KR20110135834A - Issr 마커에 의한 매실 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머 - Google Patents

Issr 마커에 의한 매실 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택되는 특정 반복 염기서열을 갖는 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 프라이머 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출 방법 및 매실의 품종 판별 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 매실 품종 판별용 ISSR 마커는 매실의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 매실의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 통해 매실의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 매실의 품종을 판별할 수 있는 효과가 있다.

Description

마커에 의한 매실 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머{A method of classifying Maesil by Inter-Simple Sequence Repeat Analysis and Its Primers}
본 발명은 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 분석에 의한 매실 품종 판별 방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택되는 특정 염기서열을 갖는 ISSR 프라이머 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출 방법 및 매실의 품종 판별 방법에 관한 것이다.
우리나라에는 수령이 오래된 정매(庭梅)나 야생매 등 우수 매실자원이 있으나, 이들 고매(古梅)에 대한 과학적인 정보 관리가 미흡하여 귀중한 유전자원이 손실되고 있으며, 또한 외래종 매실이 다량 수입되고 있어 국가차원의 장기적인 토종 매실유전자원의 수집 및 관리가 절실히 요청되는 시점에 와 있다. 따라서 옛 선비들의 문화가 깃든 매실나무의 유전자원을 보존하고 증식함으로써 앞으로 우량 매실 품종을 육성하는데 활용할 뿐만 아니라 매실 및 매실 관련 전통문화를 바이오기술과 접목시켜 계승 및 발전시킴에 있어 이를 권리화하여 보호하는 것이 매우 중요하다 할 것이다.
최근 들어 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있다. 이를 위하여 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(genetic diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 변종의 감별은 그 변종의 양적수준과 더불어 다수의 특성을 파악하여 알 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 그 중에서 RFLP(제한효소 단편 장다형, Restriction Fragment Length Polymorphism)는 일련의 DNA 사슬을 제한효소로 처리했을 때 생기는 DNA 단편들이 개체간의 유전적 조성의 차이 즉, 염기 서열상의 차이에 따라서 그 수나 길이가 서로 다르게 나타난다는 사실에 기초한 것으로써 다양하게 이용되고 있다. 하지만 RFLP는 순도가 높은 DNA가 다량으로 필요하며 시간과 노력과 비용이 많이 소요될 뿐 아니라 시험과정이 복잡하고 방사성 동위원소를 이용해야 하는 단점이 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로 기술적으로 단순하고 다형상성(Polymorphism)의 추적이 용이한 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 방법이 개발되었다. 이를 이용한 기술로서, 대한민국 등록특허 제10-0264743호에 “marker RAPD를 이용한 벼의 유묘 내냉성에 관여하는 양적 형질 유전자 지도(QTL)와 저온저항성 벼품종 선발 방법”이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0215084호에 “RAPD 표식에 의한 고려인삼의 산지 판별방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머”가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0764561호에 “ＲＡＰＤ 표지인자를 이용한 양파의 웅성불임회복 유전자판별 방법”이 개시되어 있다. 또한, Shimada 등은 대만 및 일본 매실 품종 45 계통을 대상으로 품종을 구분할 수 있는 RAPD 분석 방법을 고안하였다(Shimada T, Haji T, Yamaguchi M, Takeda T, Nomura K, Yoshida M. 1994. Classification of mume (Prunus mume Sieb. et Zucc.) by RAPD assay. J Japan Soc Hort Sci 63(3): 543-551). 그러나 상기 실험 결과는 우리나라에서 자생하고 있는 매실 유전자원을 전혀 포함하고 있지 못하다.
한편 RAPD 방법의 단점을 개선하여 대한민국 등록특허 제10-0842430호에 “매실에서 유래된 SＳＲ 프라이머 및 이의 용도”가 개시되어 있는데, 이는 매실 유래 SSR (Simple Sequence Repeat, 초위성체) 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출(SSR 혹은 microsatellite polymorphism) 방법에 관한 것이다. 이 방법은 매우 재현성이 높아서, 콩, 밀, 보리, 옥수수, 감자 등과 같은 주요 작물에 적용되어 개발되었다. 그러나 이 방법은 개발 비용이 많이 들고 사전에 염기서열 정보를 필요로 하기에 활용이 제한적이라는 문제점이 있었다.
한편 1994년에 Zietkiewicz 등은 사전 염기서열 정보 없이도 SSR을 증폭시킬 수 있는 anchored primer를 개발하였으며, 이 프라이머를 이용하는 ISSR 방법을 고안하였다(Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176-183, 1994).
ISSR 마커는 2-3bp 크기의 반복 단위가 있는 DNA 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR 분석을 수행하여 DNA를 분석하는 방법으로, 이 기술은 프라이머의 높은 결합 온도와 긴 염기서열 때문에 RAPD 방법보다 재현성 및 신뢰성이 더 높으며 (Esselman E, Jiangquiang JL, Crawford DJ, WInduss JL, Wolfe AD. 1999. Clonal diversity in the rare Calamagrosis porteri ssp. insperata (Poaceae): comparative results for allozymes and random amplified polymorphic DNA (RAPD) and their simple sequence repeat (ISSR) markers. Molecular Ecology 8: 443-451), 각 프라이머 당 많은 다형상성(Polymorphism)을 형성한다. 또한 분석이 매우 신속하고, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 방법에 비해 간단하며, 전통적인 SSR 기술처럼 사전에 염기서열 정보가 필요하지 않으며 따라서 개발비용이 많이 들지 않는 커다란 장점을 갖는다 (Tsumura Y, Ohba K, Strauss SH. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptonmeria japonica). Theor. Appl. Genet. 92:40-45, 1996). 그러나 매실에 대한 ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) 마커는 아직 국내 토종 매실을 대상으로 개발된 적이 없으며, 외국에서도 이와 관련된 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.
본 발명에서는 국내 매실 수집 계통에 대한 계통학적 위치 및 정체성을 규명하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 상기 문제점들에 착안하여 기술적으로 단순하고 다형상성(Polymorphism)의 추적이 용이하며, 매실의 신품종 육종에 필요한 기초자료를 제공할 뿐만 아니라 유전적 식별을 통한 품질규격과 유통질서 확립을 위한 체계적인 관리에 활용될 수 있는 ISSR 마커를 개발하고 본 발명에 이르게 되었다. 특히 개발된 ISSR 마커는 국내 수집종과 외국에서 도입되어 국내에서 재배되고 있는 외래 도입종 간의 유연관계를 분석하는데 크게 활용될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 매실 품종 판별용 ISSR 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 매실 품종 판별용 ISSR 마커를 활용하여 토종 매실 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 매실 품종 판별에 적합한 ISSR 분석 조건을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 매실로부터 유전자 DNA를 분리하고, 이를 이용하여 ISSR PCR을 수행하여 매실 품종간 특이적인 길이의 ISSR PCR 산물을 획득함으로써 달성되었다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 112로 이루어진 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머를 제공한다.
본 발명에서는 매실, 살구, 자두의 잎을 액체 질소를 이용하여 마쇄한 다음 Nucleospin plant II kit (Macherey-Nagel)을 사용하여 DNA를 추출한다. 추출한 DNA를 agarose gel (0.8%)에서 전기영동한 후 밴드를 확인하고, Nanodrop Spectrophotometer를 이용하여 농도를 측정한다. 이어서 상기 매실의 유전자 DNA를 주형으로 해서 표 3에 기재된 112개의 올리고프라이머를 이용하여 ISSR PCR을 수행한다.
상기 매실 유전자의 ISSR PCR을 통해 112개의 ISSR 프라이머를 선발한다. 본 발명에 따른 매실 품종 판별용 ISSR 마커는 ISSR PCR 프라이머를 의미하며, 특정 microsatellite의 염기서열을 포함하는 단일 프라이머들이다.
본 발명에서 제공되는 ISSR 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 112로 이루어진 군에서 선택되는 특정 염기서열을 가진다.
본 발명에서는 상기 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 매실의 DNA 다형성 검출 방법은 매실로부터 유전자 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 유전자 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 ISSR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 매실 유전자 DNA의 추출은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Acid Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 매실 유전자 DNA를 주형으로 한 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다.
PCR 반응을 위한 프라이머는 본 발명에 따른 특정 염기서열을 갖도록 제작되거나 또는 상업적으로 판매되는 프라이머 키트를 사용할 수 있으며, PCR 반응 혼합액은 상기 매실 유전자 DNA와 본 발명에 따른 ISSR 프라이머가 함유되고, 10mM Tris-Cl(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM dNTP, 1.0 U polymerase 등의 성분을 가지는 혼합액, 혹은 당업계에 공지된 여러 혼합액을 사용할 수 있다.
DNA 증폭 반응은 자동화된 중합연쇄반응기를 이용하며, 94℃에서의 초기 변성 반응 4분에 이어서, 94℃에서 30초간 DNA를 변성시키는 단계; 60℃에서 45초간 프라이머를 부착시키는 단계; 및 72℃(사용 프라이머에 따라 결정)에서 2분간 DNA 중합 반응 단계를 20 내지 40회 반복하고 최종적으로 72℃에서 7분간 반응시키는 것을 기본으로 하는, 당 업계에 공지된 여러 반응 조건을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리하는 단계는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 겔을 에티디움브로미드(ethidium bromide)나, 실버 염색(silver staining)한 후 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한 본 발명은 상기 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 매실의 품종 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 매실의 품종 판별 방법은 매실 및 대조군 매실 품종으로부터 유전자 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 각 유전자 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따른 ISSR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 상기 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및 상기 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서, 유전자 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 상기에서 기재한 바와 같으며, 상기 매실 및 대조군 매실 품종에 대한 비교는 동일한 ISSR 프라이머에 대한 시료가 되는 매실과 대조군 매실 품종의 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다.
각 ISSR 프라이머에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 매실과 대조군 매실 품종의 결과가 모두 일치하면 시료가 되는 매실은 대조군 매실 품종과 동일한 품종으로 동정할 수 있다. 이와 같은 품종의 판별 방법은 신규 유전자원 도입 시 중복여부 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 판별이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 매실 품종에 대한 유전자 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 매실과 동시에 수행되는 것이 바람직하나, 시료가 되는 매실 보다 이전에 수행되어 판별의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 매실에 대한 유전자 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 ISSR 프라이머를 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출용 키트를 제공한다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 ISSR 프라이머를 포함하는 매실의 품종 판별용 키트를 제공한다. 품종 판별 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 판별 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 적용될 수 있는 매실은 Prunus mume Siebold & Zucc 및 이들의 변종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 Prunus mume Siebold & Zucc일 수 있다.
본 발명에 따른 매실 품종 판별용 ISSR 마커는 매실의 DNA 다형성을 효과적으로 검출하여 매실의 DNA 프로파일을 작성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 통해 매실의 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 신규 유전자원 도입 시 기존 보유자원과의 중복성 분석 및 신규성 확립을 효과적으로 수행할 수 있으며, 매실의 품종을 판별할 수 있는 효과가 있다.
또한, 국내에 산재해 있는 지방종(계통)간의 구분을 명확히 할 수 있을 뿐만 아니라 이름없는 품종들의 신품종 등록이 가능하여 우리의 소중한 유전자원을 보호할 수 있으며, 국내산과 수입산의 식별이 가능해져 국내 매실 시장의 유통질서를 확립하는데 기여할 수 있다. 그 밖에도, 매실 유전자 분석을 통해 다양한 유전자 풀 (gene pool)을 확보함으로써 매실 및 매화 육종 소재로 활용하여 신품종 육종이 가능하며, 묘목의 조기 검정으로 매실이 열리기 전까지 2-3년을 기다리지 않아도 품종을 확인할 수 있어 재배 농가의 매실나무 관리와 비용을 절감할 수 있다. 앞으로 지속적인 매실 유전자원의 확보와 유지 관리뿐만 아니라 국내 재래 품종의 형태적 특징과 유전적 특성의 유연관계를 규명함으로써 매실 유전자원의 메카로서의 면모를 갖추고 이를 기반으로 우량 품종을 육성하는데 있어서 본 ISSR 마커는 크게 기여할 것이다.
도 1a와 도 1b는 ISSR 마커를 이용하여 획득한 다형성 PCR 산물이다.
도 2는 ISSR 프라이머에 의해 획득한 다형성 PCR 단편으로부터의 데이터에근거하여 작성한 P. mume , P. armeniaca , P. salicina 품종의 덴드로그램(dendrogram)이다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 발명에서는 하기 표 1 및 표 2 내지 4에 기재된 바와 같은 우리나라에서 수집된 73 개의 매실나무 표본과 각각 2개씩의 살구나무 및 자두나무 표본으로부터 유전자 DNA(genomic DNA)를 분리하여 사용하였다.
작물명 표본수 코드
매실나무 73 pm
살구나무 2 pa
자두나무 2 ps
No. 종 품종 또는 서식지 Origin 약자
1 Prunus mume 정매 율곡매 Korea pm-23
2 Prunus mume 금둔옥매 Korea pm-36
3 Prunus mume 도산매1 Korea pm-45
4 Prunus mume 부여동매실(우1) Korea pm-46
5 Prunus mume 명재고택매 Korea pm-47
6 Prunus mume 무우전백매 선암매 Korea pm-48
7 Prunus mume 무우전홍매3 Korea pm-49
8 Prunus mume 백록매 Korea pm-50
9 Prunus mume 병산서원정원매(서원앞 위쪽) Korea pm-53
10 Prunus mume 병산홍매 Korea pm-54
11 Prunus mume 부여동매 Korea pm-55
12 Prunus mume 부여동매 3대(우2) Korea pm-56
13 Prunus mume 부여홍매 Korea pm-57
14 Prunus mume 상천백야매 Korea pm-58
15 Prunus mume 상천홍야매 Korea pm-59
16 Prunus mume 상천홍야매 1지 Korea pm-60
17 Prunus mume 상천홍야매 2지 Korea pm-61
18 Prunus mume 상천홍야매 뒤 Korea pm-62
19 Prunus mume 서애매 Korea pm-63
20 Prunus mume 선암백매1 Korea pm-64
21 Prunus mume 선암백매2 Korea pm-65
22 Prunus mume 선암백매3 Korea pm-66
23 Prunus mume 선암백매4 Korea pm-67
24 Prunus mume 선암백매6 Korea pm-68
25 Prunus mume 선암홍매(해우소아래좌) Korea pm-69
26 Prunus mume 선암홍매5 Korea pm-70
27 Prunus mume 선암홍매6(운수암마지막 우측) Korea pm-71
28 Prunus mume 선암홍매7 Korea pm-72
29 Prunus mume 선암홍매8 Korea pm-73
30 Prunus mume 송광매 Korea pm-74
31 Prunus mume 송광야매 Korea pm-75
32 Prunus mume 선종매(수덕사) Korea pm-76
33 Prunus mume 충의매(충의사) Korea pm-77
34 Prunus mume 오산매 Korea pm-78
35 Prunus mume 외산매 Korea pm-79
36 Prunus mume 용흥백매 Korea pm-80
37 Prunus mume 용흥홍매 Korea pm-81
38 Prunus mume 운보매 Korea pm-82
39 Prunus mume 주암매 Korea pm-83
40 Prunus mume 의사매(충의사 위쪽) Korea pm-84
41 Prunus mume 학봉풍뇌헌백매(우) Korea pm-85
42 Prunus mume 학봉홍매(풍뇌헌 좌) Korea pm-86
43 Prunus mume 하회매 Korea pm-87
44 Prunus mume 학봉백매 Korea pm-88
45 Prunus mume 대병매(합천송씨고가) Korea pm-89
46 Prunus mume 회연백매 Korea pm-90
47 Prunus mume 회연홍매 Korea pm-91
48 Prunus mume 경기전백매 Korea pm-92
49 Prunus mume 경기전매3 Korea pm-94
50 Prunus mume 지운매 Korea pm-95
51 Prunus mume 개암홍매 Korea pm-96
52 Prunus mume 내소사매 Korea pm-98
53 Prunus mume 대명매 Korea pm-99
54 Prunus mume 쌍봉야매 Korea pm-100
55 Prunus mume 쌍봉매 Korea pm-101
56 Prunus mume 충민사매 Korea pm-102
57 Prunus mume 임대정매 Korea pm-103
58 Prunus mume 전남대백매 Korea pm-104
59 Prunus mume 죽수야매 Korea pm-105
60 Prunus mume 의심매 Korea pm-107
61 Prunus mume 주참봉매 Korea pm-108
62 Prunus mume 금천매 Korea pm-109
63 Prunus mume 오강매 Korea pm-110
64 Prunus mume 홍씨홍매 Korea pm-111
65 Prunus mume 죽림매 Korea pm-112
66 Prunus mume 세일매 Korea pm-113
67 Prunus mume 독수정매 Korea pm-114
68 Prunus mume 계당홍매 Korea pm-115
69 Prunus mume 서은매 전씨홍매 Korea pm-116
70 Prunus mume 명옥헌매 Korea pm-117
71 Prunus mume 환벽당홍매(환벽당 앞) Korea pm-118
72 Prunus mume 지실와룡매 Korea pm-119
73 Prunus mume 유종헌가매 Korea pm-120
74 Prunus mume 환벽당백매 Korea pm-121
75 Prunus mume 신씨매 Korea pm-122
76 Prunus mume 장산백매 Korea pm-123
77 Prunus mume 전씨매 Korea pm-124
78 Prunus mume 미암백매 Korea pm-125
79 Prunus mume 계당겹백매 Korea pm-126
80 Prunus mume 계당홑백매 Korea pm-127
81 Prunus mume 청풍매 Korea pm-128
82 Prunus mume 천불매 구충암매 Korea pm-129
83 Prunus mume 남사백매 Korea pm-130
84 Prunus mume 정당매 Korea pm-131
85 Prunus mume 단속탑2 Korea pm-133
86 Prunus mume 곡전매 Korea pm-134
87 Prunus mume 퇴옹매 Korea pm-135
88 Prunus mume 산동매 Korea pm-136
89 Prunus mume 퇴옹매 1 Korea pm-137
90 Prunus mume 대원사백매 Korea pm-138
91 Prunus armeniaca 석어당살구 Korea pa-1
92 Prunus armeniaca 희우루살구 Korea pa-2
93 Prunus salicina 자엽자두 Korea ps-1
94 Prunus salicina 후뮤샤자두 Korea ps-2
실시예 1 : DNA 추출
매실의 잎을 액체 질소를 이용하여 마쇄한 다음 Nucleospin plant II kit (Macherey-Nagel)을 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 agarose gel (0.8%)에서 전기영동한 후 밴드를 확인하고, Nanodrop Spectrophotometer를 이용하여 농도를 측정하였다.
실시예 2 : ISSR PCR 분석
토종 매실의 ISSR 분석에 적합한 마커를 선발하는 것이 본 발명의 중요한 요소 중 하나이다. 즉 같은 품종의 매실을 대상으로 PCR을 수행하여도 ISSR 밴드 양상은 마커의 종류에 따라 다양하게 나타나는데, 밴드 수나 선명도 등을 고려하여 가장 적합한 마커를 선발하기 위해, 당업계에서 통상적인 방법으로 제조된 112개의 ISSR primer(하기 표 5 참조)로 예비실험을 수행하였다. 예비 실험 결과 112개 primer 모두 밴드가 명확하고 다형성이 우수하여 이들을 모두 선택하여 분석에 사용하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 매실의 DNA를 주형으로 해서 112개의 올리고프라이머(표 5)를 이용하여 ISSR PCR을 수행하였다(문헌[Martins M, Sarmento D, Oliveira MM. Genetic stability of micropropagated almond plantlets, as assessed by RAPD and ISSR markers. Plant Cell Rep 23: 492-496, 2004] 참조).
ISSR 프라이머의 서열
Primer Sequencea
IS01 GTG(5)
IS02 CA(8)
IS03 GACA(4)
IS04 CT(8)
IS05 GT(8)
IS06 GTGC(4)
IS07 GAC(5)
IS08 TG(10)
IS09 GGAT(4)
IS10~IS11 CA(8)RG
IS12~IS13 AGC(6)TY
IS14~IS15 AT(8)RG
IS16~IS17 RG AT(8)
IS18~IS19 YTA GC(6)
IS20~IS46 DHB CGA(5)
IS47~IS73 BDB ACA(5)
IS74~IS100 DDB CCA(5)
IS101~IS112 YHY GT(5)G
R = A, G residues; Y = C, T residues; B = C, G, T residues; D = A, G, T residues; H = A, C, T residues
PCR 반응액의 조성은 최종 부피 20 ㎕로 매실 주형 DNA 20 ng/㎕, Taq polymerase 1.0 unit, 10 x PCR reaction buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl: 1.5 mM MgCl2), 0.2 mM dNTP, 10 pmol primer를 혼합하여 사용하였다. PCR 반응은 G-STORM (Gene Technologies)을 사용하여 94℃에서 4분간 초기 변성시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 50~60℃(사용하는 프라이머에 따라 결정)에서 45초간 annealing, 72℃에서 2분간 extension으로 설정된 증폭주기를 총 36회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 7분간 더 반응시킨 후 종료하였다. PCR 완료 후 증폭산물 10 ㎕와 분자량 마커(1 kp DNA ladder, Bioneer Co., Lambda DNA/EcoRI+HindIII marker, MBI Co.)를 agarose gel (1.5%)에 loading하여 전기영동 (80V로, 3시간)한 후 Ethidium Bromide로 염색한 다음, Alpha Imager 2200 (Alpha Innotech, USA)을 사용하여 주요 밴드를 확인하였다.
상기 ISSR PCR 결과, 예비 실험한 112개의 올리고프라이머 모두(상기 표 5)가 결과를 도출할 수 있는 DNA 절편을 증폭해 내었으며, 각 프라이머에 의해 증폭된 DNA 절편의 크기는 100~2500 bp에 해당하였다(도 1a, 도 1b 참조). ISSR 분석을 통하여 재현성이 높고 다형성을 보이는 밴드를 marker로 선발하여 밴드의 유무(dominant marker scoring : present=1, absent=0)에 따라 BioEdit(ver. 7.0 program)에 입력하고 이를 이용하여 Manhattan distance를 계산하였다. 그리고 UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) tree (MEGA 5 ver 0.3 program) 제작을 통해 각 집단 간 유집분석을 실행하였다.
전형질도 결과를 토대로 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
매실 수집계통 간의 DNA 밴드 양상
총 112개의 primer를 이용한 국내 수집종 77계통에 대한 ISSR 분석결과는 다음과 같다.
매실 수집 계통간 ISSR primer를 이용한 실험결과, 77종에 대해서 총 111개의 증폭산물을 얻었는데, 이중 다형성 증폭산물은 98개로 전체의 88.2%에 해당하였으며, 각 primer 별 총 밴드 수는 최소 4개 (IS2)에서 최대 14개(IS10, IS11, IS74 ~ IS100)로 한 primer 당 평균 밴드 수는 6.1개였다. 다형성 밴드 수는 최소 4개(IS2)에서 최대 12개(IS3)로 평균 5.4개의 다형성 밴드가 검출되었다. IS3 마커는 총 밴드의 수가 12개이며 다형성 밴드 수 또한 12개가 검출되었다.
품종간 유연관계 분석
ISSR marker를 이용하여 UPGMA 분석을 실시하여 매실의 유전적 유연관계를 조사하였다. 전체 계통간 유전적 거리는 0.025~0.3의 범위에 속하였으며, 유전적 거리가 0.3에서 크게 2개의 그룹으로 구분되었다(도 2 참조). 제 1그룹은 매실, 제 2그룹은 살구와 자두가 포함되어 뚜렷하게 구분되었다.
그룹1에서 4개의 큰 그룹을 관찰할 수 있다. 유전적 거리 0.15에서 매실 Ⅰa(27품종), Ⅰb(8품종), Ⅰc(16품종), 그리고 Ⅰd(18품종)로 구분되었다.
그룹2-a에서는 정매(pm-23)가 살구 그룹과 유전적 거리가 0.20로 분석되었다. 이는 정매가 다른 매실 품종보다 살구 유전자가 많이 혼합된 것으로 분석된다.
특이하게 그룹2-b에서는 전씨백매(pm-124), 청풍매(pm-128), 단속탑2(pm-133) 등이 살구와의 유전적 거리가 0.1 이하로 매우 가깝게 유집됨 확인할 수 있었다.
또한 금둔옥매(pm-36)는 서애매(pm-63), 선암백매(pm-64)와 유전적 거리가 0.12로 분석되었다.
<110> Institute of Native Genetic Resouces Incorporated <120> A method of classifying Maesil by Inter-Simple Sequence Repeat Analysis and Its Primers <130> 0000 <150> KR 10/55213 <151> 2010-06-11 <160> 112 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 1 gtggtggtgg tggtg 15 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 2 cacacacaca cacaca 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 3 gacagacaga cagaca 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 4 ctctctctct ctctct 16 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 5 gtgtgtgtgt gtgtgt 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 6 gtgcgtgcgt gcgtgc 16 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 98 ttcccaccac caccacca 18 <210> 99 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 99 ttgccaccac caccacca 18 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 100 tttccaccac caccacca 18 <210> 101 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 101 cacgtgtgtg tgtg 14 <210> 102 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 102 catgtgtgtg tgtg 14 <210> 103 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 103 cccgtgtgtg tgtg 14 <210> 104 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 104 cctgtgtgtg tgtg 14 <210> 105 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial ISSR primer <400> 105 ctcgtgtgtg tgtg 14 <210> 106 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims (6)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 112로 구성된 군으로부터 선택된 특정 염기서열을 갖는 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 매실이 Prunus mume Siebold& Zucc 종인 것을 특징으로 하는 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머.
  3. 매실로부터 유전자 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출된 유전자 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 ISSR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    상기 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계
    를 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출 방법.
  4. 매실 및 대조군 매실 품종으로부터 유전자 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출된 각 유전자 DNA를 주형으로 하고 제1항에 따른 ISSR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    상기 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    상기 각각의 크기별 분리 결과를 서로 비교하는 단계
    를 포함하는 매실의 품종 판별 방법.
  5. 제1항에 따른 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머를 포함하는 매실의 DNA 다형성 검출용 키트.
  6. 제1항에 따른 매실 품종 판별용 ISSR 프라이머를 포함하는 매실의 품종 판별용 키트.
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