KR101259583B1 - 꽃매미의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 - Google Patents

꽃매미의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머, 및 이를 이용한 꽃매미(Lycorma delicatula)의 원산지 또는 유입경로 판별 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 꽃매미의 게놈 DNA로부터 특정 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 단편을 선별하고, 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 고안하였으며, 이를 이용하여 천안 지역에서 수집된 꽃매미 42개체의 유전형을 분석한 결과, 상기 제조된 마이크로새틀라이트 DNA 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 수집된 42개의 꽃매미 개체를 구별할 수 있음을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명의 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트가 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하는 방법에 유용하게 이용될 수 있음을 밝혔다.

Description

꽃매미의 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머{Microsatellite markers in Lycorma delicatula and primers for amplification}
본 발명은 꽃매미 유래 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 증폭하기 위한 프라이머, 및 이를 이용한 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별 방법에 관한 것이다.
국제 무역이 활성화됨에 따라, 대륙 대 대륙 또는 국가 대 국가간 외래 종이 유입될 가능성이 증가하고 있는 추세이며, 생물학적인 유입은 일반적으로 급격한 대발생을 초래하여 도입된 지역에 심각한 해를 유발하게 된다. 따라서 검역을 통한 외래종의 유입방지 노력은 국토환경 보존을 위한 새로운 안보 개념으로 인식되고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위한 일환 중 하나가 그 원산지를 판별하는 것이다. 원산지를 판별하는 것은 천적의 도입과 같이 그 종을 제어할 수 있는 전략을 확립할 수 있기 때문에 매우 중요하다. 최근 마이크로새틀라이트 마커가 유입 종의 원산지를 판별하기 위한 많은 연구에 사용되고 있는데, 특히, 다양한 좌위의 조합에 기초한 다좌위(multilocus) 유전형은 연구자들이 원산지와 유입 개체군 사이의 이주 경로를 정밀하게 확인하는데 이용되고 있다.
마이크로새틀라이트(microsatellite) 마커는 유전체 내에 존재하는 1-5개의 짧은 DNA 반복염기서열(repeat sequence)을 포함하는 150-300 bp(base pairs) 길이의 염기서열단편을 말한다. 마이크로새틀라이트(Microsatellite)는 ATATATAT 등과 같이 반복되는 염기서열을 가진 DNA 단편으로 VNTRs나 탠덤 반복(tandem repeats)의 변수(variable number)로서 언급되는 경우도 있으며 비 암호화 DNA에서 나타나는 경향이 있다. 어떤 마이크로새틀라이트는 각 개체 별로 반복 단위(e.g. AT)가 다양하게 나타나는 경우도 있으며, 한 예로, 부계 쪽에 12 반복(repeat)과 19 반복의 유전형(genotype)을 갖고 있고 모계 쪽이 18 반복과 15 반복을 가지고 있다면 1차 자손은 12와 15 반복의 유전형을 물려받을 수 있다. 반복서열이 복제되면서 계속해서 자손에게 전달되게 되고, 이와 같은 현상이 오랜 기간동안 진행되면서 개체들 간에 마이크로새틀라이트가 재조합되고 보존되면서 다양성이 나타나게 되는 한편, 교배되지 않은 다른 집단사이에서는 더 다양한 다형성(polymorphism)에 따른 특성화가 이루어질 수 있다. 따라서, 이들 마이크로새틀라이트에 존재하는 반복염기서열은 유전적 관계에 따라 여러 가지 다형성(polymorphism)이 관찰될 수 있어 개체군 및 복잡한 근연 그룹 간의 유전적 현상을 해석하는 분자 마커로 최근 널리 이용되고 있다. 마이크로새틀라이트는 보통 집단유전학의 하디-바인베르크(Hardy-Weinberg) 법칙을 따르고, 각각의 대립 유전자쌍 또는 성염색체상에 특이적으로 존재 가능한 좌위(locus)의 판별이 가능하며, 복수의 마커를 동시에 분석할 수 있어 유전학적 연구에 널리 이용되어 왔다. 이 분자마커는 개체 수준의 변이도 판별할 수 있는 정밀함 때문에 유전적인 요인을 해석하는데 큰 장점이 있고, 전통적으로 친자확인, 품종감별, 육종학, 보존생물학 분야에 크게 기여해 왔으며, 최근에는 이를 활용하여 검역상 침입종의 원산지 및 침입 경로를 추적하는 기술에 널리 이용되고 있다.
한편, 꽃매미(Lycorma delicatula)는 노린재목 꽃매미과에 속하는 곤충으로, 영명으로는 spot clothing wax cicada 혹은 lantern fly라고 불리고 있다. 문헌상으로 1932년 일본곤충학자 Doi가 우리나라에 꽃매미(Lycorma delicatula)와 회조꽃매미(Limois emelianovi) 두 종이 있음을 조선박물학회지 13권에 보고한 적이 있으며, 우리나라에서는 1979년 문교부에서 한국동식물명집을 발간할 당시 이 곤충의 이름을 수록한 적이 있었으나, 그동안 표본이 발견이 되지 않아 1994년에 발간한 한국곤충명집 이후로는 꽃매미(Lycorma delicatula)가 삭제되었었다. 그러나 이는 1932년 당시 Doi가 꽃매미는 회조꽃매미의 오동정(misidentification)임을 정정한 후속 논문(조선박물학회지 14권)을 인용하지 않은 오류임이 최근 확인되어 꽃매미는 국내에 분포한 적이 없는 침입종임을 분명히 하게 되었다. 최근에 꽃매미가 발견되기 시작한 것은 2006년 서울의 관악산, 천안, 연기 청주 등지의 가죽나무에서 발생이 확인되었으며, 2008년도에는 국립산림과학원에서 야산의 꽃매미 서식처에서 목본류 41종, 초본류 3종 등의 기주식물을 확인한 바 있다. 현재 우리나라에서의 정식명칭은 꽃매미로 통하고 있다.
꽃매미는 다른 매미들과는 달리 땅속생활을 하지 않고, 년 1회 발생하며, 알로 월동한다. 이들은 나무줄기 등지에서 난괴로 월동하여 이듬해 4월말부터 부화하기 시작하여 약충기를 거친 다음 7월 중하순부터 성충이 되어 포도원 주변의 인근 야산에 서식하다가 8월 중순이후 본격적으로 포도원으로 침입하여 포도줄기를 흡즙하여 포도나무를 고사시키거나, 수액을 빨아먹고 배설하는 감로에 의해 포도열매나 잎 등에 그을음병을 발생시켜 포도의 상품성을 현저히 저하시킨다.
꽃매미에 의한 우리나라 포도 과수원 피해상황은 천안지역을 중심으로 2006년에는 1 ha, 2007년에는 7 ha, 2008년에는 91 ha에 불과하던 것이 2009년에는 경기도 등 5개도 20개 시군(경기 8, 강원 1, 충북 2, 충남 5, 경북 4)에서 2,946 ha이상의 면적에서 발생이 확인되었다. 2010년에는 농식품부에서 공식집계한 포도원 발생면적이 9개 시도 48개 시군에서 8,378 ha에 달하고 있으며, 꽃매미의 발생면적은 해마다 기하급수적으로 증가하고 있는 추세이다.
이러한 꽃매미는 중국의 어느 지역으로부터 유입되었다고 예상되고 있으나, 아직까지 개체군별 유전자 비교를 통한 분석은 이루어지지 않고 있는 실정이며, 이전 연구에서, 한국과 중국의 개체군 간의 서열이 동일하기 때문에 COI 바코드 부분을 이용한 원산지 구별이 불가능하여, 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하여 효과적인 검역대책을 마련하는 것이 매우 시급한 실정이다. 하지만, 아직까지 꽃매미의 유전적 분석을 통한 원산지 또는 유입경로 파악에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 최근 국내 침입하여 포도에 큰 피해를 주는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하기 위하여, 꽃매미의 게놈 DNA로부터 특정 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 단편을 선별하고, 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 고안하였으며, 이를 이용하여 천안 지역에서 수집된 꽃매미 42개체의 유전형을 분석한 결과, 상기 제조된 마이크로새틀라이트 DNA 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 수집된 42개의 꽃매미 개체를 구별할 수 있음을 확인하고, 이를 통해 본 발명의 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트가 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 키트 및 판별 방법에 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함한 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 마이크로어레이 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용한 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 반복서열 (AGC)7을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 1의 서열과 3'말단의 서열번호 2의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GA)8TT(GA)17을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 3의 서열과 3'말단의 서열번호 4의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CAG)9을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 5의 서열과 3'말단의 서열번호 6의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CGT)9(GTT/GCT)16을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 7의 서열과 3'말단의 서열번호 8의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CT)33을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 9의 서열과 3'말단의 서열번호 10의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CAG)7을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 11의 서열과 3'말단의 서열번호 12의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GT)5(CT)19를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 13의 서열과 3'말단의 서열번호 14의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CA)8을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 15의 서열과 3'말단의 서열번호 16의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GCT)15를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 17의 서열과 3'말단의 서열번호 18의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CT)14를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 19의 서열과 3'말단의 서열번호 20의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (AC)18를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 21의 서열과 3'말단의 서열번호 22의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CAG/CAA)22를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 23의 서열과 3'말단의 서열번호 24의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GCA)7을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 25의 서열과 3'말단의 서열번호 26의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GT)18을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 27의 서열과 3'말단의 서열번호 28의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
반복서열 (CACT)6(CT)19를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 29의 서열과 3'말단의 서열번호 30의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 꽃매미(Lycorma delicatula) 유래 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 포함하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 마이크로어레이 또는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성된 프라이머 세트 및 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제 1항의 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 꽃매미(Lycorma delicatula)의 원산지 또는 유입경로 판별용 키트를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별 방법을 제공하는 것이다;
1) 꽃매미에서 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA로부터 마이크로새틀라이트를 포함하는 DNA 단편을 선별하는 단계;
3) 단계 2)의 선별된 DNA 단편을 주형으로 하고, 제 4항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자 산물을 획득하는 단계; 및
4) 단계 3)의 획득된 유전자 산물의 대립유전자형을 분석하는 단계.
본 발명의 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머는 최근 국내 침입하여 포도에 큰 피해를 주는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하고, 그들의 이주, 분산, 교미습성과 관련된 생태특성 규명을 통해 해충방제를 위한 효율적인 전략수립에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 42개의 꽃매미(L. delicatula)의 개별 개체간 초기 두 개의 주성분인, PC1 및 PC2를 기본으로 한 주성분분석법(principle component analysis)의 결과를 나타낸 플랏(plot)이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 반복서열 (AGC)7을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 1의 서열과 3'말단의 서열번호 2의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GA)8TT(GA)17을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 3의 서열과 3'말단의 서열번호 4의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CAG)9을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 5의 서열과 3'말단의 서열번호 6의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CGT)9(GTT/GCT)16을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 7의 서열과 3'말단의 서열번호 8의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CT)33을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 9의 서열과 3'말단의 서열번호 10의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CAG)7을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 11의 서열과 3'말단의 서열번호 12의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GT)5(CT)19를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 13의 서열과 3'말단의 서열번호 14의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CA)8을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 15의 서열과 3'말단의 서열번호 16의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GCT)15를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 17의 서열과 3'말단의 서열번호 18의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CT)14를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 19의 서열과 3'말단의 서열번호 20의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (AC)18를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 21의 서열과 3'말단의 서열번호 22의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (CAG/CAA)22를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 23의 서열과 3'말단의 서열번호 24의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GCA)7을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 25의 서열과 3'말단의 서열번호 26의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
반복서열 (GT)18을 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 27의 서열과 3'말단의 서열번호 28의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
반복서열 (CACT)6(CT)19를 포함하되, 상기 반복 서열은 5' 말단의 서열번호 29의 서열과 3'말단의 서열번호 30의 서열 사이에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드;
로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 꽃매미(Lycorma delicatula) 유래 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 포함하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 마이크로어레이 또는 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 구성된 프라이머 세트, 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성된 프라이머 세트 및 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제 1항의 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 꽃매미(Lycorma delicatula)의 원산지 또는 유입경로 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 꽃매미의 근육부위에서 게놈 DNA를 분리하고, 제한효소로 절단한 후, 250 내지 600 bp 크기의 DNA 단편만을 분리하였으며, 이들을 링커 프라이머(linker primer)를 이용한 PCR을 수행하여, (CA)15, (CT)15, (AGC)7, (ATT)7) 반복서열로 이루어진 4가지 5'-바이오틴 프로브와 결합되도록 하였다. 이후, 바이오틴 프로브와 결합된 DNA 단편을 스트렙타비딘(streptavidin)이 부착된 마그네틱 입자와 혼성화하고, 잔여 입자를 제거한 다음, 마그네틱 입자에 부착된 DNA 단편을 용출하여 이를 링커 프라이머로 다시 한번 PCR을 통해 증푹한 뒤 pGEM-T easy 벡터를 이용하여 E. coli에 형질전환하고 배양하였다. 배양 후 정상적으로 형질전환된 콜로니(colony)만을 선별하고 채취하여 그 염기서열을 판독한 후, 최종적으로 마이크로새틀라이트 제작에 적합하고 반복서열을 포함하는 염기서열을 결정하여 15개의 마이크로새틀라이트 좌위를 선별하였다. 또한, 선별된 마이크로새틀라이트 좌위를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 선별하였으며, 형광 단편 분석을 위해 각 정방향 프라이머에는 형광체를 부착하였다. 이후, 제작된 프라이머 세트로 천안 지역의 꽃매미 42개체의 유전형을 분석하였으며, 그 결과, 꽃매미 개별간 상호우성 유전자형의 거리에 기초한 주성분분석에서 최초 두 개의 주성분(PC1 및 PC2)의 전체 편차가 41 %로 상당히 분산된 형태로 나타났고(도 1), 이를 통해 각 개별 샘플이 15개의 마이크로새틀라이트 DNA에 기초한 다좌위 유전형에 의해 따로따로 동정되었음을 확인하였다. 또한, 15개의 마이크로새틀라이트 좌위중에서, 특히, 10개가 하나의 좌위당 대립 유전자의 수가 4개 내지 19개이고, 예상되는 이형접합성 값의 범위가 0.430 내지 0.866으로 매우 높은 다형성을 나타내었으며(표 2), 단일 집단에서 수집된 꽃매미 개체에서 다양한 다좌위 유전형이 나타남을 확인하였다.
따라서, 상기 제조된 마이크로새틀라이트 좌위가 단일 지역으로부터 수집된 42개의 꽃매미 개체를 구별하는데 매우 효과적이며, 이를 통해 꽃매미의 유전적 연구를 용이하게 할 수 있으므로, 본 발명의 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 마이크로어레이 또는 키트에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별 방법을 제공하는 것이다;
1) 꽃매미에서 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA로부터 마이크로새틀라이트를 포함하는 DNA 단편을 선별하는 단계;
3) 단계 2)의 선별된 DNA 단편을 주형으로 하고, 제 4항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자 산물을 획득하는 단계; 및
4) 단계 3)의 획득된 유전자 산물의 대립유전자형을 분석하는 단계.
상기 단계 2)의 마이크로새틀라이트를 포함하는 DNA 단편은 (AGC)7, (GA)8TT(GA)17, (CAG)9, (CGT)9(GTT/GCT)16, (CT)33, (CAG)7, (GT)5(CT)19, (CA)8, (GCT)15, (CT)14, (AC)18, (CAG/CAA)22, (GCA)7, (GT)18 및 (CACT)6(CT)19로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 반복서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별 방법은 분석된 꽃매미의 대립유전자형의 발현 패턴을 기준으로 정하고, 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 이용하여 임의의 꽃매미의 대립유전자형의 발현 패턴을 분석하고, 상기의 기준 패턴과 비교하여 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 꽃매미의 게놈 DNA로부터 특정 마이크로새틀라이트(microsatellite) DNA 단편을 선별하고, 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 고안하였으며, 이를 이용하여 천안 지역에서 수집된 꽃매미 42개체의 유전형을 분석한 결과, 상기 제조된 마이크로새틀라이트 DNA 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 수집된 42개의 꽃매미 개체를 구별할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하는 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 마이크로새틀라이트 DNA 의 제조
<1-1> 게놈 DNA 의 분리, 효소 절단 및 크기별 분획화
국내에서 채집된 꽃매미 200여 개체를 에탄올에 보존하고, 이들 근육부위를 분리하여 DNAzol Genomic DNA Isolation Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 꽃매미의 게놈 DNA를 분리하였다. 이후, 추출된 DNA는 NdeII(GATC) 제한효소로 절단한 후에, Chroma spin-400 columns (Clontech, Mountain View, CA, USA)을 이용하여 250 내지 600 bp 사이의 DNA 단편만을 분리하였다.
<1-2> 바이오틴 ( biotin ) 프로브 ( probe ) 표지
DNA 단편의 바이오틴 프로브 표지를 위하여 Kijas JMH, Fowler JCS, Garbett CA, Thomas MR. 1994. Enrichment of Microsatellites from the Citrus Genome Using Biotinylated Oligonucleotide Sequences Bound to Streptavidin-Coated Magnetic Particles. Biotechniques 16: 656-662. 및 Sarno RJ, David VA, Franklin WL, O'Brien SJ, Johnson WE. 2000. Development of 267 microsatellite markers in the guanaco, Lama guanicoe: utility for South American camelids. Molecular Ecology 9: 1922-1924에 기재된 방법을 이용하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1-1>에서 분리된 DNA 단편들과 NdeII와 연결될 수 있는 말단을 가진, EP1(5'-CCCCCACCTCCTGCCCATCATAAAAAATC-3', 서열번호 31) 및 EP2(5'-GATCGATTTTTTATGATGGGCAGGAGGTGGGGG-3', 서열번호 32)을 반응시켰다. 반응되지 않은 잔여 링커는 Amicon ultra-0.5 mL(Millipore, Billerica, MA, USA)로 두 번 세척하여 제거하였다. 이후, 5U의 Advantage 2 Polymerase(Clontech), 10×PCR 완충용액, 2.5 mM dNTP 혼합액, 20 uM의 EP3 프라이머(5'-CCCCCACCTCCTGCCCATCAT-3', 서열번호 33), 및 0.05 ug의 DNA 주형을 포함한 30 ul 반응 혼합액을 제조하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다. 이때, 바이오티닐화된 캡쳐 프로브는 NdeII와 연결될 수 있는 말단이 링크된 DNA 단편들을 어닐링하였으며, 이때, (CA)15, (CT)15, (AGC)7, 및 (ATT)7의 4가지 형태의 바이오티닐화된 디-뉴클레오티드(di-nucleotide) 또는 트리-뉴클레오티드(tri-nucleotide) 반복 서열을 이용하였다. 다음으로, 얻어진 PCR 산물을 스트렙타비딘(streptavidin)이 부착된 마그네틱 비드(Promega, Madison, WI, USA)와 (CA)15는 65 ℃,(CT)15는 61 ℃,(AGC)7은 65 ℃, 및 (ATT)7은 50 ℃에서 혼성화시킨 후에, 각 반복 서열의 최적화된 온도에서 2×SSC(150 mM NaCl, 15 mM Sodium Citrate pH 7.0)로 세척하여 결합되지 않은 DNA 잔여물을 제거하였다. 이후, 95 ℃에서 5분간 가열하여 마그네틱 비드로부터 바이오틴이 강화된 DNA를 용출하고, 상기 서열번호 33으로 기재되는 EP-3 프라이머로 DNA의 PCR 증폭을 다시 수행하였으며, 얻어진 PCR 산물을 1.2% TAE 아가로즈 겔에서 전기영동하여 사이즈에 따라 분리한 후 정제하였다.
<1-3> 바이오틴 프로브가 강화된 DNA 의 벡터내 클로닝
바이오틴 프로브가 강화된 DNA의 서열분석을 위하여, 바이오틴 프로브와 결합된 DNA를 벡터내로 클로닝하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1-2>에서 얻어진 산물을 정제한 다음, 제조사의 방법에 따라 pGEM-T easy 벡터(Promega)내로 라이게이션하고, 형질전환하였다. 이후, 앰피실린(Ampicillin)(100ug/ml), X-gal(25mg/ml), IPTG가 혼합된 LB 배지에서 자란 E. coli중에 정상적으로 형질전환된 흰색 콜로니만을 선별한 다음, 이를 -70 ℃ 냉동고에 균주를 보관하고, 실험에 필요한 양을 남겨 콜로니(colony) PCR을 수행하였다. PCR 반응은 0.5 uM 정방향 및 역방향 M13 프라이머(정방항: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'(서열번호 34); 역방향: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'(서열번호 35), 각 SSR 모티프 프라이머 0.5 uM, 및 0.05 ug의 DNA 주형을 포함한 20 ul의 반응 혼합액을 AccuPower PCR PreMix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 증폭하였다. PCR은 하기의 순서에 따라 GS482 thermo-cycler(Gene Technologies, Essex)를 이용하여 수행하였다: 95 ℃에서 5분간 초기 변성, 이어서 95 ℃, 30초; 56 ℃, 1분 어닐링; 72 ℃, 1분 신장의 단계를 30 싸이클, 72 ℃ 5분간 최종 신장하는 단계. 이후, 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 시각화하였으며, ABI PRISM 3730 XL DNA 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 씨퀀싱(sequencing)하여 서열을 확인하였으며, MEGA 4.0(Kumar et al. 2008)으로 정렬하여 같은 서열이 있는지 확인하였다.
<1-4> 마이크로새틀라이트 좌위 선발을 위한 스크리닝
상기 <실시예 1-3>에서 확인된 콜로니(colony) 샘플이 단일 서열 반복(simple sequence repeats, SSR)을 포함하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 Wang et al.(2007)[Wang XW, Trigiano RN, Windham MT, Devries RE, Scheffler BE, Rinehart TA, Spiers JM. 2007. A simple PCR procedure for discovering microsatellites from small insert libraries.Molecular Ecology Notes 7: 558-561.]의 방법에 따라 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1-3>의 분석된 염기서열에서 각 마이크로새틀라이트 서열의 SSR 모티프를 FastPCR 6.1.5.beta 3 (Kalendar et al. 2009)를 이용하여 검색하고, 분석하였으며, 이미 알려진 암호화 부위 또는 비암호화 부위를 가지고 있는 가능한 매치를 조사하기 위하여, 각 서열들을 BLASTN 2.2.24+(Zhang et al. 2000)을 이용하여 GenBank의 다른 보고된 서열과 비교하였다.
그 결과, 꽃매미의 게놈 DNA 라이브러리로부터 (CA)15, (CT)15, (AGC)7, 및 (ATT)7의 올리고 반복 서열이 강화되어 있는 총 650개의 양성 콜로니를 얻었으며, 이 중에서, 단일 서열 반복(simple sequence repeates, SSR) 모티프를 확인하기 위해 351개의 콜로니를 스크리닝하여, 330개(94%)의 콜로니가 양성임을 확인하였다. 이후, 스크리닝으로 확인된 콜로니 중에, 75개 산물을 직접적으로 시퀀싱하여 MEGA를 이용한 얼라인먼트(alignment)를 수행하여 체크한 결과, 그들 사이에서 복제된 서열이 아님을 확인하였을 뿐 아니라, GenBank에서 보고된 다른 서열과도 매치되지 않음을 확인하였다.
이후 이로부터, 27개의 콜로니를 선별하고, 이중 단일형이거나 다형성 해석이 불분명한 12개를 제외하여, 최종적으로 마이크로새틀라이트 제작에 적합하고 반복서열을 포함하는 염기서열 15개를 선별하였다.
< 실시예 2> 마이크로새틀라이트 좌위 증폭용 프라이머의 제조
상기 <실시예 1>에서 선별하여 제조된 DNA 단편을 마이크로새틀라이트 좌위로 하여 서열내 반복 모티프를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 PRIMER 3(Rozen and Skaletsky 2000) 프로그램을 이용하여 고안하였으며, 그 결과 하기 [표 1]과 같이 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭할 수 있는 총 15쌍의 프라이머 쌍을 제작하였다.
이후, 형광 단편 분석(fragment analysis)에 이용하기 위해 각 정방향 프라이머에 6-FAM 또는 HEX 형광체를 표지하였다.
좌위 반복 모티프 프라이머 서열(5'-3') 서열번호
Lde01 (AGC)7 F: TGCTGCTCAGCAAATGAATC
R: GAGTCAGCTTTTGTCTTTTCTGC 		1
2
Lde02 (GA)8TT(GA)17 F: AGCGTAATTATAAATATTTCTTGCTGT R: GGCATTTCCAGCACCTATTG 3
4
Lde03 (CAG)9 F: AGAGTGACCAGTTTTGGAGCA
R: TCGAAACAATTCCACTTCCA 		5
6
Lde04 (CGT)9(GTT/GCT)16 F: GCTGATTCGGTGGTTGAAGT
R: GCTCCATCCAATACCCAAAA 		7
8
Lde05 (CT)33 F: TCCCAATAGAAAGCGTTAAGTT
R: CGGGCTGAAATAAGCACGTA 		9
10
Lde06 (CAG)7 F: TACCAGCACGGTACAGCAAG
R: CGGCGAATTCTCTTTCTCTG 		11
12
Lde07 (GT)5(CT)19 F: GGTGAAGCATACCGATGTTG
R: CCCAGAGGATACCTGCAAAG 		13
14
Lde08 (CA)8 F: GAACATGGTCAAATCACTCATCA
R: GGTCCCTCCCGCTATTATTAC 		15
16
Lde09 (GCT)15 F: AACATGGGAGAAGTCGGTGA
R: TCAGCAACAAGTCCAGCAAC 		17
18
Lde10 (CT)14 F: TGTCTGCATGAAATTTTTACCG
R: ACCGGAGGCTAAAAAGGAAA 		19
20
Lde11 (AC)18 F: CGGCAGCAGCACATAGTAAA
R: TCGAATAGCAAGAAGCACCA 		21
22
Lde12 (CAG/CAA)22 F: TAACATGCAGCCTTCAGCAC
R: TGGTTGATGAACGCAGTACC 		23
24
Lde13 (GCA)7 F: CTCTAACACCCGGATTGCTC
R: GGGATGTGCGATAGAAAAGC 		25
26
Lde14 (GT)18 F: ACGCCCTCTCTACCTGTGTG
R: GATTGAGAGGAGGGGAGAGAT 		27
28
Lde15 (CACT)6(CT)19 F: CGGTCGTTCTTTCTCACTCA
R: TTCCACAACACCGCTAAAGA 		29
30
F: 정방향 프라이머; R: 역방향 프라이머.
< 실험예 1> 형광 단편 분석을 통한 마이크로새틀라이트 좌위의 적용 평가
상기 <실시예 1>에서 선별하여 제조된 마이크로새틀라이트 좌위의 적용성을 평가하기 위하여, 대한민국 충청북도 천안으로부터 수집된 꽃매미 42개체를 이용하여 최종적으로 선별된 15개의 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭할 수 있는 상기 <실시예 2>에서 고안된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하고, 형광 단편 분석을 수행하였다.
구체적으로, PCR은 0.5 mM의 정방향 및 역방향 프라이머, 및 0.05 ug의 DNA 주형을 포함한 10 ul의 반응 혼합액으로 GeneAll Taq DNA Polymerase Premix (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 수행하였으며, 각 프라이머에서 최적 온도 조건으로 증폭되었다[95 ℃에서 5분 반응 후, 95 ℃ 30초; 56 ℃ 50초; 72 ℃ 30초로 34주기 반응한 뒤, 마지막으로 72 ℃에서 5분간 반응]. 이후, 아가로즈 겔 상에서 정상적으로 증폭된 것을 확인하였다. 자동적인 형광 단편 분석은 ABI PRISM 377 유전자 분석기(Applied Biosystems)로 수행하였고, PCR 산물의 대립유전자의 크기는 ROX가 표지된 표준 크기 분자 마커(GenScanTM ROX 500, Applied Biosystems)를 이용하여 확인하였으며, 각 형광 DNA 산물의 결과는 GENEMAPPER version 4.0을 이용하여 분석하였다. 대립유전자의 수, 확인되거나 예상되는 이형접합성 수치, 하디-바인베르크 법칙(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE) 및 좌위 간 연관 비평형은 GENEPOP 4.0.7(Raymond and Rousset 1995)을 이용하여 측정하였다. 널 대립유전자(마이크로새틀라이트에서 프라이머 부위에 돌연변이가 생겨서 증폭되지 않는 대립유전자, null allele)의 존재에 대한 확인은 MICRO-CHECKER 2.2.3(Oosterhout et al. 2004)를 이용하였으며, 대립유전자 빈도, 다좌위 유전형, 및 주성분 분석은 GeneAlEx 6.3(Peakall and Smouse 2006)을 이용하여 분석하였다.
좌위 T a
(℃) 		5'
형광
표지		 크기
범위
(bp)		 N A N IA / N IS H O H E HWE
P 값		 Null allele
빈도
Lde01 56 HEX 183-194 2 42/42 0.262 0.228 0.240 0.048
Lde02 56 FAM 226-267 19 42/42 0.548 0.866 0* 0.171
Lde03 56 FAM 178-181 2 42/42 0.310 0.375 0.022* 0
Lde04 56 HEX 186-195 4 42/42 0.714 0.597 0.802 0.004
Lde05 56 FAM 210-249 5 42/42 0.262 0.488 0* 0.152
Lde06 56 FAM 143-179 4 42/42 0.452 0.458 0.167 0
Lde07 56 HEX 191-211 10 42/42 0.833 0.750 0.375 0
Lde08 56 HEX 211-213 2 42/42 0.476 0.408 0.810 0.028
Lde09 56 FAM 237-243 3 42/42 0.238 0.214 0.112 0.035
Lde10 56 FAM 174-221 11 42/42 0.786 0.855 0.033* 0.059
Lde11 56 HEX 153-201 9 42/42 0.476 0.569 0.815 0
Lde12 56 FAM 218-233 5 42/42 0.500 0.430 0.454 0
Lde13 56 FAM 215-224 4 42/42 0.524 0.567 0.860 0.037
Lde14 56 FAM 170-199 8 42/42 0.524 0.504 1.000 0
Lde15 56 FAM 151-189 12 42/42 0.738 0.801 1.000 0
T a (℃) : PCR 증폭시 최적 어닐링 온도
N A : 대립유전자의 수
N IA / N IS : 분석된 개별 개체의 수/ 성공적으로 유전형이 확인된 개별 개체의 수
H o : 확인된 이형접합성 수치
H E : 예상되는 이형접합성 수치
HWE p 값 : 하디-바인베르크 법칙(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)의 유의성 차이,
*는 HWE에서 현저하게 벗어난 좌위를 나타냄.
널 대립유전자(Null allele) 빈도: 마이크로새틀라이트에서 프라이머 부위에 돌연변이가 생겨서 증폭되지 않는 대립유전자의 빈도
그 결과, 꽃매미 개체별간 상호우성 유전자형의 거리에 기초한 주성분 분석에서 최초 두 개의 주성분(PC1 및 PC2)의 전체 편차가 41%로 상당히 분산된 형태로 나타났고(도 1), 이를 통해 각 개별 샘플이 15개의 마이크로새틀라이트 DNA에 기초한 다좌위 유전형에 의해 따로따로 동정되었음을 확인하였다.
또한, 15개의 마이크로새틀라이트 좌위 중에서, 특히, 10개가 하나의 좌위당 대립 유전자의 수가 4개 내지 19개이고, 예상되는 이형접합성 값의 범위가 0.430 내지 0.866으로 매우 높은 다형성을 나타내었으며(표 2), 단일 집단에서 수집된 꽃매미 개체에서 다양한 다좌위 유전형이 나타났다. 또한, 15개의 좌위 중, Lde02, Lde03, Lde05, 및 Lde10은 HWE(P < 0.05)에서 현저하게 벗어났으나, 이를 제외한 11개의 좌위는 하디-바인베르크 법칙에 위배되지 않았으며, Lde02 및 Lde05는 널 대립유전자(null allele)가 존재함을 확인하였다(표 2).
따라서, 상기 제조된 마이크로새틀라이트 좌위는 하나의 단일 집단으로부터 수집된 42개의 꽃매미 개체를 구별하는데 매우 효과적이며, 이를 통해 꽃매미의 유전적 연구를 용이하게 할 수 있음을 알 수 있다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 마이크로새틀라이트 DNA 마커 및 이를 증폭할 수 있는 프라이머는 꽃매미의 개체를 효과적으로 구별할 수 있으므로, 이를 활용하여 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하고, 그들의 생태특성을 규명하여 해충방제를 위한 효율적인 전략수립에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> EWHA UNIVERSITY-INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> Microsatellite markers in Lycorma delicatula and primers for amplification <130> 10p-12-54 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde01 forward primer <400> 1 tgctgctcag caaatgaatc 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde01 Reverse primer <400> 2 gagtcagctt ttgtcttttc tgc 23 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde02 Forward primer <400> 3 agcgtaatta taaatatttc ttgctgt 27 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde02 Reverse primer <400> 4 ggcatttcca gcacctattg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde03 Forward primer <400> 5 agagtgacca gttttggagc a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde03 Reverse primer <400> 6 tcgaaacaat tccacttcca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde04 Forward primer <400> 7 gctgattcgg tggttgaagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde04 Reverse primer <400> 8 gctccatcca atacccaaaa 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde05 Forward primer <400> 9 tcccaataga aagcgttaag tt 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde05 Reverse primer <400> 10 cgggctgaaa taagcacgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde06 Forward primer <400> 11 taccagcacg gtacagcaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde06 Reverse primer <400> 12 cggcgaattc tctttctctg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde07 Forward primer <400> 13 ggtgaagcat accgatgttg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde07 Reverse primer <400> 14 cccagaggat acctgcaaag 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde08 Forward primer <400> 15 gaacatggtc aaatcactca tca 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde08 Reverse primer <400> 16 ggtccctccc gctattatta c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde09 Forward primer <400> 17 aacatgggag aagtcggtga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde09 Reverse primer <400> 18 tcagcaacaa gtccagcaac 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde10 Forward primer <400> 19 tgtctgcatg aaatttttac cg 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde10 Reverse primer <400> 20 accggaggct aaaaaggaaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde11 Forward primer <400> 21 cggcagcagc acatagtaaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde11 Reverse primer <400> 22 tcgaatagca agaagcacca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde12 Forward primer <400> 23 taacatgcag ccttcagcac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde12 Reverse primer <400> 24 tggttgatga acgcagtacc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde13 Forward primer <400> 25 ctctaacacc cggattgctc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde13 Reverse primer <400> 26 gggatgtgcg atagaaaagc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde14 Forward primer <400> 27 acgccctctc tacctgtgtg 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde14 Reverse primer <400> 28 gattgagagg aggggagaga t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde15 Forward primer <400> 29 cggtcgttct ttctcactca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lde15 Reverse primer <400> 30 ttccacaaca ccgctaaaga 20 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP1 primer <400> 31 cccccacctc ctgcccatca taaaaaatc 29 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP2 primer <400> 32 gatcgatttt ttatgatggg caggaggtgg ggg 33 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EP3 primer <400> 33 cccccacctc ctgcccatca t 21 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Forward primer <400> 34 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Reverse primer <400> 35 ggaaacagct atgaccatg 19 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(AGC) <400> 36 agcagcagca gcagcagcag c 21 <210> 37 <211> 52 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(GA)8TT(GA)17 <400> 37 gagagagaga gagagattga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ga 52 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CAG)9 <400> 38 cagcagcagc agcagcagca gcagcag 27 <210> 39 <211> 75 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CGT)9(GTT)16 <400> 39 cgtcgtcgtc gtcgtcgtcg tcgtcgtgtt gttgttgttg ttgttgttgt tgttgttgtt 60 gttgttgttg ttgtt 75 <210> 40 <211> 66 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CT)33 <400> 40 ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 60 ctctct 66 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CAG)7 <400> 41 cagcagcagc agcagcagca g 21 <210> 42 <211> 48 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(GT)5(CT)19 <400> 42 gtgtgtgtgt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctct 48 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CA)8 <400> 43 cacacacaca cacaca 16 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CGT)15 <400> 44 gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgct 45 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CT)14 <400> 45 ctctctctct ctctctctct ctctctct 28 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(AC)18 <400> 46 acacacacac acacacacac acacacacac acacac 36 <210> 47 <211> 66 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CAG)22 <400> 47 cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 60 cagcag 66 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(GCA)7 <400> 48 gcagcagcag cagcagcagc a 21 <210> 49 <211> 36 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(GT)18 <400> 49 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgt 36 <210> 50 <211> 62 <212> DNA <213> Lycorma delicatula microsatellite DNA marker(CACT)6(CT)19 <400> 50 cactcactca ctcactcact cactctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 60 ct 62

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 서열번호 36 내지 서열번호 50 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 모두 포함하는 꽃매미(Lycorma delicatula)의 원산지 또는 유입경로 판별용 마이크로어레이.
  3. 서열번호 36 내지 서열번호 50 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 모두 포함하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 키트.
  4. 삭제
  5. 하기의 프라이머 세트 모두를 포함하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별용 키트:
    서열번호 36의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트;
    서열번호 37의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 세트;
    서열번호 38의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트;
    서열번호 39의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트;
    서열번호 40의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트;
    서열번호 41의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 세트;
    서열번호 42의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 세트;
    서열번호 43의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 세트;
    서열번호 44의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 세트;
    서열번호 45의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 세트;
    서열번호 46의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 세트;
    서열번호 47의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머 세트;
    서열번호 48의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머 세트;
    서열번호 49의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머 세트; 및
    서열번호 50의 마이크로새클라이트 DNA 마커를 증폭시키는 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 세트.
  6. 1) 꽃매미에서 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 단계 1)의 게놈 DNA로부터 서열번호 36 내지 서열번호 50 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 선별하는 단계;
    3) 단계 2)의 선별된 DNA 단편을 주형으로 하고, 제 5항의 키트를 이용하여 PCR을 수행하여 유전자 산물을 획득하는 단계;
    4) 단계 3)의 획득된 유전자의 대립 유전자형을 분석하는 단계; 및
    5) 단계 4)의 분석된 꽃매미의 대립유전자형의 발현 패턴을 기준으로 정하고, 마이크로새틀라이트 DNA 마커를 이용하여 임의의 꽃매미의 대립유전자형의 발현 패턴을 분석하고, 상기의 기준 패턴과 비교하여 꽃매미의 원산지 또는 유입경로를 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 꽃매미의 원산지 또는 유입경로 판별 방법.

  7. 삭제
  8. 삭제
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