KR102273447B1

KR102273447B1 - 무 자원을 판별하기 위한 kasp 분석용 snp 마커 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102273447B1
Application number: KR1020200016930A
Authority: KR
Inventors: 유희주; 문정환
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2021-07-06
Also published as: KR20210058610A

Abstract

본 발명은 무 자원을 판별하기 위한 KASP 분석용 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 16개의 종 구분용 SNP 마커는 34개의 무 핵심집단 품종의 구별이 가능하므로 이를 이용하면 다양한 무 유전자원을 품종별로 용이하고 신속하게 구분할 수 있어, 고품질의 무 개량 품종 개발 및 농수산물의 수출입 원산지 판별, 무 유전체의 유지 등에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Description

무 자원을 판별하기 위한 KASP 분석용 SNP 마커 세트 및 이의 용도{A set of SNP molecular markers for discriminating radish accessions using KASP assay and uses thereof}

본 발명은 무 자원을 판별하기 위한 KASP 분석용 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 대한 것이다.

무는 배추와 같이 배추과에 속하는 채소작물로서 벼, 고추와 함께 우리나라 3대 주요 작물이다. 무는 채소작물 가운데 우리나라 최근 7년간 누적 종자 수출액 1위 작목으로서, 단일 작목으로는 고추에 이어 2위에 해당하는 매우 중요한 품목이다. 무의 생산량은 연평균 7백만톤으로 추정되는 전 세계 채소작물 생산량의 약 2%에 이른다. 무의 상업적으로 가치가 있는 부위는 뿌리로 당, 미네랄, 식물성추출물 그리고 식용섬유소 등의 광범위한 영양소를 제공하고 다른 부위 또한 식용채소와 오일 원료로 제공되고 있다.

재배용 무는 뿌리 잎과 같이 식용 가능한 부분을 형태적으로 분석하여 4그룹으로 분류한다. 1. Big radish group: East Asian long radish (Raphanus. sativus convar. hortensis), 2. Small radish group: European small radish (R. sativus convar. sativus) 와 Back radish (R. sativus var. niger), 3. Oil radish group: R. sativus convar. oleifer, 4. Rat-tailed radish: R. sativus convar. caudatus. 야생무는 지중해 연안 지역에 서식하는 R. raphanistrum subsp. landra, raphanistrum subsp. maritimus, R. raphanistrum subsp. raphanistrum의 3종과 한국과 중국, 일본을 포함한 동아시아 연안 지역에 서식하는 R. sativus var. raphanistroides가 포함되며, 야생 무 또한 형태적인 분석으로 구분하고 있다.

무는 아시아에서 뿌리채소로 이용되는 작물로서, 형태적으로 다양한 뿌리 모양을 가지며, 생리적으로는 개화시기, 영양성분 등의 차이가 다양하여 고품질을 생산하기 위해서는 유전자원의 확보나 유지가 필수적이다. 따라서 분자육종을 통한 무 신품종 육성을 위해서는 정확하며 범용성이 높은 분자표지의 개발이 필수적이다. 특히 무는 벼, 배추처럼 경제적으로 중요한 작물이므로 다양한 형태의 분자표지 연구가 보고되어 왔다. 이밖에도 무는 4가지 형태의 유전체가 보고되었다. 그러나 현재까지 개발된 생물의 종 및 품종을 식별하는 방법은 형태적 또는 이화학적 방법이 사용되어 왔으나, 배추과인 무를 포함한 작물은 염색체 구성이 복잡하여 분석지표를 정하기 어려워서 거의 주관적으로 품종이나 종의 판별이 이루어지고 있는 실정이다.

분자 유전학의 발전과 염기서열 분석 기술의 발전에 따라 식물종의 다양성을 유전체 수준에서 구별할 수 있게 되었으며, 이들 정보를 이용하여 개발된 분자 표지는 유전자원의 구분 및 평가에 매우 중요하다. 일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정 방법, 종 또는 품종 간 동위효소의 차이를 통한 검정 방법 및 DNA에 기초한 분자 마커를 이용한 검정 방법으로 나뉜다. 이 중 분자 마커를 이용한 검정 방법은 작물의 유전·육종연구에서 유전적 다양성과 계통 유연관계 분석 그리고 식물 유전자원의 보존과 관리 등에 유용한 정보를 제공하고 있으며, 표현형에 근거한 전통적인 식별 방법에 비해 재배 환경 및 작물의 생장 단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점을 가진다.

마커를 이용한 자원 구분은 작물 유전자원의 효율적 관리와 이를 이용한 육종에서 중요하다. 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 high throughput genotyping으로 짧은 시간에 많은 양의 자원을 분석할 수 있으며 낮은 오류와 높은 재현성이 있다. SNP는 DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 말한다. 유전형분석에 사용하는 기법인 KASP assay는 Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system으로 competitive allele-specific PCR의 원리를 이용하고 있으며, 다른 Genotyping assay 방법보다도 KASP 방법은 결과를 수신하는데 걸리는 시간이 짧고, 실험방법이 간단하며, 경제적인 장점이 있다. 또한 SNP의 bi-allelic scoring과 특정 영역의 indel을 확인해야 하는 대규모 대용량 분석에 적합하고 할 수 있다.

한편 식량의 주요 작물이라고 할 수 있는 무는 아직까지 계통분류학적 체계가 보고된 바 없고, 원산지, 품종 등 유전자원의 내역을 신속히 구별할 수 있는 분자마커가 부재한 상황이다. 현재까지 우리나라에서 무 자원이나 계통을 체계적으로 구분할 수 있는 대용량 분석용 SNP 마커 체계는 자원의 도입이나 정리 측면에서 그 개발이 시급한 실정이다.

한국공개특허 제10-2018-0098508호(2018.09.04 공개)

본 발명의 목적은 무 품종 판별용 SNP 마커 세트 조성물, 상기 SNP 마커에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 무 품종 판별용 조성물, 상기 조성물을 함유하는 무 품종 판별용 키트 및 이를 이용한 무 품종 판별 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-99개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 무 품종 판별용 SNP 마커 세트 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-99개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 무 품종 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 함유하는 무 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 무에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 확인된 유전자형으로 무 품종을 판별하는 단계를 포함하는 무 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명은 무 자원을 판별하기 위한 KASP 분석용 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 16개의 종 구분용 SNP 마커는 34개의 무 핵심집단 품종의 구별이 가능하다. 특히, 본 발명의 분자표지 세트를 이용하면 야생자원(wild radish), 쥐꼬리 무(rat-tailed radish), 흑무(black radish), East Asian long radish, European small radish, oil seed 등 다양한 무 자원의 계통별 구분이 가능하다. 따라서, 본 발명을 이용하면 다양한 무 유전자원을 품종별로 용이하고 신속하게 구분할 수 있어, 고품질의 무 개량 품종 개발 및 농수산물의 수출입 원산지 판별, 무 유전체의 유지 등에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 34개 무 핵심집단 자원에 적용한 80개 SNP에 대한 결과를 나타낸다.
도 2는 선발한 16개 SNP 분자표지의 34개 무 재원에 대한 분석결과를 나타낸다. A: 대립유전자 둘 다 무 표준유전체 WK10039와 동일한 서열(SNP 발생 없음), B: 대립유전자 둘 다 SNP 존재, H: 대립유전자 중 하나에 SNP 존재, -: 분석되지 않은 존재.
도 3은 본 발명을 통해 선발된 16개 SNP 마커 세트의 계통수 분석결과를 나타낸다.

이에, 본 발명에서는 다양한 무 핵심집단 자원을 구분하기 위해 16개 KASP 기반 SNP 마커 세트를 제안하였다. SNP 마커는 기존의 702개 SNP 마커 중에서 최소한의 개수인 16개를 선발하였다. 본 마커 세트를 사용하여 무 핵심집단 34개 자원(야생자원(wild radish) 9종, 쥐꼬리무(rat-tailed radish) 1종, 흑무(black radish) 1종, East Asian long radish 9종, European small radish 12종, oil radish 2종)에 적용하였을 때, 계통별로 모두 잘 구분되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-99개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는 무 품종 판별용 SNP 마커 세트 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 무 품종은 야생무(wild radish), 쥐꼬리무(rat-tailed radish), 흑무(black radish), 동아시아 긴 무(East Asian long radish), 유럽 작은 무(European small radish) 또는 기름 무(oil radish) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 SNP 마커 세트 조성물은 경쟁적 대립 유전자 특이적 PCR(Kompetitive Allele Specific PCR; KASP) 분석에 사용하기 위한 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RsHH025-1_13109로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 C/T이다. 상기 서열번호 1의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, C 또는 T일 수 있으므로 "y"라고 기재하였다.

상기 서열번호 2의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RS2CL3703s_516으로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/C이다. 상기 서열번호 2의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 C일 수 있으므로 "s"라고 기재하였다.

상기 서열번호 3의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 COS0566_179로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 T/C이다. 상기 서열번호 3의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, T 또는 C일 수 있으므로 "y"라고 기재하였다.

상기 서열번호 4의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 COS0151_283으로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 A/T이다. 상기 서열번호 4의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, A 또는 T일 수 있으므로 "w"라고 기재하였다.

상기 서열번호 5의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RsSNP07531_14513으로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/C이다. 상기 서열번호 5의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 C일 수 있으므로 "s"라고 기재하였다.

상기 서열번호 6의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RS2CL1544s_2285로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 T/G이다. 상기 서열번호 6의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, T 또는 G일 수 있으므로 "k"라고 기재하였다.

상기 서열번호 7의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RsSNP06056_1252로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 T/C이다. 상기 서열번호 7의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, T 또는 C일 수 있으므로 "y"라고 기재하였다.

상기 서열번호 8의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 COS0530_10656로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/A이다. 상기 서열번호 8의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 A일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.

상기 서열번호 9의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RSS2884_12650로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/A이다. 상기 서열번호 9의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 A일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.

상기 서열번호 10의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RS2CL683s_6854로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 T/G이다. 상기 서열번호 10의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, T 또는 G일 수 있으므로 "k"라고 기재하였다.

상기 서열번호 11의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RS2CL2646_8211로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/T이다. 상기 서열번호 11의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 T일 수 있으므로 "k"라고 기재하였다.

상기 서열번호 12의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RSS1854_5572로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/A이다. 상기 서열번호 12의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 A일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.

상기 서열번호 13의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RsSNP08808_10107로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/A이다. 상기 서열번호 13의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 A일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.

상기 서열번호 14의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RSS3548_8083으로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 A/C이다. 상기 서열번호 14의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, A 또는 C일 수 있으므로 "m"이라고 기재하였다.

상기 서열번호 15의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 RsSNP14867_2430으로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 A/G이다. 상기 서열번호 15의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, A 또는 G일 수 있으므로 "r"이라고 기재하였다.

상기 서열번호 16의 51번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 COS0279_2650으로 표시하여 기재할 수 있으며, 대립유전자형은 G/T이다. 상기 서열번호 16의 51번째 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, G 또는 T일 수 있으므로 "k"라고 기재하였다.

본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자 마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.

본 발명에 있어서, "분자 마커"는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법이다. 외부 형태적 특성에 의한 유전자원의 평가는 작물 생육상태와 여러 가지 환경요인에 따라 영향을 받지만, DNA 마커에 근거한 평가는 환경의 영향을 받지 않기 때문에 표현형의 특성을 대체 하고 보완하는데 활용성이 높다. DNA 마커는 다른 품종임에도 불구하고 동일한 품종명을 가지거나(이품종 동명) 여러 개의 다른 품종명을 가지고 있는 동일한 품종(동품종 이명) 및 유사한 품종을 판별하는데 유용한 기술이다. 따라서 DNA 마커에 의한 품종 판별은 형태적 형질의 조사 없이 추출한 DNA를 이용하여 쉽고 정확하게 품종을 구분할 수 있기 때문에 묘목 유통과정에서 품종 혼입을 방지할 수 있다.

본 발명에 있어서, "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 ‘단일염기다형성’, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

바람직하게는, 상기 프라이머는 서열번호 17, 서열번호 33 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 18, 서열번호 34 및 서열번호 50으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19, 서열번호 35 및 서열번호 51로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 20, 서열번호 36 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21, 서열번호 37 및 서열번호 53으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 22, 서열번호 38 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23, 서열번호 39 및 서열번호 55로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 24, 서열번호 40 및 서열번호 56으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25, 서열번호 41 및 서열번호 57로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 26, 서열번호 42 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 27, 서열번호 43 및 서열번호 59로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 28, 서열번호 44 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 29, 서열번호 45 및 서열번호 61로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 30, 서열번호 46 및 서열번호 62로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 31, 서열번호 47 및 서열번호 63으로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 32, 서열번호 48 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 조성물은 경쟁적 대립 유전자 특이적 PCR(Kompetitive Allele Specific PCR; KASP) 분석에 사용하기 위한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 무 품종 판별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩 키트가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 키트에는 본 발명의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.

바람직하게는, 상기 (2) 단계의 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계는 서열번호 17, 서열번호 33 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 18, 서열번호 34 및 서열번호 50으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19, 서열번호 35 및 서열번호 51로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 20, 서열번호 36 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21, 서열번호 37 및 서열번호 53으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 22, 서열번호 38 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23, 서열번호 39 및 서열번호 55로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 24, 서열번호 40 및 서열번호 56으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25, 서열번호 41 및 서열번호 57로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 26, 서열번호 42 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 27, 서열번호 43 및 서열번호 59로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 28, 서열번호 44 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 29, 서열번호 45 및 서열번호 61로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 30, 서열번호 46 및 서열번호 62로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 31, 서열번호 47 및 서열번호 63으로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 32, 서열번호 48 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고, 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

무에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 식물 재료 게놈 및 DNA 추출

다양한 무 핵심집단 125개 자원들 중에서 F₃ 이상 진전한 자원 및 무 자원의 계통이 명확하게 기재되어있는 34개 (야생자원(wild radish) 9종, 쥐꼬리무(rat-tailed radish) 1종, 흑무(black radish) 1종, East Asian long radish 9종, European small radish 12종, oil radish 2종) 무 자원을 이용하였다(표 1). 무 자원의 어린잎 조직으로부터 genomic DNA (gDNA)를 추출하였다. 각 어린잎은 metal ball을 이용하여 파쇄한 후, Plant gDNA extraction Kit(바이오메딕)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라서 gDNA를 추출하였다.

Type	Sample ID	Root shape	Root color	Origin	Accession	Scientific name
Black radish	CUR096	Circular	Black	Unknown	Kohlschwarzer plattrunder	R. sativus var. niger
East Asian long radish	CUR066	Rectangular	Red	Afghanistan	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR068	Narrow obtriangular	Green and white	Portugal	Giant Japanese radish	R. sativus convar . sativus
	CUR069	Elliptic	Black	Germany	Dresdner grauer	R. sativus convar . sativus
	CUR071	Elliptic	Red	NorthKorea	Bang-uimu	R. sativus convar . sativus
	CUR072	Narrow obtriangular	Red and white	Libyay	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR074	Rectangular	Green and white	Czechoslovakia	Blanc demi long de strasbourg	R. sativus convar . sativus
	CUR075	Elliptic	Purple	Greece	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR076	Rectangular	White	Greece	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR078	Obovate	Black	North Korea	Unknown	R. sativus convar . sativus
European small radish	CUR079	Elliptic	Red	Switzerland	Triumph	R. sativus convar . sativus
	CUR081	Circular	Red	Czechoslovakia	Maslova obri	R. sativus convar . sativus
	CUR082	Rectangular	Red	Bulgaria	Sofijskaja prevazhodna	R. sativus convar . sativus
	CUR083	Elliptic	Red	Armenia	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR084	Elliptic	Red	Hungary	Szentesi hajtato	R. sativus convar . sativus
	CUR085	Elliptic	Red	Mongolia	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR086	Rectangular	Red	Kazakhstan	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR087	Narrow rectangular	Red	Tajikistan	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR088	Circular	Red	Tajikistan	Calcham-ca (tadz.)	R. sativus convar . sativus
	CUR089	Circular	Red	Russia	Dunganskyi	R. sativus convar . sativus
	CUR091	Circular	Red	Spain	Unknown	R. sativus convar . sativus
	CUR094	Obovate	Red	Turkey	Radieschen	R. sativus convar . sativus
Oil radish	CUR006	Narrow rectangular	Red and white	Germany	Mator	R. sativus convar . Oleifer
Oil radish	CUR007	Narrow rectangular	Red and white	UK	Slobolt	R. sativus convar . Oleifer
Rat-tailed radish	CUR003	Rectangular	White	India	Magri	R. sativus convar . Caudatus
Wild radish	CUR099	Not expanded	White	Greece	Unknown	R. raphanistrum subsp. landra
	CUR103	Not expanded	White	Poland	Unknown	R. raphanistrum subsp. raphanistrum
	CUR105	Not expanded	White	Spain	Unknown	R. raphanistrum subsp. raphanistrum
	CUR109	Not expanded	White	Spain	Unknown	R. raphanistrum subsp. raphanistrum
	CUR111	Not expanded	White	Finland	Unknown	R. raphanistrum subsp. raphanistrum
	CUR117	Not expanded	White	Spain	Unknown	R. raphanistrum subsp. raphanistrum
	CUR121	Narrow obtriangular	White	South Korea	Bukjeju-KHC-1999-80	R. sativus var. raphanistroides
	CUR122	Narrow obtriangular	White	South Korea	Busanhaeundae-2003-26	R. sativus var. raphanistroides
	CUR124	Narrow obtriangular	White	South Korea	Jejunamjeju-2003-208	R. sativus var. raphanistroides

2. SNP 분자표지 분석

무 핵심집단의 34개 자원의 gDNA를 사용하여 KASP assay 방법으로 SNP 분자표지 분석을 수행하였다. KASP에 필요한 프라이머는 LGC로부터 합성하였으며, KASP master mix를 이용하여 유전형분석(genotyping)을 수행하였다. PCR 조건은 아래 표 2와 같이 수행하고, 이 후 FAM, HEX 형광값을 바탕으로 각 샘플의 유전형(genotype)을 결정하였다.

94℃ for 15 minutes	Hot-start activation
94℃ for 20 seconds	10 cycles
61-55℃ for 60 seconds
(dropping 0.6℃ per cycle)
94℃ for 20 seconds	26 cycles
55℃ for 60 seconds	26 cycles

본 연구실에서 기보유하고 있는 무 F1 품종에서 발굴된 31개 SNP 분자표지 및 무 유전자원 분석용으로 개발한 702개의 Fluidigm용 SNP 분자표지에서 다형성, 분석용이성, 염색체 내 위치를 바탕으로 다양한 무 핵심집단 자원을 구별하기 위한 54개 SNP를 선별하였다. 이들 85개 SNP에 대한 KASP genotyping primer를 제작하고, <무 핵심집단> 34개 자원에 적용하여 자원의 구분이 가능한지 확인하였다.

3. SNP 최소 분자표지 선발 및 유전 분석

다양한 무 자원을 구분할 수 있는 최소 분자표지를 선발하기 위해 KASP assay 결과인 genotyping data를 PowerCore 1.0 프로그램을 이용하여 무 핵심집단 구분이 가능한 최소 분자표지를 분석하여 선발하였고, 선발된 분자표지 genotyping data는 NTSYSpc 2.1을 이용하여 UPGMA 계통수를 작성하였고, 유전적 거리를 분석하였다.

<실시예>

1. SNP 분자표지 선발 및 분석

본 연구실에서 기보유하고 있는 702개 SNP 마커에서 다형성, 분석용이성, 염색체 내 위치 등을 고려하여 85개 SNP 분자표지를 선발하였고, 다양한 무 핵심집단 자원에 적용하여 유전 다형성 분석을 수행하였다. 그 결과 다형성이 없거나 분석이 어려운 분자표지가 5개였으며 이들을 제외한 80개가 명확하게 분석결과를 보였다(도 1). 34개 자원에 대한 유전 다형성 분석결과를 토대로 무 자원 구분이 가능한 16개 마커세트를 선발하였다. 선발한 16개 SNP의 서열을 확인하여 표 3에 정리하였다(서열번호 1 내지 16의 서열에서 각각 51번째 염기가 변이). 이에 대한 프라이머 세트의 정보는 표 4 내지 표 6(ASI 프라이머: 변이 전 레퍼런스 서열에 대한 forward 프라이머, AS2 프라이머: 변이 후 SNP에 대한 forward 프라이머, 및 common primer: 각각의 SNP에 대한 reverse 프라이머)에 나타내었다.

선발한 16개 SNP 분자표지에 대해, 염색체 한 쌍 모두에서 염기의 변이(SNP)가 존재하면 B로, 염색체 한 쌍 중 하나에서만 염기의 변이(SNP)가 존재한다면 H로, 그리고 염색체 한 쌍 모두에서 염기의 변이(SNP)가 존재하지 않으면 A로 표시함으로 34개 무 핵심집단 자원을 구분할 수 있었다(도 2).

서열번호	염색체	위치	SNP 명칭	SNP 서열
1	R1	319352	RsHH025-1_13109	CTCTACTCGGGCAACTTACTTGCTCCTTACAACCAGTACCGAGCCCTCTA[C/T]CTTGCTGCCGACAAATACGACATTCCTTATCTCCAAGACGTTTGCCGCGA (서열번호 1)
2	R2	677185	RS2CL3703s_516	CAGAAATTTAGGCTTGGAAAGCAGCCGCACAAGGAGTACGGAGATCACTC[G/C]ACAAAGGAAGGTTCAAGAGGTGACCGCTCTTCTTTTCTAGATTTATTAAG (서열번호 2)
3	R2	10393209	COS0566_179	CTCCACTAGATGAGGTCACATTCCGTAGGTTACAGTCTCTCCAGAAAAAG[T/C]TAGTGGATGCTGTTCCTCATGTTGCCGGTCTGAACCCACGCTCTTTCCGT (서열번호 3)
4	R2	20441435	COS0151_283	AACTCTTCTCTAAGCCGTCTTCCCAAGTCAGGCATGTGGCCTCCTCCGTA[A/T]AGAATCGCAACTCTCTTGTGTCCTTGCTCTATTGCTCTTTTCAAAGCTTC (서열번호 4)
5	R3	2888842	RsSNP07531_14513	CGTAGAGGTCATGGCCTCTTCAACTAGTACAGTTCTTGATCAATAGTCTT[G/C]TGTATTTACATTTACCTTAGATATGTATTGGCGTCGTCTCATATTCTAGA (서열번호 5)
6	R3	19500287	RS2CL1544s_2285	TAAGTAAGAACATTGAGATATGTTGAAGTCGTACCGAAGATTTTGTAGTC[T/G]CCGTCGACAACAGCAGGGACGGTACCGAAAGGCTGCATGGGAAGAAACAA (서열번호 6)
7	R4	42354514	RsSNP06056_1252	AGCTTATTAGTTATCATCATTTGGTTATTAATTATTGAGCATACAATAGA[T/C]GGTTAACTTTATATATGGAAAATGCATGGAACATGACATAGCTATGGAGC (서열번호 7)
8	R6	14598282	COS0530_10656	TGAAGGTTACGCCAAGAGCTAAACGACATAACTGTGGGAAGAAGATCGAG[G/A]GCAAGTCAAAAGGGTTTAGACTAAACAGACCAAGGAAGCTGGTTCTTAAG (서열번호 8)
9	R6	41317536	RSS2884_12650	ACGAGTTTCAGACAGAGATTTGCTGATTAGGATCCATTGTGAAAAAAACA[G/A]AGGTTGTTTAGTTAAGATCTTGAGTTCACTGGAGAAGTTTCGTCTTGAAG (서열번호 9)
10	R7	690390	RS2CL683s_6854	AGAGGGATGACAGGGTACTTCGTGACCTTTCCATCTTCAGCAACAACCAC[T/G]GGGTCTGCCCCCTGTGTAATCACGGTGGTCCTCTTGTATGTTCCTGTGGC (서열번호 10)
11	R7	16677445	RS2CL2646_8211	GTGGACATTGCCTTTATAGGATTCTACAGTTGGTTCCGTACGTACGAGGT[G/T]ATTGCAAATTTCAGCATTGTGGCAGAGTATCCTAAGTTAATTGCTTGGGC (서열번호 11)
12	R7	18383868	RSS1854_5572	CACACAGGTGATCGGATTGCCACTAAGATCTTCGAGTCTTTGGAGGAATG[G/A]GGTTTAGAGAAAAAGATTTTCTCAATTATTCTAGACAATGCCACAAAAAA (서열번호 12)
13	R8	575156	RsSNP08808_10107	ATTTGAAACTAGTGGAAATATAAACCAAACTATAGAACAAAAATATTCAC[G/A]AAAATTGTAAAGATCAAATTATGAGTGGAATGAGAGTCAGTCCATCGAAT (서열번호 13)
14	R8	4214931	RSS3548_8083	AAAACTGTATGATGTTCACTACTTGATGCAAAATATCTACACCCGAATCT[A/C]AAATGTACTTACCGCAATGTTCATTAAATTTTGGGTGTCATTTCATATCG (서열번호 14)
15	R8	16571251	RsSNP14867_2430	TGTGCAGGACAGAGTATCAGCCCCCGAGATCTTGCTATACTCTGCCAAAA[A/G]GTTATAGTAAGGTCATTTCCTGAATTTGTGCAATGTTAATTTGTTTTTTC (서열번호 15)
16	R9	28041727	COS0279_2650	TGGGGAGATGATTGGGGCGATGGAGATGAAGAACAGCCGAACACTCCGGT[G/T]TTACCACTCACACCGAGTGTTTCTTCTAGAGGACTTGCTCCTAGACGACT (서열번호 16)

SNP marker	Forward (FAM-labelled) primer (5' to 3')
RsHH025-1_13109	GTCGTATTTGTCGGCAGCAAGG (서열번호 17)
RS2CL3703s_516	CAAGGAGTACGGAGATCACTCG (서열번호 18)
COS0566_179	CAACATGAGGAACAGCATCCACTAA (서열번호 19)
COS0151_283	AGGACACAAGAGAGTTGCGATTCTT (서열번호 20)
RsSNP07531_14513	AGTACAGTTCTTGATCAATAGTCTTG (서열번호 21)
RS2CL1544s_2285	AAGTCGTACCGAAGATTTTGTAGTCT (서열번호 22)
RsSNP06056_1252	ATTTGGTTATTAATTATTGAGCATACAATAGAT (서열번호 23)
COS0530_10656	ATAACTGTGGGAAGAAGATCGAGG (서열번호 24)
RSS2884_12650	GAACTCAAGATCTTAACTAAACAACCTC (서열번호 25)
RS2CL683s_6854	TTCCATCTTCAGCAACAACCACT (서열번호 26)
RS2CL2646_8211	TGGTTCCGTACGTACGAGGTG (서열번호 27)
RSS1854_5572	GAATAATTGAGAAAATCTTTTTCTCTAAACCC (서열번호 28)
RsSNP08808_10107	ATAAACCAAACTATAGAACAAAAATATTCACG (서열번호 29)
RSS3548_8083	AAAATTTAATGAACATTGCGGTAAGTACATTTT (서열번호 30)
RsSNP14867_2430	ACAAATTCAGGAAATGACCTTACTATAACT (서열번호 31)
COS0279_2650	GAACAGCCGAACACTCCGGTG (서열번호 32)

SNP marker	Forward (HEX-labelled) primer (5' to 3')
RsHH025-1_13109	AATGTCGTATTTGTCGGCAGCAAGA (서열번호 33)
RS2CL3703s_516	CAAGGAGTACGGAGATCACTCC (서열번호 34)
COS0566_179	AACATGAGGAACAGCATCCACTAG (서열번호 35)
COS0151_283	AGGACACAAGAGAGTTGCGATTCTA (서열번호 36)
RsSNP07531_14513	CTAGTACAGTTCTTGATCAATAGTCTTC (서열번호 37)
RS2CL1544s_2285	AGTCGTACCGAAGATTTTGTAGTCG (서열번호 38)
RsSNP06056_1252	TGGTTATTAATTATTGAGCATACAATAGAC (서열번호 39)
COS0530_10656	CATAACTGTGGGAAGAAGATCGAGA (서열번호 40)
RSS2884_12650	GAACTCAAGATCTTAACTAAACAACCTT (서열번호 41)
RS2CL683s_6854	TCCATCTTCAGCAACAACCACG (서열번호 42)
RS2CL2646_8211	GTTGGTTCCGTACGTACGAGGTT (서열번호 43)
RSS1854_5572	AGAATAATTGAGAAAATCTTTTTCTCTAAACCT (서열번호 44)
RsSNP08808_10107	ATAAACCAAACTATAGAACAAAAATATTCACA (서열번호 45)
RSS3548_8083	TAATGAACATTGCGGTAAGTACATTTG (서열번호 46)
RsSNP14867_2430	CAAATTCAGGAAATGACCTTACTATAACC (서열번호 47)
COS0279_2650	AGAACAGCCGAACACTCCGGTT (서열번호 48)

SNP marker	Reverse primer (5' to 3')
RsHH025-1_13109	TTACAACCAGTACCGAGCCCTCTA (서열번호 49)
RS2CL3703s_516	CGGTCACCTCTTGAACCTTCCTTT (서열번호 50)
COS0566_179	CCGTAGGTTACAGTCTCTCCAGAAA (서열번호 51)
COS0151_283	AGGCATGTGGCCTCCTCCGTA (서열번호 52)
RsSNP07531_14513	GACGACGCCAATACATATCTAAGGTAAAT (서열번호 53)
RS2CL1544s_2285	CTTTCGGTACCGTCCCTGCTGTT (서열번호 54)
RsSNP06056_1252	GCTATGTCATGTTCCATGCATTTTCCATA (서열번호 55)
COS0530_10656	GGTCTGTTTAGTCTAAACCCTTTTGACTT (서열번호 56)
RSS2884_12650	GAGATTTGCTGATTAGGATCCATTGTGAA (서열번호 57)
RS2CL683s_6854	GAACATACAAGAGGACCACCGTGAT (서열번호 58)
RS2CL2646_8211	TACTCTGCCACAATGCTGAAATTTGCAAT (서열번호 59)
RSS1854_5572	ACTAAGATCTTCGAGTCTTTGGAGGAAT (서열번호 60)
RsSNP08808_10107	TGGACTGACTCTCATTCCACTCATAATTT (서열번호 61)
RSS3548_8083	CTACTTGATGCAAAATATCTACACCCGAA (서열번호 62)
RsSNP14867_2430	CCGAGATCTTGCTATACTCTGCCAA (서열번호 63)
COS0279_2650	GAAGAAACACTCGGTGTGAGTGGTA (서열번호 64)

2. 무 자원을 구분하기 위한 KASP 기반 SNP 분자표지 세트 개발

본 발명은 다양한 무 자원을 구분하기 위한 KASP 기반 SNP 분자표지 세트에 관한 것으로, 2013년에 보고된 R. raphanistrum 서열(Origin: USA, Accession: Moghe et al.(2014))을 기반으로, 무 핵심집단 자원 중 흑무인 Black radish 1종(CUR096), East Asian long radish 9종(CUR066, CUR068, CUR069, CUR071, CUR072, CUR074, CUR075, CUR076, CUR078), European small radish 12종(CUR079, CUR081, CUR082, CUR083, CUR084, CUR085, CUR086, CUR087, CUR088, CUR089, CUR091, CUR094), 쥐꼬리무인 Rat-tailed radish 1종(CUR003), Oli radish 2종(CUR006, CUR007), 야생자원인 Wild radish 9종(CUR099, CUR103, CUR105, CUR109, CUR111, CUR117, CUR121, CUR122, CUR124)에 대하여 KASP 기반 SNP 마커로 다형성 분석을 하였다. 이 중 상기 34개 무 핵심집단 자원을 구별할 수 있는 16개 KASP 기반 SNP 분자표지를 선별하였다.

본 발명의 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리 뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다.

본 발명의 SNP 마커 세트는 무에 적용되며, 종 또는 계통이 알려지지 않은 미지의 무 시료에 상기 SNP 마커를 적용하여, Black radish, Rat-tailed radish, Oli radish, East Asian long radish, European small radish, Wild radish인지 확인할 수 있어서 종자 단계에서부터 상기 무의 종 또는 계통을 구분할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

무의 9개의 염색체 중 5번 염색체를 제외한 8개 염색체에 존재하는 SNP 다형성 마커 16개를 선별하였다.

본 연구 결과를 통해 선발된 16개 SNP 마커 세트의 계통수 분석결과 coefficients 0.5에서 6개의 그룹으로 분류할 수 있으며 1번 그룹에는 쥐꼬리무 1종(CUR003), 2번 그룹에는 East Asian long radish 4종(CUR066, CUR072, CUR074, CUR075)과 European small radish 8종(CUR079, CUR081, CUR085, CUR084, CUR094, CUR082, CUR086, CUR091)이 포함되어 있으며, 3번 그룹에는 European small radish 4종(CUR083, CUR087, CUR088, CUR089), 4번 그룹에는 East Asian long radish 5종(CUR076, CUR068, CUR071, CUR069, CUR078)와 oil radish 2종(CUR006, CUR007), 그리고 흑무(black radish) 1종(CUR096)이 포함되어 있으며, 5번과 6번 그룹에는 야생무(wild radish) 9종이 포함된다(도 3).

본 마커세트로 다양한 무 핵심집단 34개 자원을 분석한 결과, 무의 다양한 자원 및 계통을 명확히 구분할 수 있었다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A set of SNP molecular markers for discriminating radish accessions using KASP assay and uses thereof <130> ADP-2019-0578 <150> KR 10-2019-0144662 <151> 2019-11-13 <160> 64 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 1 ctctactcgg gcaacttact tgctccttac aaccagtacc gagccctcta ytgctgccga 60 caaatacgac attccttatc tccaagacgt ttgccgcga 99 <210> 2 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 2 cagaaattta ggcttggaaa gcagccgcac aaggagtacg gagatcactc saaaggaagg 60 ttcaagaggt gaccgctctt cttttctaga tttattaag 99 <210> 3 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 3 ctccactaga tgaggtcaca ttccgtaggt tacagtctct ccagaaaaag ygtggatgct 60 gttcctcatg ttgccggtct gaacccacgc tctttccgt 99 <210> 4 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 4 aactcttctc taagccgtct tcccaagtca ggcatgtggc ctcctccgta waatcgcaac 60 tctcttgtgt ccttgctcta ttgctctttt caaagcttc 99 <210> 5 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 5 cgtagaggtc atggcctctt caactagtac agttcttgat caatagtctt statttacat 60 ttaccttaga tatgtattgg cgtcgtctca tattctaga 99 <210> 6 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 6 taagtaagaa cattgagata tgttgaagtc gtaccgaaga ttttgtagtc kgtcgacaac 60 agcagggacg gtaccgaaag gctgcatggg aagaaacaa 99 <210> 7 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 7 agcttattag ttatcatcat ttggttatta attattgagc atacaataga yttaacttta 60 tatatggaaa atgcatggaa catgacatag ctatggagc 99 <210> 8 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 8 tgaaggttac gccaagagct aaacgacata actgtgggaa gaagatcgag raagtcaaaa 60 gggtttagac taaacagacc aaggaagctg gttcttaag 99 <210> 9 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 9 acgagtttca gacagagatt tgctgattag gatccattgt gaaaaaaaca rgttgtttag 60 ttaagatctt gagttcactg gagaagtttc gtcttgaag 99 <210> 10 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 10 agagggatga cagggtactt cgtgaccttt ccatcttcag caacaaccac kgtctgcccc 60 ctgtgtaatc acggtggtcc tcttgtatgt tcctgtggc 99 <210> 11 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 11 gtggacattg cctttatagg attctacagt tggttccgta cgtacgaggt ktgcaaattt 60 cagcattgtg gcagagtatc ctaagttaat tgcttgggc 99 <210> 12 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 12 cacacaggtg atcggattgc cactaagatc ttcgagtctt tggaggaatg rtttagagaa 60 aaagattttc tcaattattc tagacaatgc cacaaaaaa 99 <210> 13 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 13 atttgaaact agtggaaata taaaccaaac tatagaacaa aaatattcac raattgtaaa 60 gatcaaatta tgagtggaat gagagtcagt ccatcgaat 99 <210> 14 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 14 aaaactgtat gatgttcact acttgatgca aaatatctac acccgaatct matgtactta 60 ccgcaatgtt cattaaattt tgggtgtcat ttcatatcg 99 <210> 15 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 15 tgtgcaggac agagtatcag cccccgagat cttgctatac tctgccaaaa rtatagtaag 60 gtcatttcct gaatttgtgc aatgttaatt tgttttttc 99 <210> 16 <211> 99 <212> DNA <213> Radish <400> 16 tggggagatg attggggcga tggagatgaa gaacagccga acactccggt kaccactcac 60 accgagtgtt tcttctagag gacttgctcc tagacgact 99 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsHH025-1_13109 Forward (FAM-labelled) primer <400> 17 gtcgtatttg tcggcagcaa gg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL3703s_516 Forward (FAM-labelled) primer <400> 18 caaggagtac ggagatcact cg 22 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0566_179 Forward (FAM-labelled) primer <400> 19 caacatgagg aacagcatcc actaa 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0151_283 Forward (FAM-labelled) primer <400> 20 aggacacaag agagttgcga ttctt 25 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP07531_14513 Forward (FAM-labelled) primer <400> 21 agtacagttc ttgatcaata gtcttg 26 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL1544s_2285 Forward (FAM-labelled) primer <400> 22 aagtcgtacc gaagattttg tagtct 26 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP06056_1252 Forward (FAM-labelled) primer <400> 23 atttggttat taattattga gcatacaata gat 33 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0530_10656 Forward (FAM-labelled) primer <400> 24 ataactgtgg gaagaagatc gagg 24 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS2884_12650 Forward (FAM-labelled) primer <400> 25 gaactcaaga tcttaactaa acaacctc 28 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL683s_6854 Forward (FAM-labelled) primer <400> 26 ttccatcttc agcaacaacc act 23 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL2646_8211 Forward (FAM-labelled) primer <400> 27 tggttccgta cgtacgaggt g 21 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS1854_5572 Forward (FAM-labelled) primer <400> 28 gaataattga gaaaatcttt ttctctaaac cc 32 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP08808_10107 Forward (FAM-labelled) primer <400> 29 ataaaccaaa ctatagaaca aaaatattca cg 32 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS3548_8083 Forward (FAM-labelled) primer <400> 30 aaaatttaat gaacattgcg gtaagtacat ttt 33 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP14867_2430 Forward (FAM-labelled) primer <400> 31 acaaattcag gaaatgacct tactataact 30 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0279_2650 Forward (FAM-labelled) primer <400> 32 gaacagccga acactccggt g 21 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsHH025-1_13109 Forward (HEX-labelled) primer <400> 33 aatgtcgtat ttgtcggcag caaga 25 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL3703s_516 Forward (HEX-labelled) primer <400> 34 caaggagtac ggagatcact cc 22 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0566_179 Forward (HEX-labelled) primer <400> 35 aacatgagga acagcatcca ctag 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0151_283 Forward (HEX-labelled) primer <400> 36 aggacacaag agagttgcga ttcta 25 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP07531_14513 Forward (HEX-labelled) primer <400> 37 ctagtacagt tcttgatcaa tagtcttc 28 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL1544s_2285 Forward (HEX-labelled) primer <400> 38 agtcgtaccg aagattttgt agtcg 25 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP06056_1252 Forward (HEX-labelled) primer <400> 39 tggttattaa ttattgagca tacaatagac 30 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0530_10656 Forward (HEX-labelled) primer <400> 40 cataactgtg ggaagaagat cgaga 25 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS2884_12650 Forward (HEX-labelled) primer <400> 41 gaactcaaga tcttaactaa acaacctt 28 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL683s_6854 Forward (HEX-labelled) primer <400> 42 tccatcttca gcaacaacca cg 22 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL2646_8211 Forward (HEX-labelled) primer <400> 43 gttggttccg tacgtacgag gtt 23 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS1854_5572 Forward (HEX-labelled) primer <400> 44 agaataattg agaaaatctt tttctctaaa cct 33 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP08808_10107 Forward (HEX-labelled) primer <400> 45 ataaaccaaa ctatagaaca aaaatattca ca 32 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS3548_8083 Forward (HEX-labelled) primer <400> 46 taatgaacat tgcggtaagt acatttg 27 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP14867_2430 Forward (HEX-labelled) primer <400> 47 caaattcagg aaatgacctt actataacc 29 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0279_2650 Forward (HEX-labelled) primer <400> 48 agaacagccg aacactccgg tt 22 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsHH025-1_13109 Reverse primer <400> 49 ttacaaccag taccgagccc tcta 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL3703s_516 Reverse primer <400> 50 cggtcacctc ttgaaccttc cttt 24 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0566_179 Reverse primer <400> 51 ccgtaggtta cagtctctcc agaaa 25 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0151_283 Reverse primer <400> 52 aggcatgtgg cctcctccgt a 21 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP07531_14513 Reverse primer <400> 53 gacgacgcca atacatatct aaggtaaat 29 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL1544s_2285 Reverse primer <400> 54 ctttcggtac cgtccctgct gtt 23 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP06056_1252 Reverse primer <400> 55 gctatgtcat gttccatgca ttttccata 29 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0530_10656 Reverse primer <400> 56 ggtctgttta gtctaaaccc ttttgactt 29 <210> 57 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS2884_12650 Reverse primer <400> 57 gagatttgct gattaggatc cattgtgaa 29 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL683s_6854 Reverse primer <400> 58 gaacatacaa gaggaccacc gtgat 25 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RS2CL2646_8211 Reverse primer <400> 59 tactctgcca caatgctgaa atttgcaat 29 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS1854_5572 Reverse primer <400> 60 actaagatct tcgagtcttt ggaggaat 28 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP08808_10107 Reverse primer <400> 61 tggactgact ctcattccac tcataattt 29 <210> 62 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSS3548_8083 Reverse primer <400> 62 ctacttgatg caaaatatct acacccgaa 29 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsSNP14867_2430 Reverse primer <400> 63 ccgagatctt gctatactct gccaa 25 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COS0279_2650 Reverse primer <400> 64 gaagaaacac tcggtgtgag tggta 25

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-99개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 야생무(wild radish), 쥐꼬리무(rat-tailed radish), 흑무(black radish), 동아시아 긴 무(East Asian long radish), 유럽 작은 무(European small radish) 또는 기름 무(oil radish)의 무 품종 판별용 SNP 마커 세트 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 SNP 마커 세트 조성물은 경쟁적 대립 유전자 특이적 PCR(Kompetitive Allele Specific PCR; KASP) 분석에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 무 품종 판별용 SNP 마커 세트 조성물.
서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-99개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는, 야생무(wild radish), 쥐꼬리무(rat-tailed radish), 흑무(black radish), 동아시아 긴 무(East Asian long radish), 유럽 작은 무(European small radish) 또는 기름 무(oil radish)의 무 품종 판별용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 17, 서열번호 33 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 18, 서열번호 34 및 서열번호 50으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19, 서열번호 35 및 서열번호 51로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 20, 서열번호 36 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21, 서열번호 37 및 서열번호 53으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 22, 서열번호 38 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23, 서열번호 39 및 서열번호 55로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 24, 서열번호 40 및 서열번호 56으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25, 서열번호 41 및 서열번호 57로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 26, 서열번호 42 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 27, 서열번호 43 및 서열번호 59로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 28, 서열번호 44 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 29, 서열번호 45 및 서열번호 61로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 30, 서열번호 46 및 서열번호 62로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 31, 서열번호 47 및 서열번호 63으로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 32, 서열번호 48 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 무 품종 판별용 조성물.
삭제
제4항에 있어서, 상기 조성물은 경쟁적 대립 유전자 특이적 PCR(Kompetitive Allele Specific PCR; KASP) 분석에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 무 품종 판별용 조성물.
제4항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는, 야생무(wild radish), 쥐꼬리무(rat-tailed radish), 흑무(black radish), 동아시아 긴 무(East Asian long radish), 유럽 작은 무(European small radish) 또는 기름 무(oil radish)의 무 품종 판별용 키트.
(1) 무에서 DNA를 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
(3) 상기 확인된 유전자형으로 무 품종을 판별하는 단계를 포함하는, 야생무(wild radish), 쥐꼬리무(rat-tailed radish), 흑무(black radish), 동아시아 긴 무(East Asian long radish), 유럽 작은 무(European small radish) 또는 기름 무(oil radish)의 무 품종 판별 방법.
제9항에 있어서, 상기 (2) 단계의 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 51번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계는 서열번호 17, 서열번호 33 및 서열번호 49로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 18, 서열번호 34 및 서열번호 50으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 19, 서열번호 35 및 서열번호 51로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 20, 서열번호 36 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 21, 서열번호 37 및 서열번호 53으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 22, 서열번호 38 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 23, 서열번호 39 및 서열번호 55로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 24, 서열번호 40 및 서열번호 56으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 25, 서열번호 41 및 서열번호 57로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 26, 서열번호 42 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 27, 서열번호 43 및 서열번호 59로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 28, 서열번호 44 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 29, 서열번호 45 및 서열번호 61로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 30, 서열번호 46 및 서열번호 62로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 31, 서열번호 47 및 서열번호 63으로 표시되는 프라이머 세트 및; 서열번호 32, 서열번호 48 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고, 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계인 것을 특징으로 하는 무 품종 판별 방법.
제10항에 있어서, 상기 PCR 증폭 산물 분석은 경쟁적 대립 유전자 특이적 PCR(Kompetitive Allele Specific PCR; KASP) 분석인 것을 특징으로 하는 무 품종 판별 방법.
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