KR101771967B1 - 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법 - Google Patents

인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응을 이용한 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게, 본원 발명의 프라이머는 시료에 함유된 인삼뿌리썩음병원균의 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 증폭시키기 때문에 종래 인삼에서 발견된다고 보고된 병원균들에 대하여 특이적으로 인삼뿌리썩음병원균을 검출할 수 있다.

Description

인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법{Primers for diagnosis of Cylindrocarpon destructans in Panax ginseng and uses thereof}
본 발명은 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans) 검출용 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병원균의 식별 및 정량 분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 시료에 함유된 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 PCR하여 인삼뿌리썩음병원균만을 효과적으로 검출 및 정량분석 할 수 있는 프라이머이다. 이를 포함하는 키트는 종래 인삼에서 발병한다고 보고된 병원균들은 검출하지 않아 인삼뿌리썩음병원균 검출에 적합한 식별방법을 제공한다.
인삼(Panax ginseng)은 다년생의 반음지성 숙근초(宿根草)로 오가피과에 속하며 생육적온은 20℃전후로 주로 북반구의 극동지방에 자생하거나 재배되며 우리나라의 주산지는 경기 북부지역과 풍산 및 금산 지방이다. 인삼의 주 약리성분은 사포닌으로서 자양강장, 면역증강, 피로회복, 중추신경계 조절, 항스트레스, 항당뇨, 항종양활성 등의 우수한 효능이 밝혀짐에 따라 그 소비가 증가추세에 있으며 특히 고려인삼의 우수함이 밝혀짐에 따라 그 소비 또한 꾸준히 늘어날 것으로 전망된다.
그러나, 인삼의 이러한 뛰어난 효능과 소비 욕구에도 불구하고 인삼은 다년생의 반 음지성 숙근초로서 반음지성식물이기 때문에 빛이 가장 중요한 생육제한요소이며, 높은 온도에서 생육이 저해되는 저온성 식물로서, 고온 및 고광도에 약한 식물이다. 또한 인삼은 상기 생육제한 요소 이외에 내병성이 약하고 효과적인 방제법이 적어 재배하기 어려운 식물로 평가되었다.
또한, 인삼의 식물체는 땅 밑에 뿌리와 뇌두(腦頭), 땅 위에는 줄기, 잎, 꽃(열매)으로 이루어져 있으며, 다년생이므로 매년 봄이 되면 땅속의 뿌리에서 새싹이 나오고 줄기는 매년 가을이 되면 고사한다. 인삼은 4 ~ 6년 동안 동일 포장에서 장기간 재배를 하여야 하고, 인삼을 수확한 후 다른 작물을 재배하지 않고 1 ~ 2년간 경작 예정지 관리 후 다시 인삼을 경작하는 연작방식 때문에 각종 병해에 의한 피해가 매우 크고 연작장해의 발생 가능성이 높은 식물이다.
인삼에서 연작장해를 일으키는 뿌리썩음병의 주요 병원균으로는 실린드로카폰데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움솔라니(Fusariumsolani), 라이조토니아솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스시네레아(Botryis cinerea), 파이토프소라캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움(Pythium sp.), 알타나리아파낙스(Alternaria panax)등 7종이 보고되어있으며, 이런 병원균들이 단독으로 또는 복합적으로 작용하기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있다.
최근 농업기술원 연구결과에 따르면 4년근 이상 인삼의 결주 원인은 지역과 병해 종류 및 발생 정도의 차이는 있지만 뿌리썩음병 35%, 잿빛곰팡이병 32%, 점무늬병 등이 15%를 차지하고 있다. 특히 인삼뿌리썩음병원균(C. destructans)은 토양에서 월동하면서 뿌리에 직접 병을 일으키기 때문에 인삼 식재 후 방제가 어렵고, 병에 의한 결주율 피해가 초작지 4년근 21.8%, 6년근 50%이상이며, 재작지 4년근에는 30 ~ 80%에 이르는 등 인삼생산에 있어 최대의 적으로 평가되고 있다.
인삼뿌리썩음병의 초기 증상은 잎가장자리가 붉게 변하거나 잎이 안쪽으로 오므라드는 증상을 보이다가 고사하며, 이와 같은 증상을 나타내는 뿌리는 끝 또는 중간 부분에 적갈색 또는 흑갈색 병반을 형성하며 변색되어 부패한다. 또한 인삼뿌리썩음병은 묘삼에서부터 6년생까지 모든 연생에서 발생하며 고년생으로 갈수록 발생이 많아지는 등, 국내 인삼 재배 농가에서 가장 큰 문제로 손꼽히고 있다.
국내 인삼뿌리썩음병의 주된 원인균인 뿌리썩음병원균은 실린드로카폰 데스트럭탄스로서, 연작 장해의 전형적인 흑색의 병반조직으로부터 분리되고 병원성이 확인된 이래로, 균의 생리적 특성과 배양에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그 중 한국 공개특허 10-2013-0098792(공개일자: 2013년09월05일)에는 인삼에 병을 유발하는 토양 병원성 곰팡이 4종을 진단할 수 있는 종(species) 및 속(genus) 특이 프라이머를 기재하고 있다. 그러나, 인삼뿌리썩음병원균 이외에 다른 병원균도 함께 검출되어 인삼뿌리썩음병원균 특이적인 프라이머가 아님을 확인할 수 있었다.
마이크로새틀라이트(Microsatellite) 마커가 식물의 유전 육종이나 질병 및 분자생물학적 연구에 매우 유용한 것으로도 확인되면서 일부 국가에서는 자국의 주요 농작물에 대한 마이크로새틀라이트 연구가 상당히 진행되어 있는바, 우리나라도 이에 대응하기 위한 지속적 연구와 투자가 필요한 시점이다.
그러나, 아직 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머로서 마이크로새틀라이트를 사용한 연구는 아직 미비한 상황이다.
이에 본 발명자들은 시료에 함유된 인삼뿌리썩음병원균만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인삼뿌리썩음병원균을 검출 및 정량분석하기 위한 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인삼뿌리썩음병원균을 검출 및 정량분석 하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인삼뿌리썩음병원균을 검출 및 정량분석 하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans) 동정용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법를 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 시료는 인삼(Panax ginseng)시료일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, PCR 산물 분석은 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석(fragment analysis)를 수행하는 것 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머는 시료 DNA에 포함된 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 증폭하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 나타나는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 인삼뿌리썩음병원균이 가지는 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 증폭시키는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 및 증폭용 시약을 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출 또는 정량분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증폭용 시약은 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명의 "마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA"는 2 내지 6개 정도의 염기서열이 반복되는 DNA군(repetitive DNA group)으로 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열(non-coding DNA sequence)을 의미한다. 마이크로새틀라이트 DNA는 특정 좌위에서 반복단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성이 인정되는데, 반복수에 품종간 다형이 있는 경우에 인접영역에 설계한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응과 같은 유전자증폭 반응을 행하면, 증폭반응 산물 길이에 다형이 관찰되고, DNA 다형을 검출하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명의 "프라이머"는 복제하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야한다. 상기 프라이머의 바람직한 길이는 5 ~ 50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명의 "실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)”은 목표 DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시 실시하는 방법으로, DNA샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위하여, 실시간 중합효소연쇄반응은 검출과 양의 측정을 할 수 있는 방법이다. 계량은 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 셀 수 있다.
나아가, 본 발명의 "미세표식자(microsatellite)"는 단순 서열 반복체(SSR; simple sequence repeats)로도 불리며, 게놈 내 DNA 염기서열 중 2 ~ 5개의 염기가 특징적으로 반복되는 부위로, 반복 정도에 따라 다양한 대립유전자가 존재하며, 멘델의 유전법칙에 따라 부모에서 자손으로 유전되므로 염색체지도 작성의 표지로 이용되거나, 집단 및 개체의 유전적 특성을 규정짓거나, 친자확인 등의 유전자형 분석에 많이 이용된다. 이들 미세표식자 특정부위는 이를 포함하는 위, 아래쪽 염기서열의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR) 혹은 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 통해 증폭 혹은 정량분석이 가능하다.
따라서 본 발명은 중합효소연쇄반응을 이용한 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법에 관한 것이다. 본원 발명의 프라이머는 종래 인삼에서 발견된다고 보고된 병원균은 검출하지 않으나, 인삼뿌리썩음병원균에 대해서는 특이적으로 검출 가능하며, 높은 민감도로 작용하여 효과적이다.
도 1은 실시예 3에서 본 발명의 프라이머를 사용하여 인삼뿌리썩음병원균(C. destructans)의 표준균주들을 검출한 결과이다.
도 2는 실시예 3에서 본 발명의 프라이머를 사용하여 인삼뿌리썩음병원균 및 다양한 병원균을 검출한 결과이다.
도 3은 비교예 1 내지 4의 종래 공지된 프라이머를 사용하여 인삼뿌리썩음병원균의 표준균주들을 검출한 결과이다.
도 4는 비교예 1 내지 4의 종래 공지된 프라이머를 사용하여 인삼뿌리썩음병원균 및 다양한 병원균을 검출한 결과이다.
도 5는 서열번호 1 및 2로 나타나는 프라이머 세트를 이용하여 인삼뿌리썩음병원균의 밀도를 검정하기 위한 검량선이다.
도 6은 서열번호 1 및 2로 나타나는 프라이머 세트를 이용하여 인삼뿌리썩음병원균만이 특이적으로 Real-time PCR 증폭된 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 인삼 재배 농가에 많은 피해를 유발하는 인삼뿌리썩음병원균(C. destructans)을 효과적으로 검출할 수 있는 프라이머가 없는 문제점이 있으며, 마이크로새틀라이트를 이용한 인삼뿌리썩음병원균 검출 프라이머 개발이 미비한 실정이다. 따라서, 마이크로새틀라이트를 이용하여 효과적으로 인삼뿌리썩음병원균을 검출할 수 있는 프라이머 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명은 인삼뿌리썩음병원균에 함유된 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 증폭시키고, 서열번호 1 및 2를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.
이를 통해 종래 인삼에서 발병한다고 보고된 인삼뿌리썩음병원균 이외의 병원균들과 동일 속(屬)인 Cylindrocarpon album, Cylindrocarpon obtusisporum에서도 PCR 증폭이 되지 않아 인삼뿌리썩음병원균만을 효과적으로 검출할 수 있는 프라이머를 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1 및 2 로 구성되는 인삼뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans) 동정용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균의 식별방법을 제공한다.
먼저, 시료로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득한다.
상기 시료는 통상적으로 인삼뿌리썩음병원균의 포함 여부의 식별이 필요한 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 바람직하게는 인삼(Panax ginseng)시료일 수 있다.
상기 DNA 분리는 통상적으로 시료에서 제노믹 DNA(Genomic DNA, gDNA)를 분리하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 퀴아젠(Qiagen)사의 DNeasy mini kit를 이용할 수 있다.
다음, 상기 시료 DNA와 서열번호 1 내지 2를 함유하는 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 혹은 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득한다.
상기 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균 gDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 시료 DNA에 포함된 마이크로새틀라이트 DNA는 인삼뿌리썩음병원균에 특이적으로 존재하는 마이크로새틀라이트를 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.
다음으로, 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별한다.
PCR 산물 분석은 통상적으로 PCR 산물을 분석하는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 단편 분석(fragment analysis)를 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석(fragment analysis)를 수행할 수 있다.
상기 PCR 산물의 크기 분석은 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 크기를 분석하여 수행하는 분석방법을 의미하는 것으로, 바람직하게는 PCR 산물의 크기가 384 염기쌍(베이스페어; base pair; bp)일 경우, 시료는 인삼뿌리썩음병원균을 포함하는 것으로 식별할 수 있다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)은 위 프라이머로 클로닝된 standard와 melt curve를 비교하여 정량분석(도 5) 및 식별(도 6)이 가능하다.
더불어, 본 발명은 인삼뿌리썩음병원균에 함유된 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭시키고, 서열번호 1 내지 2를 포함하는 미세표식자를 이용한 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머를 제공한다.
상기 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것이라면 특별히 제한하지 않으며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 시료의 인삼뿌리썩음병원균 포함 여부를 식별할 수 있는 효과를 가지며, 상기 식별은 인삼뿌리썩음병원균에 포함되어 있는 마이크로새틀라이트 DNA를 검출하여 수행하는 것일 수 있다.
상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybridcomplex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것을 사용할 수 있다.
상기 주형의 서열은 통상적인 인삼뿌리썩음병원균에 함유된 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 서열번호 3을 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명은 상술한 바와 같은 인삼뿌리썩음병원균 검출용 프라이머 및 증폭용 시약을 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 검출 및 정량분석용 키트를 제공한다.
상기 증폭용 시약은 통상적으로 식물 균주 동정용 키트에 포함되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
프라이머 제작
인삼뿌리썩음병원균(C. destructans)의 게놈분석은 지금까지 수행되지 않아서, 먼저 인삼뿌리썩음병원균 표준균주(KACC41077)의 게놈을 Hybrid sequencing(Roche 454와 Illumina Hiseq)을 사용해 분석하여 약 64 Mb의 유전정보를 획득하였다. 이 유전정보를 SciRoKoCo 프로그램을 사용하여 5,619개의 미세표식자부위가 존재하고 있음을 확인했고, 이 중 모티프의 반복 서열이 높은 40개의 미세표식자부위를 선발하였다. 40개의 미세표식자 부위 중 가장 특이적으로 인삼뿌리썩음병원균을 동정할 수 있는 미세표식자 부위를 선발하였다. 선발한 미세표식자부위(Ccms_cotig_4480)를 Primer3 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용해 PCR 산물이 약 400 bp에서 생성되도록 프라이머쌍을(Ccms57-1) 제작하였다. 인삼뿌리썩음병원균의 마이크로새틀라이트 DNA 정보인 Ccms_cotig_4480 중 하기 표 1의 프라이머쌍이 증폭하는 마이크로새틀라이트 DNA(서열번호 3)와 제작한 프라이머쌍은 하기 표 1에 기재하였다.
염기서열 위치 녹는점(℃) 서열번호
Ccms57-1 정방향(F) AAGCCCACAGGATTGATG contig 4480: 2766-2783 62 1
역방향(R) GACTACTTGACTCCGTGATT contig 4480: 3130-3149 2
Ccms_
cotig_
4480		 CCAGGTCCTAGCTCTGCAAGAAAGTCCCCGTGGGCTGTGATCCAGCTGCGGCGACTCTGGAGCGCTTCCGGTTAAGATGTGACTCGAGGACGAAGCGTCGGCTTTTCCAGACGATACTTGGAAGGTCAGGGATACTCGGGAAGCCCACAGGATTGATGGCAACAGCTGCTTCGACCTGCTTGATAAAGCTGAAGGACTCGGGACGTAGAAGAGTGAAGGCATCGGCGACAGGACCTCGTTAATCGGCTTTGGGGTCGGACATCGTAAAGGGGAGCGGTCGAGGGTTGGGAATAGCTTCATCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCCCTTCAGAAGCCGTCAGCAGAATTAGAGATTTCATGTTCCTACTGGATCCCCCTAGCAGGGGCCTGCGGCCGTTACCTGGCCAAGGGATCCGGGCCAGGATCTATAGGCAGGGGTCATTACTGGGCTCTCAGCCCCCCCAATTGAGGCTTGTATCAAGGTTGAAAATCACGGAGTCAAGTAGTCCGGACCCGGAATAACATATATTCCGGGTTGTGAAGGCATTCAGATATCTGCAGTCAAGGAATGACTAGATCTGATCTGACTGATCTGAAAGATTCGTCGATCTGATTTGTTTGACT - - 3
시료 병원균 준비 및 gDNA 추출
본 발명에서 사용한 인삼뿌리썩음병원균 11종의 상세정보를 하기 표 2에 기재하였다. 또한, 인삼뿌리썩음병원균 이외에 종래 인삼에서 발견되어 보고된 병원균들 중 본 발명의 비교예로 사용한 병원균의 상세정보는 하기 표 3에 기재하였다.
Line Name 비고
1 40395 한국농업미생물자원센터 KACC40395 (Cylindrocarpon destructans)
2 41077 한국농업미생물자원센터 KACC41077 (Cylindrocarpon destructans)
3 44656 한국농업미생물자원센터 KACC44656 (Cylindrocarpon destructans)
4 44657 한국농업미생물자원센터 KACC44657 (Cylindrocarpon destructans)
5 44658 한국농업미생물자원센터 KACC44658 (Cylindrocarpon destructans)
6 44659 한국농업미생물자원센터 KACC44659 (Cylindrocarpon destructans)
7 44660 한국농업미생물자원센터 KACC44660 (Cylindrocarpon destructans)
8 44661 한국농업미생물자원센터 KACC44661 (Cylindrocarpon destructans)
9 44662 한국농업미생물자원센터 KACC44662 (Cylindrocarpon destructans)
10 44663 한국농업미생물자원센터 KACC44663 (Cylindrocarpon destructans)
11 44665 한국농업미생물자원센터 KACC44665 (Cylindrocarpon destructans)
Line Name 비고
1 40395 한국농업미생물자원센터 KACC40395 (Cylindrocarpon destructans)
2 41077 한국농업미생물자원센터 KACC41077 (Cylindrocarpon destructans)
3 12yeon02-02 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Cylindrocarpon album으로 확인된 균주)
4 12yeon02-04 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Cylindrocarpon obtusisporum으로 확인된 균주)
5 13paj01-R10 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Alternaria panax로 확인된 균주)
6 GA 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Alternaria panax로 확인된 균주)
7 13eum05-18 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Alternaria populi로 확인된 균주)
8 13eum05-28 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Alternaria populi로 확인된 균주)
9 12yeon04-09 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Botrytis cinerea로 확인된 균주)
10 13eum04-02 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Botrytis cinerea로 확인된 균주)
11 GCT 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Collectricum gloeosporioides로 확인된 균주)
12 13chu01-15 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Fusarium oxysporum으로 확인된 균주)
13 12eum07-29 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Fusarium oxysporum으로 확인된 균주)
14 12sun01-07 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Fusarium sonani로 확인된 균주)
15 12eum01-10 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Fusarium sonani로 확인된 균주)
16 13eum03-03 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Plectosphaerella cucumerina로 확인된 균주)
17 13chu01-11 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Plectosphaerella cucumerina로 확인된 균주)
18 12goe04-05 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Trichoderma asperellum으로 확인된 균주)
19 13eum03-05 실험실에서 분리된 균주
(염기서열분석결과 Trichoderma asperellum으로 확인된 균주)
상술한 바와 같은 균주들을 CM 액체배지(1ℓ 당 NaNO3 2 g, Bacto-peptone 2.5 g, Bacto-yeast extract 1.0 g, sucrose 30.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO42O 0.5 g, KCl 0.5 g, trace element solution 0.2 ㎖ 및 vitamin stock solution 10.0 ㎖를 포함)에 접종하여 25℃ 항온기에서 7일간 현탁배양하였다. 배양된 균사들을 동결건조한 후 마쇄하고 CTAB 추출용액(cetyltrimethylammonium bromide buffer, 2% CTAB, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0 및 1.4 M NaCl를 포함)을 이용해 genomic DNA(gDNA)를 추출하였다. 추출된 gDNA는 20 ng/㎕ 농도로 맞추어 PCR 증폭에 이용하였다.
PCR에 의한 마이크로새틀라이트 DNA의 증폭
상기 표 1의 서열번호 1의 프라이머(10 pmol) 0.5 ㎕, 서열번호 2의 프라이머(10 pmol) 0.5 ㎕, 실시예 2에서 추출한 gDNA(20 ng/㎕) 1㎕, dNTP(10 mM) 0.4 ㎕, 10X Tag 완충액 2 ㎕, Inclone™ taq(5 units/㎕) 0.2 ㎕ 및 멸균수 15.4 ㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 이후 상기 혼합액 20 ㎕를 PCR 반응에 사용하였다.
구체적으로, PCR 반응은 혼합액 20 ㎕를 94℃에서 5분 동안 최초변성(predenaturation)시킨 다음 94℃에서 20초 변성(denature), 62℃에서 20초 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 확장(extension)하는 싸이클을 1 싸이클로 하여 35 싸이클을 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 최종 확장(final elongation) 하였다.
이후 상기 PCR반응에서 수득한 PCR 산물은 1.2% 아가로스(agarose) 겔에 전기영동하여 확인하였다. 전기영동 결과는 도면 1 내지 2에 나타냈다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머로 분양받은 인삼뿌리썩음병의 표준 균주들을 증폭한 결과, 전부 증폭 산물을 확인할 수 있었다.
도 2에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머로 인삼에서 보고된 다양한 병원균을 증폭한 결과, 본 발명의 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균을 제외한 다른 병원균들과 동일 속(屬)인 Cylindrocarpon album, Cylindrocarpon obtusisporum에서도 증폭 산물이 확인되지 않았다.
이로 인해, 본 발명의 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균을 효과적으로 동정하는데 적합한 것을 알 수 있었다.
실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 인삼뿌리썩음병원균 검출 및 정량분석
상기 표 1의 서열번호 1의 프라이머(10 pmol) 1 ㎕, 서열번호 2의 프라이머(10 pmol) 1 ㎕, 실시예 2에서 추출한 gDNA(1 pg/㎕ 이하) 2㎕, 멸균수 6 ㎕, SsoadvancedTMuniversalsybr® green supermix 10 ㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 이후 상기 혼합액 20 ㎕를 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)에 사용하였다.
구체적으로, PCR 반응은 혼합액 20 ㎕를 98℃에서 3분 동안 최초변성(predenaturation)시킨 다음 95℃에서 10초 변성(denature), 61℃에서 15초 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 확장(extension)하는 싸이클을 1 싸이클로 하여 40 싸이클을 반복한 후, melt curve를 작성하기 위한 과정을 진행하였다(도 5 참조).
이후 상기 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR) 반응에서 수득한 결과는 제공되는 프로그램을 사용하여 프라이머의 dimer 형성(melt curve), 증폭된 유전부위 copy 수(SQ, starting quantity) 등을 확인하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)결과는 표 5에 나타냈다.
[비교예 1]
종래 ITS1-ITS4 primer(Waite et al., 1990)로 알려진 서열번호 4 내지 5의 프라이머(표 4 참조)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리했다. 이후 94℃에서 20초 변성, 55℃에서 1분 결합, 72℃에서 1분간 확장하는 1싸이클을 35 싸이클 반복하여 PCR 반응을 수행하였고, 전기영동 결과는 도면 3 내지 4에 나타냈다.
[비교예 2]
비교예1에서 실시한 ITS1-ITS 4 프라이머를 이용하여 1차 PCR 반응을 실시한 후, Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 키트를 사용하여 그 PCR 산물을 정제하였다. 이후 정제한 1차 PCR 산물을 주형 DNA로 하고 종래 Dest1-Dest4 primer(Hamelin et al.,1996)로 알려진 서열번호 6 내지 7의 프라이머(표 4에 기재)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리한 후 95℃에서 35초 변성, 55℃에서 1분 결합, 72℃에서 2분간 확장하는 1싸이클을 30싸이클 반복하여 Nested PCR 반응을 수행하였다. 전기영동 결과는 도면 3 내지 4에 나타냈다.
[비교예 3]
비교예 1에서 실시한 ITS1-ITS 4 프라이머를 이용하여 1차 PCR 반응을 실시한 후, Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) 키트를 사용하여 그 PCR 산물을 정제하였다. 상기 정제된 1차 PCR 산물을 주형 DNA로 하고 종래 Destruc2F-Destruc2R primer로 알려진 서열번호 8 내지 9의 프라이머(표 4에 기재)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리했다. 이후 94℃에서 20초 변성, 65℃에서 30초 결합, 72℃에서 30초간 확장하는 1싸이클을 35싸이클 반복하여 Nested PCR 반응을 수행하였다. 전기영동 결과는 도면 3 내지 4에 나타냈다.
[비교예 4]
종래 CylF01-CylR625 primer로 알려진 서열번호 10 내지 11의 프라이머(표 4에 기재)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리하였고, 94℃에서 5초 변성, 54℃에서 5초 결합, 72℃에서 10초간 확장하는 1싸이클을 35싸이클 반복하는 PCR 반응을 수행하였다. 전기영동 결과는 도면 3 내지 4에 나타냈다.
[비교예 5]
종래 CylF146-CylR625 primer로 알려진 서열번호 12 내지 11의 프라이머(표 4에 기재)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리했으며, 94℃에서 5초 변성, 54℃에서 5초 결합, 72℃에서 10초 확장하는 1싸이클을 35 싸이클 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. 전기영동 결과는 도면 3 내지 4에 나타냈다.
[비교예 6]
종래 CylF146-CylR407 primer로 알려진 서열번호 12 내지 13의 프라이머(표 4에 기재)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 양으로 PCR 혼합액을 처리했다. 94℃에서 5초 변성, 54℃에서 5초 결합, 72℃에서 10초 확장하는 1싸이클을 35 싸이클을 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. 전기영동 결과는 도면 3 내지 4에 나타냈다.
프라이머명 염기서열 서열번호
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 4
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 5
Dest1 TTGTTGCCTCGGCGGTGCCTG 6
Dest4 GGTTTAACGGCGTGGCCGCGCTGTT 7
Destruc2F GTGCCTGYTTCGGCAGC 8
Destruc2R CTGTTTYCCAGTGCGAGGTGTGC 9
CylF01 CATGCGTGAGATTGTAAGTT 10
CylR625 TGACCCTTGGCCCAGTTGTT 11
CylF146 ACGACGTGATTTTGGGACAA 12
CylR407 TCGTTGAAGTAGACGCTCAT 13
도 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 표 4의 비교예 1 내지 6의 종래 프라이머들로 분양받은 인삼뿌리썩음병의 표준 균주들을 증폭한 결과, 모든 표준 균주들에서 증폭 산물을 확인할 수 있었다.
도 4에서 확인되는 바와 같이, 상기 표 4의 비교예 1 내지 6의 종래 프라이머들로 인삼에서 보고된 다양한 병원균을 증폭한 결과, 종래 프라이머들은 인삼뿌리썩음병원균을 제외한 다른 병원균에서도 증폭 산물이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 비교예 1의 프라이머는 인삼에서 발견된다고 공지된 병원균 모두에서 증폭 산물이 확인되었으며, 비교예 2 내지 4의 프라이머들도 인삼뿌리썩음병원균 이외의 병원균에서도 증폭 산물이 확인되었다. 특히 비교예 2 및 3의 프라이머들의 경우, PCR 반응을 2번 실시해야 하는 번거로움이 있다.
또한 비교예 5 내지 6의 프라이머들은 비록 다른 식물 병원균에서는 증폭 산물이 확인되지 않았으나, 인삼뿌리썩음병원균(C.destructans)의 동일 속(屬)인Cylindrocarpon album, Cylindrocarpon obtusisporum에서 증폭산물이 확인되었다.
이로 인해, 종래 프라이머들은 인삼뿌리썩음병원균 이외에 다른 병원균들과 동일 속(屬)에서도 증폭 산물이 검출되어 인삼뿌리썩음병원균을 효과적으로 동정하는데 적합하지 않은 것을 알 수 있었다.
C. destructans gDNA
(/㎕)		 1 ng 100 pg 10 pg 1 pg 100 fg 10 fg 1 fg
SQ
(starting quantity)		 6.9E+04 1.3E+04 5.0E+03 4.5E+03 6.2E+02 nd* nd
C. destructans
+
17 other fungi		 gDNA
(/㎕)		 1 ng 100 pg 10 pg 1 pg 100 fg 10 fg 1 fg
SQ
(starting quantity)		 5.8E+03 2.5E+03 7.6E+02 3.8E+02 2.6E+02 nd nd
* nd : not detected
추가로 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 이용한 정량분석결과 약 100 fg/㎕ 내외의 적은 양의 DNA도 검출이 가능한 것으로 확인되었으며, 이는 다른 곰팡이의 DNA와 혼합하여 실시했을 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 실시간 중합효소연쇄반응결과 다른 종류의 DNA가 섞여 있어도 인삼뿌리썩음병원균 gDNA만을 단독으로 실시 경우와 SQ(starting quantity, 증폭된 copy 수) 값이 유사했으며, 이를 토대로 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량분석(밀도)이 가능하다(표5).
실시예 및 비교예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 이를 이용한 품종 식별방법은 시료에 함유된 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭시켜 인삼뿌리썩음병원균만을 효과적으로 검출할 수 있는 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 포함하여 종래 인삼에서 발병한다고 보고된 병원균들은 검출하지 않아 인삼뿌리썩음병원균 검출 및 정량 분석에 적합한 식별방법을 제공하는 것을 확인할 수 있었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primers for diagnosis of Cylindrocarpon destructans in Panax ginseng and uses thereof <130> 1042463 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms57-1 forward primer <400> 1 aagcccacag gattgatg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms57-1 reverse primer <400> 2 gactacttga ctccgtgatt 20 <210> 3 <211> 640 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms_cotig_4480 <400> 3 ccaggtccta gctctgcaag aaagtccccg tgggctgtga tccagctgcg gcgactctgg 60 agcgcttccg gttaagatgt gactcgagga cgaagcgtcg gcttttccag acgatacttg 120 gaaggtcagg gatactcggg aagcccacag gattgatggc aacagctgct tcgacctgct 180 tgataaagct gaaggactcg ggacgtagaa gagtgaaggc atcggcgaca ggacctcgtt 240 aatcggcttt ggggtcggac atcgtaaagg ggagcggtcg agggttggga atagcttcat 300 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc ccttcagaag ccgtcagcag 360 aattagagat ttcatgttcc tactggatcc ccctagcagg ggcctgcggc cgttacctgg 420 ccaagggatc cgggccagga tctataggca ggggtcatta ctgggctctc agccccccca 480 attgaggctt gtatcaaggt tgaaaatcac ggagtcaagt agtccggacc cggaataaca 540 tatattccgg gttgtgaagg cattcagata tctgcagtca aggaatgact agatctgatc 600 tgactgatct gaaagattcg tcgatctgat ttgtttgact 640 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 <400> 4 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 5 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest1 <400> 6 ttgttgcctc ggcggtgcct g 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest4 <400> 7 ggtttaacgg cgtggccgcg ctgtt 25 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Destruc2F <400> 8 gtgcctgytt cggcagc 17 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Destruc2R <400> 9 ctgtttycca gtgcgaggtg tgc 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylF01 <400> 10 catgcgtgag attgtaagtt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylR625 <400> 11 tgacccttgg cccagttgtt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylF146 <400> 12 acgacgtgat tttgggacaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylR407 <400> 13 tcgttgaagt agacgctcat 20

Claims (10)

  1. (a) 시료(sample)로부터 DNA를 분리하여 시료 DNA를 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 시료 DNA와 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머로 구성되는, 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 동정용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물을 분석하여 시료의 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 포함 여부를 식별하는 단계;를 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 식별방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는 인삼(Panax ginseng)시료인 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 식별방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PCR 산물 분석은 PCR 산물의 크기 분석을 포함하는 단편 분석(fragment analysis)를 수행하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 식별방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 동정용 프라이머는 시료 DNA에 포함된 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 증폭하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 식별방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 중합효소연쇄반응인 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 식별방법.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머로 구성되는, 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 검출용 프라이머 세트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans이 가지는 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA를 증폭시키는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 검출용 프라이머 세트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 마이크로새틀라이트(Microsatellite) DNA는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 검출용 프라이머 세트.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 검출용 프라이머 세트 및 증폭용 시약을 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 검출 또는 정량분석용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭용 시약은 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans검출 또는 정량분석용 키트.
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