着大量小麦中所没有的有利遗传资源，充分开发和利用小麦近缘野生种中的优良基因资源培育小麦新品种，已成为小麦育种的目标之一（吕伟东等，2007）。

普通小麦(AABBDD, 2n=42)是异源六倍体植物，属于禾本科小麦属普通小麦种(Triticum aestivum L.)，与小麦属关系比较近的属有大麦属(Hordeum)、披碱草属(Elymus)、蝟草属(Asperella)、细坦麦属(Sitanion)、新麦草属(Psathyrostachys)、棱轴草属(Crithopsis)、带芒草属(Taeniatherum)、冰草属(Agropyron)、簇毛麦属(Haynaldia)、黑麦属(Secale)、异形花属(Heteranthelium)、无芒草属(Henrardia)、旱麦草属(Eremopyrum)、山羊草属(Aegilops)等。这些野生近缘种植物中蕴含着栽培小麦中所没有的大量优良基因，是一个巨大的具有潜在利用价值的遗传基因库。该基因库的优良基因如得到利用,对小麦遗传改良将具有重要的价值，不仅能提高其产量、改良品质，更能将丰富的抗病、抗逆基因转入小麦中，改良小麦的抗病性和抗逆性。目前已经与小麦进行杂交的种属有黑麦属(Sando et al, 1953)、簇毛麦属(Sears et al, 1953; Hyde et al, 1953)、偃麦草属(Dvorák et al, 1974)、山羊草属(Sears et al, 1956; Chapmna et al, 1970)、大麦属(Kruse et al, 1973; Islam et al, 1975)等。这些远缘杂交的成功为近缘野生种的抗旱、耐盐碱以及抗病虫害的优良基因向小麦基因组进行转移奠定了坚实的基础，使得从小麦近缘种属中寻找或开拓新的重要基因资源成为可能。随着现代分子生物学的发展，分子标记与作物育种相结合，它不仅弥补了作物育种中传统的选择准确率低的缺点，而且加快了育种进程。 

 2小麦的赤霉病抗性

小麦赤霉病（Fusarium head blight , FHB）又叫烂麦头、红麦头、麦穗枯，是主要由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)引起的一种世界性病害，尤其在温暖湿润和半湿润地区发生严重，是影响小麦高产、稳产和品质的重要因素之一（陆维忠等, 2001；Duveiller E,et al，2008）。赤霉病大流行年份病穗率达50％～100％，减产高达10％～40％（姚金保等，2000）。此外,该病由多种镰刀菌引起, 病原菌侵染小麦籽粒后产生多种真菌毒素，特别是其中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素会严重威胁人类和家畜的健康（Bai, et al，2004；宋凤英等, 2005）。我国长江中下游冬麦区是小麦赤霉病的多发区和重灾区, 近年来黄淮麦区和关中麦区小麦赤霉病发生也日趋严重，影响着国内小麦主产区的粮食安全。随着全球性气候变暖和玉米-小麦轮作制度的增加，近10多年来小麦赤霉病在北美和欧洲也大面积发生，造成严重的产量和经济损失(Bai，et al, 2004)。

国内外小麦遗传育种家都围绕小麦赤霉病开展了广泛的研究工作，培育抗赤霉病品种是减轻小麦赤霉病危害的根本途径，也是近年来小麦育种的重要目标之一。我国从上世纪70年代中期开始对小麦赤霉病进行研究，研究表明小麦赤霉病抗性具有遗传基础,并且培育出一批抗性较强的优质高产小麦新品种，如苏麦3号、望水白、红和尚等(姚金宝等, 2000)。目前已经发现的具有赤霉病抗性的QTL涉及到小麦基因组中除7D以外的所有20个连锁群（Bai ,et al，2004；Haberle , et al，2009；Holzapfel , et al，2008；Lin , et al，2006；Ma , et al，2006），在小麦中发现的主效抗性基因有Fhb1（Liu ,et al，2008）、Fhb2（Cuthert ,et al，2007）、Fhb4（Xue ,et al，2010）和 Fhb5（Xue , et al，2011）等。同时，研究表明小麦种内抗赤霉病的资源很少,而且已经发现的抗性资源在小麦育种实际中也难以有效利用。为了进一步提高小麦抗赤霉病育种的效率,扩大抗赤资源的利用范围,需要从小麦近缘物种中寻找相关的抗病基因（葛江燕等，2012；陈士强等，2012）。现已成功地进行了小麦与大赖草(Leymus racemosus)、长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)、中间偃麦草(L.intermedium)、黑麦(Secale cereale)、簇毛麦(Haynaldia villosa)等多种近缘物种的杂交，并获得了一些具有赤霉病抗性的材料（Oliver,et al.，2005）。其中，大赖草中的Fhb3（Qi ,et al.，2008）和长穗偃麦草中的 Fhblop（Zhang ,et al.，2011）两个赤霉病主效抗性基因的发现，使小麦近缘种的赤霉病主效抗性基因的相关研究得到了更大的关注。 

 3长穗偃麦草赤霉病抗性及特异分子标记发展

偃麦草属(Thinopyrum) 是禾本科大麦族(Horseae)，小麦亚族(Triticeae)中的多年生草本植物，与普通小麦的亲缘关系较近，世界范围内约有50种，主要分布在温带和寒带地区。该属适应性和繁殖能力较强，并且具有许多优良基因和性状，如抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱和穗大多花等，是小麦遗传改良中极具应用价值的小麦近缘物种之一（Dvorák.J, et al.，1974；吕伟东等,2007；王黎明等,2005）。自然界中存在3种类型的长穗偃麦草，即二倍体长穗偃麦草(Th.elongatum , 2n = 14)、四倍体长穗偃麦草(Th.elongatum , 2n = 28)和十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum , 2n = 70)。二倍体长穗偃麦草具有E染色体组, 它是偃麦草属多倍体物种的基本染色体组(Dewey et al, 1984)。一整套中国春-长穗偃麦草二体异附加系、代换系的获得为深入研究长穗偃麦草奠定了很好的基础（Dvorák J,et al.，1974）。研究表明，长穗偃麦草具有良好的赤霉病抗性,在长穗偃麦草1E染色体上携带赤霉病抗性的主效基因（刘登才等,2001； Jauhar PP, et al.，2009；英加等,2000）。在长穗偃麦草的7E染色体也具有赤霉病抗性基因，其中抗性基因Fhblop已被定位于7E染色体的长臂上（Somers , et al.，2003；Shen , et al.，2004；徐国辉等, 2009； Zhang , et al.，2011），因此，长穗偃麦草已成为改良普通小麦遗传基础、提高赤霉病抗性的重要野生近缘物种之一（王黎明等，2005）。

现在公认的赤霉病抗性类型有typeⅠ（抗侵染）、typeⅡ（抗扩展）、typeⅢ（降解毒素的能力）及typeⅣ（耐毒素的能力）等四种，typeⅠ和typeⅡ是研究最多的两种类型（Lin , et al，2006；Comeau , et al，2004）。抗侵染反映的是小麦抵抗赤霉菌初侵染的能力，而抗扩展反映的是在赤霉菌侵染后宿主抵御其通过菌丝生长沿着穗轴延伸的能力。目前鉴定小麦赤霉病抗性的方法主要有自然诱发鉴定和人工诱发鉴定两种。人工诱发鉴定方法包括病麦粒土表接种、喷雾接种、离体叶片接种、单花滴注接种等（薛树林等,2010）。但对于赤霉病抗性的鉴定，研究者使用的方法和表示参数各不相同,而且抗性鉴定结果受环境条件的影响比较大,建立稳定可靠的赤霉病接种方法和鉴定标准是评价品种抗病性最关键的问题。为了使抗性鉴定更加准确,研究者将目标转移到分子标记。 

分子标记辅助选择(MAS)是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段(Ribaut et al, 1998)。在长穗偃麦草向小麦转移优良的抗赤霉病基因的研究中,已有部分研究进行了长穗偃麦草染色体特异分子标记研究，长穗偃麦草1E和3E染色体的3个特异的RAPD标记OPE-05₁₃₀₀、OPF-03₇₀₀和OPF-15₄₀₀，可以用来快速鉴定1E和3E染色体(刘树兵等, 1998)。利用SSR分子标记技术，建立了一个偃麦草E染色体组特异的微卫星分子标记，该标记也可以作为E染色体的特异SSR标记(尤明山等, 2003)。Shen等通过分布在小麦第7连锁群的52对SSR引物进行特异扩增，发现5对引物在7E上表现出特异性(Shen，et al，2004)。陈国跃等利用已知植物抗病基因编码氨基酸保守区域设计了简并引物，应用RGAP分子标记技术构建了一套完整的长穗偃麦草1E～7E染色体的特异RGAP标记(陈国跃等，2007)。张丽等利用AFLP引物筛选出28个长穗偃麦草E组染色体特异分子标记，并将其中5个转化为STS标记，可用于小麦背景中长穗偃麦草遗传物质的检测(张丽等，2008)。然而,以上发展的长穗偃麦草染色体特异分子标记不但数量少,远远满足不了小麦抗性育种实际的需要, 而且染色体特异性及稳定性还不理想,发展更多的覆盖相关染色体的分子标记,进一步研究这些分子标记与抗病,抗逆基因的连锁关系,在小麦抗逆、抗病育种实际中利用这些标记进行辅助选择是非常重要和迫切需要的。 

 4分子标记技术的发展

4.1 基于分子杂交技术的分子标记

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymor- phism, RFLP) 是Grodzicker等1974年创立的标记技术，用作腺病毒温度敏感突变的遗传标记(Grodzicker et al, 1974)，它是一种以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。利用特定的限制性内切酶切割不同的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，通过凝胶电泳分离出不同带，然后与DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。

4.2 基于PCR技术的分子标记 

4.2.1 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD)  1990年由Williams等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法(Williams et al, 1990)。它利用随机引物(一般为8~10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。但是RAPD受反应条件影响较大，因而其检测的重复性较差。

4.2.2 序列标签位点(Sequence Tagged Sites, STS)  1989年Olson等提出，是以特定引物进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组DNA序列中特定位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。 

4.2.3 简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)  也称微卫星DNA (Tautz et al, 1989; Love et al, 1990)，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复序列，其中最常见是双核苷酸重复和三核苷酸重复，如(CA)_n、(AT)_n、(TG)_n、(GGC)_n、(GAT)_n等。每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目一般为10~60，它们广泛分布于绝大多数真核生物基因组中，其多态性主要来源于串联重复数目的不同。微卫星序列两侧一般是相对保守的单拷贝序列，根据保守序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定多态性。SSR标记一般检测到的是单一的多等位基因位点，而且呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子。但是，传统的SSR分子标记开发方法工作量大,需花费大量人力、物力进行测序,而且效率较低。 

4.2.4 简单重复序列间区(inter-simple sequence repeat, ISSR) Zietkei- witcz等于1994年提出的一种以微卫星为基础的分子标记，它检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。由于SSR序列广泛分布于高等生物的基因组中，所以ISSR具有很强的多态性。目前，ISSR标记已广泛应用于多种植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究中,但在长穗偃麦草中没有进行研究. 

4.2.5 反转座子位点间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified poly- merphism, IRAP)  其原理是基于反转录转座子在基因组中的广泛分布，根据反转录转座子中LTR的保守序列设计引物，这些引物在PCR过程中可以与LTR序列退火，从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可以根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增(Kalendar et al.1999)。目前，IRAP分子标记技术已应用于大麦(Kalendar et al, 1999; Kalendar et al, 2000; Leigh et al, 2003)、柑橘(Bretó et al, 2001)、网茅(Yannic et al, 2004)、马铃薯等植物的遗传研究中。

4.2.6 反转座子微卫星扩增多态性(retrotransposon microsatellite ampli- fied polymorphism, REMAP)  一种基于基于反转录转座子、微卫星在基因组中的广泛分布而发展的标记技术(Kalendar et al, 1999)。REMAP技术原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物，然后进行PCR，扩增出反转录转座子与邻近的微卫星间的片段，从而检测出反转录转座子与邻近简单重复序列之间的多态性。 

4.3 基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记 

扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphi- sm, AFLP)  AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DN A多态性的新方法(Zbaeau et al, 1993)。AFLP是RFLP与PCR相结合的产物，先利用限制性内切酶将基因组 DNA 切割成不同大小的DNA片段，以双链人工接头与酶切片段相连接作为PCR扩增反应的模板DNA。利用人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。随着技术的不断完善和发展, AFLP技术已广泛应用于植物种质鉴定(Thomas et al, 1995)、遗传图谱构建(Margues et al, 1998)、目的基因定位及遗传多态性检测(Pakniyat et al, 1997)等方面。

4.4 基于DNA芯片技术的分子标记 

4.4.1 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)   Lander于1996年提出的第三代DNA遗传标记，是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性,其多态性频率大于1%。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测。

4.4.2 多样性微阵列技术(Diversity arrays technology, DArT)  Jaccoud等开发了一种新的分子标记技术多样性微阵列技术(Jaccoud，et al，2001), 并成功应用于水稻研究中。DArT技术是依赖芯片杂交的方法来区分基因组中座位多态性的差异。将待检测的不同样本的基因组DNA等量混合后经相关限制性内切酶处理，根据电泳结果选择回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而达到基因组复杂性减少，该部分DNA即为基因组代表，并通过相关过程将该部分DNA固定到玻片上形成点阵列的芯片。以不同样本单独经同样内切酶处理所获的基因组代表为探针，并组成相应的探针组合对芯片进行杂交，由于不同样本的基因组DNA序列有差异，因而与芯片上同一点序列杂交的效率不一致，芯片上只有与探针DNA互补的点才具有杂交信号，通过扫描仪可识辨不同颜色杂交信号的强弱或有无来确定待检测样本的遗传差别。DArT技术已在大麦、拟南芥、小麦和高梁等植物中得到应用。 

本发明利用基于新一代测序技术和生物信息学原理而发展的特异性长度扩增片段测序技术（Specific Length Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq）对普通小麦和普通小麦-长穗偃麦草附加系的特异片段进行测序，获得海量普通小麦、长穗偃麦草序列，利用计算机软件进行序列数据比对分析，获得大量长穗偃麦草7E染色体特异片段序列，从而开发出大量长穗偃麦草7E染色体特异分子标记。这些标记不仅可用于长穗偃麦草7E染色体的检测，还可为小麦抗性育种中的分子标记辅助选择提供重要的理论与标记基础。本发明所用的SLAF-seq技术还未在长穗偃麦草中应用, 所获长穗偃麦草7E染色体特异分子标记重复性强、稳定性高、成本低，为该技术在其它物种中进行分子标记开发提供了重要借鉴。 

发明内容

本发明利用SLAF-seq技术获得了长穗偃麦草及其7E染色体特异片段的序列，并成功获得了长穗偃麦草染色体特异分子标记10个。 

长穗偃麦草7E染色体特异分子标记，其对应的特异引物是下列10对引物之一： 

①：特异标记SLAF31945，特异引物SPECh_No.2

L: 5’-AGCAAATAAAACGACAGT -3’

R: 5’- GGTTTTCACCAATTACAG-3’ 

②：特异标记SLAF27230，特异引物SPECh_No.3

L: 5’-AGTGAATCTGAGATGCATAT-3’

R: 5’- ATTTTGTTTTTACCATTTTT -3’ 

③：特异标记SLAF5720，特异引物SPECh_No.6

L: 5’- TTTTTCTGGTACTTACTAAC -3’ 

R: 5’- TGTTCTGTGAGATGAATGTT -3’

④：特异标记SLAF48385，特异引物SPECh_No.8

L: 5’- AGTCAAGGCAAATTATGGT -3’

R: 5’- ACTGTCTAATGTCTCGTAAT -3’

⑤：特异标记SLAF72555，特异引物SPECh_No.11

L: 5’- ACACAAAGGTGAGTGAAAAC -3’

R: 5’- GAGTAGCAAAAATCTCAACA -3’

⑥：特异标记SLAF14034，特异引物SPECh_No.12

L: 5’-CTACCCTTACCACCTCG -3’ 

R: 5’-CCACTGGATGCTGTTTAT -3’

⑦：特异标记SLAF32494，特异引物SPECh_No.13  

L: 5’-GGTAAGCTTGAAATACATGA-3’ 

R: 5’- TCCAAGTGATATTGTAGTCG-3’ 

⑧：特异标记SLAF1998，特异引物SPECh_No.14

L: 5’-CACTTGTGCATATTCGAGAG -3’ 

R: 5’-CCATTTTCCAATATATACAA -3’ 

⑨：特异标记SLAF47229，特异引物SPECh_No.15

L: 5’- GAAATGGCAAGTACCTAA-3’

R: 5’- CAAGTAGAAGTTCAGCAA-3’

⑩：特异标记SLAF1699，特异引物SPECh_No.16 

L: 5’- TACACAGAAGGAAAGCATTA-3’

R: 5’- CATCAGAAATTTTCTTTTGA -3’ 。

本发明所获得的长穗偃麦草染色体特异标记在不同材料和不同世代间表现重复性好、扩增稳定、操作简便，不仅可用于长穗偃麦草7E染色体的检测，跟踪长穗偃麦草的染色体或染色体片段；还可用于抗性基因（如抗赤霉病、抗锈病等基因）的连锁分析,为小麦抗性育种中充分利用长穗偃麦草优良抗性基因进行分子标记辅助选择提供重要了标记基础。 

本发明利用SLAF-seq技术开发长穗偃麦草特异分子标记周期短、成本低、效率高，可为在其它物种中开发特异分子标记提供重要的成功案例，也为分子育种、系统进化、种质资源鉴定中所用分子标记提供了重要的开发途径。 

附图说明

图1  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF31945在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图2 长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF27230在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图3  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF5720在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图4  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF48385在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图5  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF72555在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图6 长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF14034在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图7 长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF32494在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图8  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF1998在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图9  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF47229在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图10  长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF1699在中国春-长穗偃麦草附加系中的扩增 

M:MarkerDL2000;1-7:DA1E-DA7E;8:CS;9:Th.elongatum(2x)。

图11长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF31945在中国春-长穗偃麦草置换系中的稳定性 

M:MarkerDL2000;1:DS1E/1A;2:DS1E/1B;3:DS1E/1D;4:DS2E/2A;5:DS2E/2B;6:DS2E/2D;7:DS3E/3A;8:DS3E/3B;9:DS3E/3D;10:DS4E/4A;11:DS4E/4B;12:DS4E/4D;

13:DS5E/5B;14:DS5E/5D;15:DS6E/6A;16:DS6E/6D;17:DS7E/7A;18:DS7E/7B;19:DS7E/7D;20:CS;21: Th.elongatum(2x)。

图12 长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF31945在其它小麦及多倍体长穗偃麦草中的稳定性 

M:Marker DL2000;1:Y14;2:Y16;3:Y158;4:N13;5: Y18;6:An 8455;7:Su 3;8: Th.elongatum(4x);9: Th.ponticum (10x, PI179162);10: Th.ponticum (10x, PI204383); 11:CS;12: Th.elongatum(2x)。

图13长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF31945在Y16与DS7E/7A正交后代中的稳定性 

M:Marker DL2000;1:(Y16×DS7E/7A)F₁;2-19:(Y16×DS7E/7A) F₂; 20: Y16; 21:DS7E/7A。

图14长穗偃麦草7E染色体特异分子标记SLAF31945在Y16与DS7E/7A反交后代中的稳定性 

M:Marker DL2000;1:(DS7E/7A×Y16)F₁;2-19:(DS7E/7A×Y16)F₂; 20: Y16;21: DS7E/7A。

具体实施方式

实施例1  实验材料

普通小麦中国春（CS,2n=6x=42）、二倍体长穗偃麦草（Th. elongatum,EE,2n=2x=14）、中国春-长穗偃麦草附加系（CS- Th. elongatum addition lines）、中国春-长穗偃麦草置换系（CS- Th. elongatum substitutions lines）、四倍体长穗偃麦草（Th. elongatum,2n=4x=28）、十倍体长穗偃麦草（Th.ponticum, PI179162，PI204383，2n=10x=70），以上材料由加拿大农业部的Dr. Fedak惠赠，材料原始文献为《Disomic and ditelosomic additions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum》；扬麦14（Y14，即扬0-139，江苏里下河农科所用扬麦158和扬麦６号杂交育成）、扬麦16（Y16，即扬0-126是江苏里下河地区农科所用扬91F138和扬90-30杂交育成）、扬麦158（Y158，由江苏省里下河地区农科所利用扬麦4号/ST1472／506育成，品种登记号为GS02001－1997）、宁麦13（N13，即宁0078，国审麦2006004,由江苏省农科院粮食作物研究所从宁麦9号系谱选育）、扬麦18（Y18,系谱为 4×宁麦9号/3/ 6×扬麦158//88- 128/南农P045），上述材料由江苏省里下河农科所提供，均有市售；安农8455（An8455，安徽农科院育成）和苏麦3号（Su3，苏州地区农科所于1968年利用Funo和台湾小麦育成）为实验室保存品种；扬麦16与中国春-长穗偃麦草7E/7A置换系正交(Y16×DS7E/7A)与反交(DS7E/7A×Y16)F1、F2代由本实验室通过杂交获得。

实施例2  基因组DNA的提取

供试材料长至两叶一心期，以SDS法提取基因组DNA，步骤为：(1)取幼嫩叶片(约0.1g)，剪碎装入2ml的离心管中，置于液氮中冷却，用研磨棒碾碎至粉末状；

(2)离心管放置于室温稍冷却，加入700μl的缓冲液A（缓冲液A配方：29.2g NaCl、100ml 的1M Tris-HCl、18.6gEDTA-Na、15g SDS，ddH₂O定容至1L并灭菌），轻轻混匀，然后65℃水浴20min，期间每隔5min上下颠倒混匀一次；

(3)取出稍冷却至室温，加入苯酚和氯仿各350μl，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(4) 12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(5)加入约750μl氯仿，上下颠倒，充分混匀，抽提5min；

(6)12000rpm，离心10min，将上清液吸取到一个新的离心管中；

(7)加入约560μl异丙醇，轻慢混匀，室温放置10min，可见絮状沉淀；(8)12000rpm，离心10min，弃去上清液；

(9)加500μl 70%的乙醇溶液洗涤两次，每次2-3min. 室温晾干；

(10)晾干的DNA溶于20μl TER中，37℃温浴45min. -20℃保存备用。

实施例3  基于SLAF-seq技术获得长穗偃麦草7E染色体特异片段  

(1)简化方案设计：利用酶切预测软件对参考基因组系统分析，主要根据基因组的GC含量、重复序列情况和基因特点等信息，设计标记开发方案，确定酶切方案和切胶范围，测序量等以保证其分子标记开发的密度、均匀性从而确保达到预期的实验目的。

(2)基因组DNA酶切：通过酶切的方式选取目的片段，达到预期设计标签数指标要求。酶切体系为基因组DNA 500ng（中国春、长穗偃麦草、中国春-长穗偃麦草7E附加系基因组DNA）、NEB buffer4 1μl（New England Biolabs公司缓冲液4）、Mse1 0.12μl、ddH₂O（双蒸水）加至50μl体系，试剂配好后混匀，37℃15h，用QIAGEN试剂盒纯化。 

(3)5’末端修复：将酶切产生的不同类型的末端进行修复，同时对5’末端进行磷酸化修饰。反应体系为步骤（2）中纯化样本DNA 30μl、T4 DNA Ligase Buffer with 10 mM ATP（含10 mM ATP的T4 DNA连接缓冲液）10μl、10 mM dNTP Mix（10 mM dNTP混合液） 4μl、T4 DNA Polymerase （T4 DNA聚合酶）5μl、Klenow Enzyme（Klenow酶） 1μl、T4 PNK 5μl、ddH₂O（双蒸水） 45μl。试剂配好后混匀，20℃30 分钟，反应结束后用QIAGEN 试剂盒纯化，33μl EB回溶。溶液名称的中文 

(4)3’末端加A ：与solexa（Illumina公司生产的高通量测序仪）接头5’端的T互补提高连接效率，并阻止solexa接头进行自连。反应体系为步骤（3）中纯化样本DNA 32μl、Klenow Buffer 5μl、1 mM dATP 10μl、Klenow Exo- 3μl。

(5)连接solexa测序接头：便于统一模板进行 PCR 扩增，同时将连接产物锚定在玻璃表面（flow cell）上，进行桥式扩增。反应体系为步骤（4）中纯化样本DNA 10μl 、DNA Ligase Buffer 2X（2X的DNA连接酶缓冲液）25μl、Adapter（solexa测序接头） 10μl、DNA 连接酶5μl。 

(6)PCR扩增：增大起始模板量，达到上机建库量的要求。反应体系为步骤（5）中纯化样本DNA 8μl 、PCR primer PE 1.0 （PCR引物1） 1.5μl 、PCR primer PE 2.0（PCR引物2） 1.5μl、Phusion DNA Polymerase (Finnzymes Oy公司生产的DNA聚合酶) 20μl、ddH₂O（双蒸水） 9μl。反应程序为98℃预变性30s，98℃变性40s、65℃退火30s、72℃延伸30s、10-12个循环，72℃延伸5min。 

(7)切取目的片段：根据设计预期得到的SLAF标签数目确定切胶范围。切取大小合适的目的片段：制作2%低熔点琼脂糖胶，将步骤（6）中的PCR产物进行电泳，120V 60分钟，切取400-500bp的目的片段，QIAGEN胶回收试剂盒回收目的片段。 

(8)定量与测序：优化特异性长度片段cluster的密度，确保测序有效数据量达到预期要求,对所需要的cluster上机测序。 

(9)序列信息分析：利用 Illumina GAIIx 测序得到原始数据，利用软件SLAF_Poly.pl.（北京百迈克公司研发）对测序结果中 index 序列识别和低质量过滤，得到项目各样品有效原始数据。利用比对软件BLAT，将各样品有效数据分别进行相似度聚类，并通过深度识别和纠正测序错误，得到各样品有效特异序列标签。 

实施例4根据长穗偃麦草7E染色体特异序列设计引物

利用SLAF-seq技术共获得二倍体长穗偃麦草7E染色体特异序列518个。根据测序结果，任意选择了16个特异SLAF片段利用Primer Premier5.0软件各设计引物1对，以发展长穗偃麦草7E染色体特异分子标记。相应的引物序列见表1。

表1 根据长穗偃麦草7E染色体特异片段设计的16对引物

原始引物名称 SPECh_No.1分别表示special(S) 、primer(P)、Thinopyrum elongatum(E)、chromsome(Ch)、第1对引物。下同。

实施例5 长穗偃麦草7E染色体特异分子标记的发展

以7份中国春-长穗偃麦草附加系（DA1E-DA7E）及亲本中国春（CS）、长穗偃麦草（Th.elongatum,2x=14）为材料，以根据测序结果所获7E染色体特异序列设计16对引物进行PCR扩增，发展长穗偃麦草7E染色体特异分子标记，结果成功发展了10个长穗偃麦草特异分子标记（图1-10），分子标记开发效率达62.5%。相应的特异引物序列见表2，相应的分子标记的DNA序列见表3。

表2 10个长穗偃麦草7E染色体特异分子标记及其特异引物

特异标记名称SLAF31945分别表示Specific (S)、Length (L)、Amplified (A)、Fragment(F)、标记的序号。

表3 10个长穗偃麦草7E染色体特异分子标记的DNA序列

标记名称	DNA序列(5'-3')	长度(bp)
			SLAF31945	SEQ ID NO.33	339
SLAF27230	SEQ ID NO.34	387
			SLAF5720	SEQ ID NO.35	382
SLAF48385	SEQ ID NO.36	367
			SLAF72555	SEQ ID NO.37	358
SLAF14034	SEQ ID NO.38	403
			SLAF32494	SEQ ID NO.39	370
SLAF1998	SEQ ID NO.40	384
			SLAF47229	SEQ ID NO.41	372
SLAF1699	SEQ ID NO.42	383

实施例6 长穗偃麦草7E染色体特异分子标记的稳定性检测

获得的长穗偃麦草7E染色体特异分子标记是否稳定对其应用非常重要，通过利用相同引物对含有7E染色体的不同小麦背景和不同世代的材料进行PCR，如能扩增出相应的特异条带，就说明我们所发展的长穗偃麦草7E染色体特异分子标记是稳定的，可用于跟踪长穗偃麦草7E染色体。以中国春-长穗偃麦草置换系、其它小麦、多倍体长穗偃麦草及DS7E/7A与Y16的杂交F₁、F₂代为材料，验证了所发展的长穗偃麦草特异分子标记的稳定性。结果证明所发展的标记是稳定的。以7E染色体特异分子标记SLAF31945为例，其在7份中国春-长穗偃麦草附加系中只在DA7E中出现（图1），在19份中国春-长穗偃麦草置换系材料中仅在含有7E染色体的3份置换系DS7E/7A、DS7E/7B、DS7E/7D中稳定出现，而在不含7E染色体的DS1E/1A、DS1E/1B等16份材料及中国春中却不能出现（图11），在四倍体、十倍体长穗偃麦草及二倍体长穗偃麦草中稳定出现，而在Y14、Y16、Y158、N13、Y18、An8455及Su3等其它小麦中不能出现（图12），在Y16与DS7E/7A置换系的正交（图13）与反交（图14）的F₁中稳定出现，而在F₂代中不同单株表现有与无扩增的分离，其比例约为3：1，符合孟德尔遗传规律，因此，充分说明标记SLAF31945是稳定的。

Claims (3)

1.长穗偃麦草7E染色体特异分子标记，其对应的特异引物是下列10对引物之一：

①：特异标记SLAF31945，特异引物SPECh_No.2

L: 5’-AGCAAATAAAACGACAGT -3’

R: 5’- GGTTTTCACCAATTACAG-3’

②：特异标记SLAF27230，特异引物SPECh_No.3

L: 5’-AGTGAATCTGAGATGCATAT-3’

R: 5’- ATTTTGTTTTTACCATTTTT -3’

③：特异标记SLAF5720，特异引物SPECh_No.6

L: 5’- TTTTTCTGGTACTTACTAAC -3’

R: 5’- TGTTCTGTGAGATGAATGTT -3’

④：特异标记SLAF48385，特异引物SPECh_No.8

L: 5’- AGTCAAGGCAAATTATGGT -3’

R: 5’- ACTGTCTAATGTCTCGTAAT -3’

⑤：特异标记SLAF72555，特异引物SPECh_No.11

L: 5’- ACACAAAGGTGAGTGAAAAC -3’

R: 5’- GAGTAGCAAAAATCTCAACA -3’

⑥：特异标记SLAF14034，特异引物SPECh_No.12

L: 5’-CTACCCTTACCACCTCG -3’

R: 5’-CCACTGGATGCTGTTTAT -3’

⑦：特异标记SLAF32494，特异引物SPECh_No.13  

L: 5’-GGTAAGCTTGAAATACATGA-3’

R: 5’- TCCAAGTGATATTGTAGTCG-3’

⑧：特异标记SLAF1998，特异引物SPECh_No.14

L: 5’-CACTTGTGCATATTCGAGAG -3’

R: 5’-CCATTTTCCAATATATACAA -3’

⑨：特异标记SLAF47229，特异引物SPECh_No.15

L: 5’- GAAATGGCAAGTACCTAA-3’

R: 5’- CAAGTAGAAGTTCAGCAA-3’

⑩：特异标记SLAF1699，特异引物SPECh_No.16 

L: 5’- TACACAGAAGGAAAGCATTA-3’

R: 5’- CATCAGAAATTTTCTTTTGA -3’。

2.权利要求1所述长穗偃麦草7E染色体特异分子标记在跟踪长穗偃麦草的染色体或染色体片段中的应用。

3. 权利要求1所述长穗偃麦草7E染色体特异分子标记在长穗偃麦草抗赤霉病、抗锈病基因的连锁分析中的应用。

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