KR101877532B1 - 하례조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents
하례조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 하례조생 품종 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함하는 감귤 품종 선별용 조성물, 키트, 및 상기 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 감귤 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.
상기 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머를 포함하는 본 발명의 감귤 품종 선별용 조성물은 단시간 내 저비용으로 간편하게 하례조생 품종을 선별할 수 있으므로, 하례조생 품종의 보급에 신뢰도를 높일 수 있으며, 보급된 품종의 특성 모니터링에 편리하게 사용될 수 있다.
상기 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머를 포함하는 본 발명의 감귤 품종 선별용 조성물은 단시간 내 저비용으로 간편하게 하례조생 품종을 선별할 수 있으므로, 하례조생 품종의 보급에 신뢰도를 높일 수 있으며, 보급된 품종의 특성 모니터링에 편리하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 하례조생 품종 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함하는 감귤 품종 선별용 조성물, 키트, 및 상기 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 감귤 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.
감귤은 경제적이면서 영양학적 가치가 높기 때문에 전세계적으로 중요한 작물 중 하나에 속하며, 제주도 전체 면적의 82% 이상을 차지하고 있을 만큼 제주도 산업에 중요한 역할을 하고 있다(Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs korea, 2015). 그러나, 현재 제주도 내 재배되고 있는 대다수의 감귤류들은 일본으로부터 도입된 품종으로서, 막대한 로열티를 지불해야 하는 문제가 발생하여, 신품종 감귤 육성에 대한 관심도가 높아지고 있는 추세이다.
이와 관련하여, 하례조생(Citrus unshiu)은 최근 입간 조생에 하귤 화분을 교배하여 얻어진 주심배 실생묘로서, 신품종으로 개발되어 현재 농가에 보급되고 있다. 일반적으로, 대부분의 온주밀감 품종들은 모계의 유전형질을 동일하게 갖고 있는 주심배와 가지변이 등에 의하여 육성되었기 때문에 이들을 형태학적으로 구별하는 것은 용이하지 않은 실정이다. 또한, 자국의 신품종 보호를 위하여 설립된 국제 신품종보호동맹(UPOV)의 가입과 국립종자원(KOREA SEED & VARIETY SERVICE)에서 육종가들의 지적 재산권을 보호하기 위한 제도적인 장치의 도입으로 인하여, 국내외 재배되고 있는 온주밀감 품종들 중에서 하례조생 품종만을 선별할 수 있는 기술이 필요하게 되었다.
한편, 분자생물학의 발전에 따라, 외관이 유사한 품종들을 유전학적인 방법으로 구별하는 다양한 방법이 제시되고 있다. 예로, RAPD, RFLP(restriction fragment length polymorphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences), EST-SSR, 게놈 SSR 분자 표지 마커 등이 사용되고 있으며, SSR 마커를 사용하여 귤의 품종을 동정하는 방법이 개발된 바 있다(한국 등록특허공보 제10-0842432호). 그러나, 상술한 방법들은 분석과정 등이 복잡하여 많은 시간이 소요되며, 재현성이 낮다는 단점을 갖고 있었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 감귤 품종 중에서도 특히 하례조생을 간편하게 선별하기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력연구한 결과, 하례조생 특이적 SNP 마커를 검출하는 프라이머를 제작하였고, 이들을 혼합하여 사용하는 경우에도 서로 다른 SNP 마커가 각각 검출됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함하는, 감귤 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 감귤 품종 선별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 감귤로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 감귤 품종 선별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (b) 얻어진 증폭 산물로부터 감귤의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 감귤 품종을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태로서 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함하는, 감귤 품종 선별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는, 하례조생 특이적 SNP 마커를 검출하는 프라이머를 개발하였고, 이들을 혼합하여 사용하는 경우에도 서로 다른 SNP 마커가 각각 검출되므로, 상기 프라이머 쌍 또는 이들의 조합을 이용하면 감귤 품종 중에서도 하례조생을 단시간에 간편하게 선별할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어, "감귤 품종 선별용 조성물"은 여러 감귤 중에서 특정 감귤의 품종을 구별, 선별, 판별 또는 식별하는 조성물을 의미한다. 감귤 품종으로는 온주밀감에 속하는 하례조생, 노지궁천, 궁천조생, 전구조생, 히로시마7호, 유라실생, 일남1호, 유라조생, 조생 현행신, 저지리 조생 또는 히고 모수 등이 있다. 본 발명에서는 상기 감귤 품종 중에서도 신품종으로 개발되어 농가에 보급되고 있는 하례조생만을 특이적으로 선별하기 위한 방법을 개발하고자 한바, 본 발명의 목적상 상기 조성물은 감귤 품종 중 하례조생을 선별할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다. 또한, 프라이머는 변형될 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머는 하례조생 특이적 SNP 마커를 검출할 수 있고, 또한 쌍을 이루어 상기 SNP 마커를 검출할 수 있다.
이때, 상기 용어, "SNP"는 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. 본 발명의 SNP 마커는 표현형이 유사한 감귤 품종을 유전형을 통해 선별하는 마커로서 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 조성물은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, "실질적인 동일성"은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 14로 표시되는 서열과 높은 상동성을 갖는 서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 하례조생 품종을 선별하기 위하여 이의 특이적인 SNP 마커를 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였고(표 1), 상기 프라이머 중에서도 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍(P1), 및 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍(P5)이 상기 SNP 마커를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2 및 3). 또한, 상기 프라이머 쌍들을 혼합하여 사용하여도 서로 다른 SNP 마커가 각각 검출됨을 확인하였다(도 5 및 6).
이는, 상기 프라이머 쌍 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 하례조생 특이적 SNP 마커를 높은 특이도로 검출할 수 있으므로, 하례조생 품종의 선별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것으로서, 동일한 프라이머 디자인을 통해 만들어진 프라이머 쌍 중에서도, 상기 P1 및 P5의 프라이머 쌍이 특히 하례조생 SNP에 대하여 특이도가 높음을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 상기 조성물을 포함하는 감귤 품종 선별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 하례조생 특이적 SNP 마커를 검출함으로써 감귤 품종, 특히 하례조생을 선별할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 예로, 본 발명에서 제공하는 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 본 발명의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 예로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 DNA 칩 키트일 수 있다.
이때, 상기 용어 "DNA 칩"은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
또 다른 하나의 양태로서, (a) 감귤로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 감귤 품종 선별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (b) 얻어진 증폭 산물로부터 감귤의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 감귤 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 단계 (a)는 감귤, 구체적으로 하례조생 특이적 SNP 마커를 증폭하는 단계이다. 상기 SNP 마커는 본 발명의 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 또는 이들의 조합에 의해 증폭될 수 있다.
상기 증폭은 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로 수행될 수 있으며, 구체적인 예로 PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭, 자가유지 서열 복제 또는 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 방법 등이 사용될 수 있다.
이때, 상기 게놈 DNA는 감귤의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계 (b)는 얻어진 증폭 산물을 비교 분석하는 단계로서, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter) 등의 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
마지막으로, 상기 방법은, (c) 증폭 산물이 검출되는 경우에 감귤 품종을 하례조생인 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 감귤 나무의 잎으로부터 추출한 게놈 DNA에 대하여, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 혼합하여 PCR을 수행하였고, PCR 증폭 산물을 겔 전기영동을 통해 분석하였다(실시예 3). 그 결과, 하례조생 품종에서만 증폭 산물이 밴드로서 검출됨을 확인하였다(표 3 및 도 5).
이는, 상기 프라이머 쌍 또는 이들의 조합을 이용하면 하례조생 특이적 SNP 마커를 높은 특이도로 검출할 수 있으므로, 본 발명의 방법은 하례조생 품종의 선별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
하례조생 품종 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머를 포함하는 본 발명의 감귤 품종 선별용 조성물은 단시간 내 저비용으로 간편하게 하례조생 품종을 선별할 수 있으므로, 하례조생 품종의 보급에 신뢰도를 높일 수 있으며, 보급된 품종의 특성 모니터링에 편리하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 이용된 하례조생, 및 일반적인 온주밀감 품종인 궁천조생의 형태를 보여주는 이미지이다.
도 2는 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P1 또는 P5)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 3은 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P7)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 4는 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P2, P3, P4 및 P6)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 5는 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P1 및 P5)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 6은 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P1 및 P5)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=노지궁천 하엽, 3=하례조생-묘목, 4=궁천-묘목, 5=전구조생-모수, 6=히로시마 7호-모수, 7=유라실생-모수, 8=하례조생 묘목-1, 9=일남 1호-묘목, 10=유라조생-묘목, 11=불명확한 조생품종 2-1, 12=불명확한 조생품종 2-2, 13=대정농가 하례조생, 14=불명확한 저지리 조생, 15=저지리 하례조생, 16=예 농협 하례조생, 17=히고-모수를 의미한다.
도 2는 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P1 또는 P5)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 3은 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P7)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 4는 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P2, P3, P4 및 P6)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 5는 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P1 및 P5)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=궁천조생, 3=흥진조생, 4=유라조생, 5=궁본조생, 6=상야조생, 7=미택온주, 8=일남 1호를 의미한다.
도 6은 본 발명에 따른 하례조생 특이적 SNP 마커 검출용 프라이머(P1 및 P5)를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주는 이미지이다. 1=하례조생 원목, 2=노지궁천 하엽, 3=하례조생-묘목, 4=궁천-묘목, 5=전구조생-모수, 6=히로시마 7호-모수, 7=유라실생-모수, 8=하례조생 묘목-1, 9=일남 1호-묘목, 10=유라조생-묘목, 11=불명확한 조생품종 2-1, 12=불명확한 조생품종 2-2, 13=대정농가 하례조생, 14=불명확한 저지리 조생, 15=저지리 하례조생, 16=예 농협 하례조생, 17=히고-모수를 의미한다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예
1.
하례조생
품종 특이적 SNP
마커
검출용
프라이머
선발
하례조생 품종을 선별하기 위하여, 이의 특이적 SNP 마커를 이용하고자 하였다.
구체적으로, 상기 SNP 마커를 검출하기 위하여 하기 표 1에 기재한 바와 같은 프라이머를 제작하였고, 하기 표 1에 기재한 7개의 프라이머 모두 SNP를 검출할 수 있도록 디자인하였다. 상기 프라이머에는 하례조생 특이적 SNP와 결합할 수 있는 염기 서열을 포함하도록 하였으며, 이때 프라이머 명에 기재된 숫자는 SNP의 위치를 나타낸다. 또한 주형 서열과 염기 서열이 다른 1개의 염기를 인위적으로 SNP 위치의 2 염기 옆 위치에 도입하여 제작하였다. 이 경우, 상기 프라이머는 하례조생의 유전자와는 상기 1개의 염기에 대해서만 결합이 이루어지 않게 되나, 하례조생을 제외한 감귤 품종들의 유전자와는 상기 도입된 1개의 염기에 더하여 하례조생 특이적 SNP와도 결합이 이루어지지 않게 된다. 이처럼 프라이머와 주형 서열의 결합의 불안정성을 높임으로써, 하례조생 특이적 SNP에 대한 검출의 유의성 및 특이도를 향상시켰다.
| No. | 프라이머 이름 | 프라이머 서열 (5'->3') |
구분 | PCR 생성물의 크기(bp) |
| P1 |
HL-SNP-SCAF_2-23997586-F | CAAAAGAGCTCAAATAAGGC | 서열번호 1 | 165 |
| HL-SNP-SCAF_2-23997586-R | TCCCTTTCTTGGCATGATCT | 서열번호 2 | ||
| P2 | HL-SNP-SCAF_2-36059523-F | TCTAGGCTGAGATGCAGCGC | 서열번호 3 | 150 |
| HL-SNP-SCAF_2-36059523-R | CAGAAAATTCAACTGACGGTGA | 서열번호 4 | ||
| P3 | HL-SNP-SCAF_2-176744-F | TGGCACTATTGCACCTGCTA | 서열번호 5 | 283 |
| HL-SNP-SCAF_2-176744-R | CAAAGAAACCAGGGACGAAG | 서열번호 6 | ||
| P4 | HL-SNP-SCAF_9-24101032-F | CCATGTTATGAGTTCTGCAGTT | 서열번호 7 | 246 |
| HL-SNP-SCAF_9-24101032-R | AAATTGGGGTTCGAGACCTT | 서열번호 8 | ||
| P5 | HL-SNP-SCAF_9-30793978-F | ATTGAAATGCTGCCAAAGGT | 서열번호 9 | 526 |
| HL-SNP-SCAF_9-30793978-R | CTCCATACAAGAGAGTGCCG | 서열번호 10 | ||
| P6 | HL-SNP-SCAF_5-18939485-F | TGGATGGAAAGCTTATCGTT | 서열번호 11 | 340 |
| HL-SNP-SCAF_5-18939485-R | AACTTAACGGCAAGGGAGGT | 서열번호 12 | ||
| P7 | HL-SNP-SCAF_5-41248465-F | CACAGTGACGGTAATTGGTTAA | 서열번호 13 | 388 |
| HL-SNP-SCAF_5-41248465-R | CTGCCTTCGTTCTTATTTACCT | 서열번호 14 |
이후, PCR 반응액으로서 AccuPower® Multiplex PCR PreMix (Bioneer, Korea)[250 μM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1.0 unit Taq DNA polymerase, 10mM Tris-HCl(pH9.0), 40mM KCl]에 각 프라이머 0.5μM 및 게놈(genomic) DNA 15ng를 첨가하여 최종 부피를 20 ㎕로 조정하였다. PCR 조건으로서 95℃에서 5분간 초기변성시키고, 95℃에서 1분(denaturing); 58℃에서 30초(annealing); 및 72℃에서 30초(extension) 과정을 30회 반복수행한 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 처리하였다. PCR 생성물은 1.2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 100V로 35분 동안 전기영동 하여 나타나는 밴드로 확인하였다. 이때, 한 번의 PCR에는 한 쌍의 프라이머만을 사용하였고, PCR 반응에 사용한 감귤 품종의 종류는 하기 표 2에 기재하였다.
| 품종명 | |
| 1 | 하례조생 원목 |
| 2 | 궁천조생 |
| 3 | 흥진조생 |
| 4 | 유라조생 |
| 5 | 궁본조생 |
| 6 | 상야조생 |
| 7 | 미택온주 |
| 8 | 일남 1호 |
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, P1의 프라이머 쌍을 이용하는 경우에는 하례조생 품종에서 약 160bp의 PCR 증폭산물이 검출되며, P5의 프라이머 쌍을 이용하는 경우에는 하례조생 품종에서 약 520bp의 PCR 증폭 산물이 검출됨을 확인하였다.
반면에, 도 3에서 볼 수 있듯이, P7의 프라이머 쌍을 이용하는 경우에는 하례조생 품종을 포함한 모든 7품종에서 약 380bp의 증폭 산물이 검출됨을 확인하였다.
또한, 도 4에서 볼 수 있듯이, P2, P3, P4 또는 P6의 프라이머 쌍을 이용하는 경우에는 모든 품종에서 PCR 증폭 산물이 검출되거나, 또는 검출되지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 하례조생 SNP 검출 용도로서 제작한 7개의 프라이머 쌍 중에서도 P1 또는 P5의 프라이머 쌍만이 상기 SNP를 검출할 수 있으며, 또한 감귤 품종 중에서 하례조생 품종만을 선별할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
2.
하례조생
품종의 선별 방법 개발
보다 간편한 하례조생 품종의 선별 방법을 개발하기 위하여, 상기 두 쌍의 프라이머들(P1 및 P5)을 혼합하여 한 번의 PCR을 수행하였다. 이때, PCR은 상기 실시예 1에 따른 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 하례조생 품종에서만 P1 및 P5의 프라이머 쌍에 의해 PCR 증폭 산물(P1: 165bp 및 P5: 526bp)이 검출됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, P1 및 P5의 프라이머 쌍들을 혼합하여 한 번의 PCR을 수행하여도 감귤 품종 중에서 하례조생 품종만을 선별할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
3.
하례조생
품종의 선별 방법 검증
상기 실시예 1 및 2를 통해, 개발한 P1 및 P5의 프라이머 쌍을 혼합하여 PCR을 수행하는 경우 하례조생 품종을 간편히 선별할 수 있음을 확인하였다. 이에, 상기 프라이머 및 이를 이용한 선별 방법의 유효성을 확인하기 위하여, 하례조생을 포함한 온주밀감 품종들에 대하여 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 3에 기재한 바와 같이 각지의 농가에서 수집한 온주밀감 품종들에 대하여 상기 실시예 1에 따른 방법으로 PCR를 수행하였다. 각 품종당 5그루 나무에서 수집한 잎에서 게놈 DNA를 추출하여 사용하였고, 상기 DNA의 농도는 15 ng/㎕로 조절하였다.
| No. | 품종명 | 사용한 프라이머의 종류 | PCR 결과 | ||
| P1 | P5 | P1 | P5 | ||
| 1 | 하례조생 원목 | P1 | P5 | + | + |
| 2 | 노지궁천 하엽 | P1 | P5 | - | - |
| 3 | 하례조생 묘목 | P1 | P5 | + | + |
| 4 | 궁천조생 묘목 | P1 | P5 | - | - |
| 5 | 전구조생 묘목 | P1 | P5 | - | - |
| 6 | 히로시마7호 모수 | P1 | P5 | - | - |
| 7 | 유라실생 모수 | P1 | P5 | - | - |
| 8 | 하례조생 묘목-1 | P1 | P5 | + | + |
| 9 | 일남1호 묘목 | P1 | P5 | - | - |
| 10 | 유라조생 묘목 | P1 | P5 | - | - |
| 11 | 조생 현행신2-1 | P1 | P5 | - | - |
| 12 | 조생 현행신2-2 | P1 | P5 | - | - |
| 13 | 대정 하례조생 | P1 | P5 | + | + |
| 14 | 저지리 조생 | P1 | P5 | - | - |
| 15 | 저지리 하례조생 | P1 | P5 | + | + |
| 16 | 농협 하례조생 | P1 | P5 | + | + |
| 17 | 히고 모수 | P1 | P5 | - | - |
그 결과, 상기 표 3 및 도 6에서 볼 수 있듯이, 하례조생 품종(1, 3, 8, 13, 15 및 16번)에서만 P1 및 P5의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 산물(P1: 165bp 및 P5: 526bp)이 검출됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, P1 및 P5의 프라이머 쌍을 이용하는 경우 감귤 품종 중에서 하례조생 품종만을 선별할 수 있으며, 상기 프라이머들을 혼합하여 사용하여도 PCR 증폭 산물이 검출되므로 더욱 간편히 하례조생 품종만을 선별할 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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<400> 1
caaaagagct caaataaggc 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 2
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<223> HL-SNP-SCAF_2-36059523-R
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cagaaaattc aactgacggt ga 22
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<212> DNA
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<220>
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<223> HL-SNP-SCAF_2-176744-R
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caaagaaacc agggacgaag 20
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ccatgttatg agttctgcag tt 22
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<213> Artificial Sequence
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> HL-SNP-SCAF_5-41248465-R
<400> 14
ctgccttcgt tcttatttac ct 22
Claims (9)
- 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 10으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 감귤 품종 중 하례조생 선별용 조성물.
- 삭제
- 제1항의 감귤 품종 중 하례조생 선별용 조성물을 포함하는, 감귤 품종 중 하례조생 선별용 키트.
- 삭제
- 제3항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 키트
- (a) 감귤로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 감귤 품종 중 하례조생 선별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
(b) 얻어진 증폭 산물로부터 감귤의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 감귤 품종 중 하례조생을 선별하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 감귤의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인, 감귤 품종 중 하례조생을 선별하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 단계 (b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 감귤 품종 중 하례조생을 선별하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 방법은 (c) 증폭 산물이 검출되는 경우에 상기 감귤 품종을 하례조생으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 감귤 품종 중 하례조생을 선별하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020170068611A KR101877532B1 (ko) | 2017-06-01 | 2017-06-01 | 하례조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170068611A KR101877532B1 (ko) | 2017-06-01 | 2017-06-01 | 하례조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR101877532B1 true KR101877532B1 (ko) | 2018-07-12 |
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ID=62919736
Family Applications (1)
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| KR1020170068611A KR101877532B1 (ko) | 2017-06-01 | 2017-06-01 | 하례조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR101877532B1 (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102272593B1 (ko) * | 2020-06-17 | 2021-07-05 | 주식회사 바이오메딕 | 적육 형질을 가지는 감귤류 판별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN114438249A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-05-06 | 江西省农业科学院园艺研究所 | 一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法 |
| KR20240128189A (ko) | 2023-02-16 | 2024-08-26 | 제주대학교 산학협력단 | 돌연변이 감귤 아라온주 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
| KR20240128188A (ko) | 2023-02-16 | 2024-08-26 | 제주대학교 산학협력단 | 돌연변이 감귤 권제조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150101319A (ko) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 대한민국(국립종자원장) | 초위성체 마커를 이용한 감귤 품종식별 방법 |
-
2017
- 2017-06-01 KR KR1020170068611A patent/KR101877532B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150101319A (ko) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 대한민국(국립종자원장) | 초위성체 마커를 이용한 감귤 품종식별 방법 |
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| KR102272593B1 (ko) * | 2020-06-17 | 2021-07-05 | 주식회사 바이오메딕 | 적육 형질을 가지는 감귤류 판별을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN114438249A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-05-06 | 江西省农业科学院园艺研究所 | 一种鉴别井冈蜜柚栽培种类型的引物组、试剂盒及鉴别方法 |
| KR20240128189A (ko) | 2023-02-16 | 2024-08-26 | 제주대학교 산학협력단 | 돌연변이 감귤 아라온주 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
| KR20240128188A (ko) | 2023-02-16 | 2024-08-26 | 제주대학교 산학협력단 | 돌연변이 감귤 권제조생 품종 특이적 snp 마커 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
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| Date | Code | Title | Description |
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| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20170601 |
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