KR101510421B1 - 살갈퀴에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 98로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 살갈퀴의 유전적 다형성 검출 방법 및 유전자원의 동정 방법에 관한 것이다.

Description

살갈퀴에서 유래한 ＳＳＲ 프라이머 및 이의 용도{SSR PRIMER DERIVED FROM VICIA SATIVA SUB SP. NIGRA AND USE THEREOF}
본 발명은 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra)에서 분리한 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 서열번호 98로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 살갈퀴의 다형성 검출 방법 및 유전자원 동정 방법에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소면적 재배 작물에 대해서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성 검출로 각광받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하다는 단점이 있다. 이에 반해, SSR(Simple Sequence Repeat; 반복염기서열) 방법은 DNA 반복 배열인 마이크로세틀라이트(microsatellite) 영역의 염기 배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 이용하는 방법으로서, 마이크로세틀라이트 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 특히 SSR 방법은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 이와 같은 SSR 방법의 우수성으로 인해 여러 주요 작물 및 소면적 재배 작물에서 SSR 프라이머를 개발하려는 연구가 진행 중에 있다.
세계적으로 저투입 지속농업을 위해 녹비자원이 부각되고 있다. 녹비자원 중 우리나라에서 자생하고 있는 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra)는 헤어리 베치(Vicia villosa)를 대체할 수 있는 녹비자원으로 효율적인 활용을 위해서 분자유전학적 평가가 필요하며 살갈퀴 경우 분자유전학적 분석법 중 재현성과 다형성이 높은 SSR(Simple Sequence Repeat; 반복염기서열) 프라이머가 국내외에 개발되어있지 않다.
이에, 본 발명자들은 살갈퀴의 염기서열로부터 유용자원선발, 분류, 중복성 판별, 분자육종 및 유사작물과의 혼용 판별 등에 적용 가능한 새로운 SSR 프라이머를 개발하였다.
본 발명의 목적은 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra) 유전자원을 효율적으로 평가할 수 있는 SSR 및 이의 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 98로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 갖는 SSR 프라이머쌍을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용한 살갈퀴의 다형성 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 이용한 살갈퀴의 유전자원 확인 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 살갈퀴의 다형성 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 SSR 프라이머쌍을 포함하는 살갈퀴 유전자원 확인용 키트를 제공한다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 살갈퀴의 유전적 다형성을 효과적으로 검출하여 살갈퀴의 유전자 프로파일을 작성하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 이를 통해 살갈퀴 유전자원을 효율적으로 평가함으로써 유용자원 선발, 다형성 분석, 종 판별, 품종 판별, 중복성 판별, 분자 육종 및 유사작물과의 혼용 판별에 활용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 살갈퀴의 유전적 다형성을 특이적으로 분석할 수 있는 SSR 프라이머를 제공한다.
상기 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33 및 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43 및 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45 및 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47 및 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53 및 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55 및 56으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 57 및 58로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 59 및 60으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 61 및 62로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 63 및 64로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 65 및 66으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 67 및 68로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 69 및 70으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 71 및 72로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 73 및 74로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 75 및 76으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 77 및 78로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 79 및 80으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 81 및 82로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 83 및 84로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 85 및 86으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 87 및 88로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 89 및 90으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 91 및 92로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 93 및 94로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 95 및 96로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 97 및 98로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 프라이머쌍은 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra)로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머는 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 서열번호 1 내지 서열번호 98로 이루어진 군에서 선택되는 2개의 염기서열을 가진다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra)에서 추출한 RNA에 대하여 염기서열 분석을 수행한 후, 이들에 대하여 SSR 부위를 확인하였다. RNA 염기서열 분석을 기초로 하여 살갈퀴에서 특이적인 반복 염기서열을 포함하는 부위를 증폭하여 확인할 수 있도록 프라이머를 제작하였다. 그 결과, 현재까지 살갈퀴에 적용 가능한 총 49쌍의 다형성 SSR 프라이머를 개발하였다.
본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍은 살갈퀴에서 다형성을 검출하고 유전적 다양성을 분석하는 데 유용하게 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 SSR 프라이머를 이용하여 살갈퀴 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존하는 데 이용할 수 있고, 또한 향후 개발될 살갈퀴 품종의 동정에 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 살갈퀴 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
3) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 살갈퀴의 유전적 다형성 검출 방법을 제공한다.
상기 1) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법 (Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 2) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 살갈퀴에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때, MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5 내지 2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭 산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94 내지 95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 70 내지 75℃, 예를 들면 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성은 90 내지 99℃, 92 내지 97℃ 또는 94 내지 95℃에서 수행될 수 있으며, 증폭은 70 내지 75℃, 71 내지 74℃ 또는 72℃에서 수행될 수 있다. 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있는데, 예를 들어 50 내지 59℃, 52 내지 57℃ 또는 55℃로 수행할 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명의 실시예에 따른 SSR 프라이머쌍을 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 30 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시킨다.
상기 3) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 예를 들면, 아가로스 겔(agarose gel), 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)를 이용하여 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 2)단계에서 PCR을 수행할 수 있다. PCR 증폭 결과는 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있어 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 살갈퀴 및 대조군 살갈퀴 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
3) 상기 살갈퀴 및 대조군 살갈퀴의 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
4) 상기 PCR 산물의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 살갈퀴 유전자원 확인 방법을 제공한다.
상기 '유전자원'이란 '종자 또는 식물체'를 의미한다.
1) 내지 3) 단계의 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 앞서 기재한 바와 같으며, 상기 4) 단계에서 살갈퀴 및 대조군 살갈퀴 종자에 대한 비교는 동일한 조합의 SSR 프라이머쌍에 대해 시료가 되는 살갈퀴와 대조군 살갈퀴 각각의 PCR 산물의 크기를 서로 비교하는 방법으로 수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에 대한 크기 비교 결과를 종합하여 시료가 되는 살갈퀴와 대조군 살갈퀴의 결과가 모두 일치하면 시료가 되는 살갈퀴는 대조군 살갈퀴와 동일하다고 할 수 있다. 이와 같은 유전자원 확인 방법은 신규 유전자원 도입시 중복 여부 판단 및 원산지 확인을 통한 품종의 동정이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
대조군 살갈퀴 품종에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리는 시료가 되는 살갈퀴와 동시에 수행될 수도 있으나, 시료가 되는 살갈퀴보다 이전에 수행되어 동정의 기준표(reference)로 작성될 수도 있다. 이러한 기준표를 이용하면 시료가 되는 살갈퀴에 대한 게놈 DNA 추출, PCR 수행 및 PCR 산물의 크기별 분리만을 수행하여 기준표와 비교할 수 있어 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 살갈퀴의 유전적(DNA) 다형성 검출용 키트를 제공한다.
상기 SSR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 SSR 프라이머쌍을 포함하는 살갈퀴 유전자원 확인용 키트를 제공한다.
유전자원 확인 방법은 상기에서 기재한 바와 같다.
상기 SSR 프라이머쌍 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
< 실시예 1> 살갈퀴 유래 SSR 프라이머 제작
본 발명자들은 살갈퀴 염기서열을 분석하여 SSR 프라이머를 제작하였다.
구체적으로, 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 보유하고 있는 살갈퀴(IT160637)을 파종 50일 후 전체 RNA를 추출한 뒤, PolyATract mRNA Isolation System IV (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 mRNA를 정제하였다. 정제된 mRNA 및 ZAP-cDNA 합성 키트 (Stratagene, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 차세대 염기서열 분석장비(GS FLX, Roche)를 이용하여 살갈퀴의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열 중 특이적인 단순반복염기(simple sequence repeats, SSR)를 ARGOS 프로그램을 이용하여 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 그 후 각각의 프라이머에 대한, 주형 DNA 50 ng, 정방향 프라이머 0.5 μM, 역방향 프라이머 0.5 μM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 각각 100 μM, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 1.5 mM MgCl2, Taq DNA 폴리머라아제 1 유닛을 사용하여, PTC-200 thermocycler (MJ Research, USA)를 이용하여 94℃에서 3분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 72℃에서 1분을 30 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시키는 PCR 반응 조건을 확인하였다.
그 결과, 살갈퀴의 다형성 및/또는 유전자원 확인에 사용할 수 있는 49개의 프라미어쌍을 선별하였다 (표 1).
프라이머 이름 서열 (5'-3') 반복 모티프
Forward 서열번호 Reverse 서열번호
GBrSSR-VSspN-003 CGATAGCGAGACAAATGGA 1 AGCAAACTATTTGCCACCA 2 (GAA)5
GBrSSR-VSspN-020 CTACTACGGGCCGTGACA 3 TGATCCTTGAATCCGTCG 4 (GCA)4
GBrSSR-VSspN-032 GGAAGCCGGATTTCATACA 5 TGCAGCAGTCAAGAGGGT 6 (CAG)5
GBrSSR-VSspN-047 GAGTTCAGCAAAGCCGTG 7 CCACCAAACAGTACGCGA 8 (CAG)4
GBrSSR-VSspN-050 CTCCATGTCCACCACCAC 9 TTGGCCATGGTTGTTCTC 10 (CCA)4
GBrSSR-VSspN-056 GCACGGTGGTCACTATGG 11 TCAAACTCGGCACCACAT 12 (TGG)5...(TGG)5
GBrSSR-VSspN-067 CCACCACCCACCATAATGT 13 AAGAGGCATAGATAGACCGACA 14 (CCA)5
GBrSSR-VSspN-076 TGGCGGAGATGAAAAACA 15 CAAGCATTGGGGTTCTCA 16 (GTG)6
GBrSSR-VSspN-082 ACCATTTGGCCTGTTCCT 17 GGCCTTCAACAAGAGGGT 18 (GGT)5
GBrSSR-VSspN-085 GACGTGGAAGGTGGTGAA 19 CAACGTGCTTTGGGATCT 20 (ATG)6
GBrSSR-VSspN-086 TCACCACCATCGTCAACA 21 TTCCTGCAACATTTTCTCAA 22 (GCG)4
GBrSSR-VSspN-093 TACGGAGGTGGCAACAAC 23 CCCATAGACCGAACTATTGCT 24 (TGG)4
GBrSSR-VSspN-094 TGGTGTTTTTGGCAAAGC 25 TGCAGACAAAGTTCATGCAG 26 (TCA)4
GBrSSR-VSspN-096 AGCCTCATTTCAGCAGCA 27 ATCCATGCCTCTTTTGCC 28 (AGA)5
GBrSSR-VSspN-097 GCATAACAAGACTCGACTCACTC 29 TCGGTGTTCGTTTTATTTTTG 30 (CAC)6
GBrSSR-VSspN-101 TCTTCAAAAGAGTACAAAAGGGA 31 GAATTGGACACCTTGGCA 32 (AAT)5
GBrSSR-VSspN-102 AGCTGTTGTTGCGAAGGA 33 GGAAAGGGGTGCAGATTC 34 (TGC)6
GBrSSR-VSspN-104 TTGGCCATGGTTGTTCTC 35 CTCCATGTCCACCACCAC 36 (TGG)4
GBrSSR-VSspN-113 CGCTCCACTCGACTCAAC 37 CCGTTTGTTCCTCCACAA 38 (CGC)4
GBrSSR-VSspN-117 TGGTGGACGTCACTATGGA 39 ACAAACTCGGCACCACAT 40 (TGG)5...(TGG)5
GBrSSR-VSspN-128 TGACTCGGTTGAGTCGCT 41 ATCGAACCCGGTCTGACT 42 (GAT)4
GBrSSR-VSspN-134 CGTCCTCCAAGGAAACCT 43 TGGGCCAAGCATATGAAG 44 (TCC)5
GBrSSR-VSspN-153 TGAGAGCCAGCTCAATGG 45 TCCTATCCACAAGAACACTGTC 46 (TCA)4
GBrSSR-VSspN-155 TAACCGTTTTCGCCACAC 47 CTCTGGCAACTCACCGAG 48 (CAC)4
GBrSSR-VSspN-163 CCAAAAACCTAACCCCTCA 49 ATCTCTTGCTTCCGCACA 50 (TTC)5
GBrSSR-VSspN-171 CGAGGATCGTGCATCAGT 51 AGTACTCGTGTGGCGGAA 52 (GAT)4
GBrSSR-VSspN-178 TGGACACTATGGTGGTGGA 53 CCTTCTGATTCATGGGCA 54 (TGG)5
GBrSSR-VSspN-182 TGAAAGAGGAGGCGACAA 55 TCTCATTGACGACGGAAAA 56 (CAG)4
GBrSSR-VSspN-186 TCAAAAGTCCTTCCCCAA 57 TGAGATGGGGTCAAATGG 58 (TCT)6
GBrSSR-VSspN-187 AGCCTCATTTCAGCAGCA 59 ACCATGCCTCTTTTGCCT 60 (GAA)5
GBrSSR-VSspN-189 TGGTGTTTTTGGCAAAGC 61 TCATGCAGTTAAAGCACTAAACA 62 (TCA)4
GBrSSR-VSspN-203 AGCCTCATTTCAGCAGCA 63 CAAACCCTAAATCCATGCC 64 (GAA)5
GBrSSR-VSspN-207 CACCACCAAGACCTCCAA 65 CCATCATCATCACCAGCC 66 (ACC)5
GBrSSR-VSspN-209 CTCGAATCCCAAAAACCC 67 AAGCAGGTGAATTGCGAA 68 (TTA)6
GBrSSR-VSspN-210 CATTGTCGGAAGCACCAT 69 GTGAGGAACGTGACGAGG 70 (CCA)5…(CCA)5
GBrSSR-VSspN-212 GCAGATCGCTTCCTCCTT 71 CCAATTCCACTCCAATTCC 72 (ATG)5
GBrSSR-VSspN-231 GCCTCATACCGGAAAGAAC 73 TGCGGGAAAGTTACCTGA 74 (CAA)5
GBrSSR-VSspN-237 TTTCCATAATCAAAGCCATCA 75 ATGCACCTGAGGTTGTGG 76 (TCA)4
GBrSSR-VSspN-238 TCCTTTGCGTTGCTGTTT 77 GCAAGATGCCAACCGTTA 78 (ATC)5
GBrSSR-VSspN-239 GGGCAGGCAGTACTTCAA 79 GCTCATCTTTGCTGTCGG 80 (CTT)4
GBrSSR-VSspN-246 TTCTCCCTTCCGAAAAGC 81 GCTATGGCGGATCATCAA 82 (CGA)4
GBrSSR-VSspN-251 CTGTGTCGAGGAAGCTGG 83 TAAAACCCCACCCAAAGC 84 (AAG)4
GBrSSR-VSspN-258 GAAGGAGAAGGCACCACC 85 CAAAACCTCTCGCCATCA 86 (GAA)4
GBrSSR-VSspN-262 CCCAAGTGTTTTCTGTTACAATC 87 CTTACGTGGGGCAGAATG 88 (ATA)6
GBrSSR-VSspN-263 GCGAGAGGCTCTGGAGTT 89 AGAGCATCTCATACAAAAACCAA 90 (ATG)6
GBrSSR-VSspN-264 AAATCTGCAAAGCCTCGT 91 CTCCATGTTGGGAATTCAA 92 (TGA)5
GBrSSR-VSspN-266 TGGCGGAGATGAAAAACA 93 ACAAGCATTGGGGGTTCT 94 (GTG)6
GBrSSR-VSspN-292 GCATACTGGTGACATTGGG 95 TGCAACTGGAACCTCACC 96 (TGA)5
GBrSSR-VSspN-301 GGGATCCGACCCTAGTCA 97 AAAACCAATGGCCCAATC 98 (TC)8
< 실시예 2> 살갈퀴에 대한 SSR 분석
본 발명자들은 상기 표 1의 49개 프라이머 쌍을 이용하여 살갈퀴 32점에 대한 유전자형(대립유전자) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 표 1의 49개 프라이머 쌍 각각으로 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 보유하고 있는 살갈퀴 32점 (표 2)을 증폭 후 QIAxcel Gel Electrophoresis System (Qiagen)을 이용하여 증폭 산물 (band)의 크기를 분석하였다.
그 결과, 표 3 내지 8과 같은 결과가 나타내었다 (표 안의 숫자는 대립유전자의 크기를 나타낸다). 참고로, SSR 마커는 공우성 마커이기 때문에 1개의 샘플에 두 개의 대립유전자를 가질 수 있어 "/"로 두 개의 대립유전자를 표현하였다.
일련
번호		 관리번호 원산지 일련
번호		 관리번호 원산지 일련
번호		 관리번호 원산지
1 K193549 TUR 12 K193560 ESP 23 K193571 SUN
2 K193550 TUR 13 K193561 BGR 24 K193572 RUS
3 K193551 CYP 14 K193562 FRA 25 K193573 RUS
4 K193552 ZAF 15 K193563 GRC 26 K193574 ROM
5 K193553 ZAF 16 K193564 SCG 27 K193575 ROM
6 K193554 PAK 17 K193565 JPN 28 K193576 UZB
7 K193555 PAK 18 K193566 JPN 29 K193577 TJK
8 K193556 AFG 19 K193567 PRT 30 K193578 TJK
9 K193557 AFG 20 K193568 ISR 31 K193579 UZB
10 K193558 IRN 21 K193569 ISR 32 K193580 BGR
11 K193559 IRN 22 K193570 SVK
일련
번호		 관리번호 GBSSR-VSspN-003 GBSSR-VSspN-020 GBSSR-VSspN-032 GBSSR-VSspN-047 GBSSR-VSspN-050 GBSSR-VSspN-056 GBSSR-VSspN-067 GBSSR-VSspN-076
1 K193549 169 353 243 226 282 240 182/218 101
2 K193551 166 356 240 223 214 240 179/212 101
3 K193552 166 356 240 223 285 260 179/212 101
4 K193553 166 356 240 223 285/336 237/243 179/212 113
5 K193554 169 353 240 223 282/330 295 179/212 113
6 K193556 166 353 243 223 282 246 179/212 107
7 K193557 166 356 243 220 282 243 179/212 107
8 K193558 166 350 240 220 279 243 176/207 113
9 K193559 166 353 240 223 279 237/260 179/212 113
10 K193560 169 350 240 223 282 263 185/218 104
11 K193561 166 353 240 223 282 240 185/218 104
12 K193562 166 353 240 220 282 240 179/212 104
13 K193563 166 356 240 223 285 240 179/212 101
14 K193567 166 350 243 220 282 240/263 176/212 104
15 K193569 166 356 243 223 282 243 179/212 107
16 K193570 166 353 240 223 282/330 243 179/212 113
17 K193572 169 353 240 223 279 243 185/215 113
18 K193574 166 353 240 223 282/330 243 179/212 113
19 K193575 166 353 240 220 282 243 179/212 113
20 K193576 166 356 240 220 285 243 179/212 101
21 K193577 166 356 240 223 282 243 179/212 113
22 K193578 166 353 240 220 282 295 179/212 113
23 K193580 166 353 243 220 279 240/246 176/209 119
일련
번호		 관리번호 GBSSR-VSspN-082 GBSSR-VSspN-085 GBSSR-VSspN-086 GBSSR-VSspN-093 GBSSR-VSspN-094 GBSSR-VSspN-096 GBSSR-VSspN-097 GBSSR-VSspN-101
1 K193557 234 224 192 173 272 232 395/416 422/440
2 K193558 234 224 189 173 272 229 395/416 419
3 K193559 231 221 189 173 272 226 398/419 422
4 K193560 237 227 189 176 272 226 422/434 419
5 K193561 237 227 189 173 272 211 422/465 425
6 K193562 234 227 189 173 272 211 413/458 425
7 K193563 234 227 189 173 275 211 416/455 425
8 K193565 228 227 189 173 275 226 395/455 434
9 K193566 234 227 189 173 275 211 416 434
10 K193567 228 221 189 173 272 229 410/471 422
11 K193568 234 227 192 173 272 232 413 431
12 K193569 234 227 192 173 272 232 416 428
13 K193570 231 221 189 173 272 226 416/431 422
14 K193572 234 221 189 176 272 226 425/437 425
15 K193573 234 224 189 173 272 226 398/431 422
16 K193574 231 224 189 173 272 226 416/431 422
17 K193575 228 227 189 173 275 229 413/486 419
18 K193576 228 224 189 173 278 226 416/428 428
19 K193577 228 227 189 173 278 226 416/449 428
20 K193578 228 224 189 173 272 226 416/428 422
21 K193579 228 224 189 173 272 229 395/413 419
22 K193580 219 224 192 173 272 232 416/468 419
일련
번호		 관리번호 GBSSR-VSspN-102 GBSSR-VSspN-104 GBSSR-VSspN-113 GBSSR-VSspN-117 GBSSR-VSspN-128 GBSSR-VSspN-134 GBSSR-VSspN-153 GBSSR-VSspN-155
1 K193549 268 292 231 238 221 361 227 194
2 K193550 265 283 225 262 215 361 227 191
3 K193551 268 214/224 234 238/262 215 364 227 191
4 K193552 262 283 240 235/259 212 370 227 191
5 K193553 268 280 237 235/262/277 212 367 227 191
6 K193554 268 283 234 259/335 212 361 227 194
7 K193555 271 283 231 241/262 212 361 230 194
8 K193557 274 280 231 247 212 358 233 194
9 K193558 268 283 225 238 215 358 230 191
10 K193559 268 236/283 231 238 215 361 227 191
11 K193560 268 292 222/228 256 221 352/364/373 227 194
12 K193567 268 280 231 241 212 361 230 194
13 K193568 274 283 225 271 212 364 236 194
14 K193570 271 283 231 238/262 215 361 227 191
15 K193572 268 289 225 262 221 358 227 194
16 K193573 268 289 231 259 218 361 227 194
17 K193574 268 283 231 262 215 361 227 188
18 K193575 268 283 234 238/259 212 364 227 191
19 K193576 268 283 240 259 212 367 227 191
20 K193577 268 280 237 238/280 212 367 227 191
21 K193578 268 283 231 238/262 212 361 227 194
22 K193579 271 280 234 259 212 361 230 194
일련
번호		 관리번호 GBSSR-VSspN-163 GBSSR-VSspN-171 GBSSR-VSspN-178 GBSSR-VSspN-182 GBSSR-VSspN-186 GBSSR-VSspN-187 GBSSR-VSspN-189 GBSSR-VSspN-203
1 K193550 240 177 294 195 181 233 264 241
2 K193552 240/273 177 450 195 184 233 270 241
3 K193553 246/313 177 297 195 181 230 270 241
4 K193554 213 177 300 192 181 230 267 244
5 K193555 240 177 303 195 178 230 264 244
6 K193558 243/310 174 300 198 185 233 261 244
7 K193559 246 177 300 198 181 233 264 241
8 K193560 240/270 177 300 201 206/223 236 264 241
9 K193561 243/310 177 282/303 195 181 218 264 223
10 K193562 194/240 177 297 195 181 218/239 267 223
11 K193563 194/240 177 297 195 181 215 270 223
12 K193565 246 177 297 192 181 233 267 241
13 K193566 191/237 177 300 192 181 215 264/303 226
14 K193567 240/270 177 297 195 178 230 267 241
15 K193570 249 174 300 198 175 233 264 241
16 K193571 216/252 174 445 204 199 215/242 267 226/253
17 K193574 249 177 297 195 181 230 267 241
18 K193575 252 177 297 195 181 230 267 238
19 K193576 243 177 297 195 181 230 267 241
20 K193577 246 177 297 192 181 230 267 241
21 K193578 237 177 300 192 178 230 267 241
22 K193579 258 177 300 195 178 230 264 241
23 K193580 246 177 300 195 181 230 264 244
일련
번호		 관리번호 GBSSR-VSspN-207 GBSSR-VSspN-209 GBSSR-VSspN-210 GBSSR-VSspN-212 GBSSR-VSspN-231 GBSSR-VSspN-237 GBSSR-VSspN-238 GBSSR-VSspN-239
1 K193552 269 232 315 387 217 166/196 528 252
2 K193553 269 229 315/324 372 223 181 537 252
3 K193554 266 223 315/324 372 223 181/193 531 255
4 K193555 269 223 315/321 372 223 181/196 540 255
5 K193556 266 223 315 375 223 142/199 537 252
6 K193557 266 223 315/321 375 220 181/199 534 252
7 K193558 266 223 315/321 378 220 142/202 528 252
8 K193559 269 223 315/324 381 223 148/196 531 252
9 K193560 275 223 318 384 232 163/193 525 255
10 K193565 269 229 312 381 223 178/199 531 252
11 K193572 272 229 315 375 223 148/202 525 255
12 K193573 272 226 312/321 381 223 145/199 528 255
13 K193574 269 226 312 372 220 145/199 525 249
14 K193576 266 226 309/318 378 223 181/199 528 249
15 K193577 269 226 312/321 372 223 178/199 531 252
16 K193578 263 226 312/321 369 226 142/202 531 252
17 K193579 266 223 315/324 372 226 178/199 534 255
18 K193580 269 226 315/321 381 220 181/202 540 252
일련
번호		 관리번호 GBSSR-VSspN-246 GBSSR-VSspN-251 GBSSR-VSspN-258 GBSSR-VSspN-262 GBSSR-VSspN-263 GBSSR-VSspN-264 GBSSR-VSspN-266 GBSSR-VSspN-292 GBSSR-VSspN-301
1 K193550 202 203 382 296 296 189 217 327 250
2 K193552 202 185/203 385 296 299 189 217 327 256
3 K193553 199 203 385 299 302 186 220 324 248
4 K193554 199 185/206 382 299 299 189 223 324 248
5 K193555 202 185/206 382 299 302 189 220 327 248
6 K193556 202 206 382 302 299 189 220 324 244
7 K193557 202 206 382 299 299 189 217 324 244
8 K193558 202 203 385 296 305 189 220 324 246
9 K193559 202 203 382 299 299 189 223 327 246
10 K193560 202 203 382 293 302 189 217 336 248
11 K193561 202 200 382 299 305 189 217 333 264
12 K193562 202 203 382 299 299 189 217 324 264
13 K193563 202 203 385 299 302 189 217 324 264
14 K193565 199 203 385 299 302 186 223 324 248
15 K193566 199 206 379 299 302 189 217 327 262
16 K193567 202 206 382 296 299 189 214 330 246
17 K193570 202 203 382 293 302 189 220 324 250
18 K193572 202 203 382 293 305 189 223 333 246
19 K193573 202 200 382 302 299 189 223 327 246
20 K193574 202 200 382 299 299 189 223 324 246
21 K193575 202 203 385 299 299 189 223 324 246
22 K193576 202 203 385 299 302 189 217 327 250
23 K193577 199 203 385 299 296 186 223 324 254
24 K193578 199 206 379 296 296 189 223 324 244
25 K193579 202 206 379 299 299 189 214 324 244
26 K193580 202 203 379 302 299 189 226 324 244
<110> Republic of korea <120> SSR PRIMER DERIVED FROM VICIA SATIVA SUB SP. NIGRA AND USE THEREOF <130> P130201 <160> 98 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-003 forward primer <400> 1 cgatagcgag acaaatgga 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-003 reverse primer <400> 2 agcaaactat ttgccacca 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-020 forward primer <400> 3 ctactacggg ccgtgaca 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-020 reverse primer <400> 4 tgatccttga atccgtcg 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-032 forward primer <400> 5 ggaagccgga tttcataca 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-032 reverse primer <400> 6 tgcagcagtc aagagggt 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBrSSR-VSspN-047 forward primer <400> 7 gagttcagca aagccgtg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> 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Claims (7)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 10으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 12로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 13 및 14로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 16으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 19 및 20으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 22로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 23 및 24로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 25 및 26으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 27 및 28로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 29 및 30으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 31 및 32로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 33 및 34로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 35 및 36으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 37 및 38로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 39 및 40으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 41 및 42로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 43 및 44로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 45 및 46으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 47 및 48로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 49 및 50으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 51 및 52로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 53 및 54로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 55 및 56으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 57 및 58로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 59 및 60으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 61 및 62로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 63 및 64로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 65 및 66으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 67 및 68로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 69 및 70으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 71 및 72로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 73 및 74로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 75 및 76으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 77 및 78로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 79 및 80으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 81 및 82로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 83 및 84로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 85 및 86으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 87 및 88로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 89 및 90으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 91 및 92로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 93 및 94로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 95 및 96로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 97 및 98로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 SSR(simple sequence repeat) 프라이머쌍.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프라이머쌍은 살갈퀴(Vicia sativa Sub sp. nigra)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 SSR 프라이머쌍.
  4. 1) 살갈퀴 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    3) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 살갈퀴의 유전적 다형성 검출 방법.
  5. 1) 살갈퀴 및 대조군 살갈퀴 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 상기 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 제2항의 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계;
    3) 상기 살갈퀴 및 대조군 살갈퀴의 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    4) 상기 PCR 산물의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 살갈퀴 유전자원 확인 방법.
  6. 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 살갈퀴의 다형성 검출용 키트.
  7. 제2항의 SSR 프라이머쌍을 포함하는 살갈퀴 유전자원 확인용 키트.
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