KR102162805B1 - 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102162805B1
KR102162805B1 KR1020190111364A KR20190111364A KR102162805B1 KR 102162805 B1 KR102162805 B1 KR 102162805B1 KR 1020190111364 A KR1020190111364 A KR 1020190111364A KR 20190111364 A KR20190111364 A KR 20190111364A KR 102162805 B1 KR102162805 B1 KR 102162805B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
primer set
oligonucleotide
probe
resistant
Prior art date
Application number
KR1020190111364A
Other languages
English (en)
Inventor
오상근
장현아
Original Assignee
충남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충남대학교 산학협력단 filed Critical 충남대학교 산학협력단
Priority to KR1020190111364A priority Critical patent/KR102162805B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102162805B1 publication Critical patent/KR102162805B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물, 상기 마커 조성물을 포함하는 키트 및 상기 마커 조성물을 이용한 탄저병 의심 시료로부터 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 마커 조성물은 포도에서 발병되는 탄저병의 분자생물학적 진단 방법에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도{Marker composition for discriminating anthracnose-resistant or sensitive grape cultivar and uses thereof}
본 발명은 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
포도(Vitis vinifera)는 살과 수분이 많고 안에 씨가 있는 장과(漿果)로, 레스베라트롤, 플라보노이드 및 폴리페놀계 화합물 등이 풍부하며 생으로 먹거나 포도주, 주스, 통조림, 건포도 등으로 가공하여 섭취할 수 있다. 우리나라 포도 산업은 2013년도 기준 5,046억원 규모로, 농업생산액의 1.1%, 과수 생산액의 14.5%를 차지하는 3대 과수 작물에 속하며 농업 생산 및 국민 건강 증진에 있어 매우 중요한 위치를 차지하고 있다. 이에 따라 양질의 포도를 생산하기 위한 많은 유전-육종 연구가 이루어지고 있으나, 포도는 채소 등의 작물에 비해 육종 기간이 길고 이형접합(heterozygote)의 유전적 특성을 갖고 있어 유전 육종 연구를 수행하는데 많은 어려움이 있다. 따라서, 포도 육종의 효율성 증대를 위한 유전체 정보 및 분자표지 마커를 활용한 육종효율 증진 시스템 개발이 필요하다.
포도나무 탄저병(Ripe rot, anthracnose)은 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)과 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(C. gloeosporioides)에 의해 발생되는 대표적인 곰팡이병으로, 특히 성숙기의 과실에 주로 발생하여 과실을 부패시키며 화수나 잎에 발병하기도 한다. 발병 초기에는 담갈색 또는 흑갈색의 작은 반점이 전면에 발생하고, 진전되면 과실의 표면에 분생포자층을 형성하여 과방 내 과립으로 침입하여 과방 전체를 썩게 한다. 이러한 포도 탄저병은 보통 우기가 시작되는 6월 말부터 8월까지 발생되어 다가올 수확기에 막대한 손실을 초래하므로 체계적인 방제 시스템이 필요하다. 실제 농가에서는 살균제 살포에 의한 화학적 방제가 주로 이루어지고 있으나, 재배기간 중 잦은 강우로 인해 약제 방제 시기를 선정하는데 어려움이 있거나 새로운 살균제 저항성 병원균의 출현 등의 이유로 인하여 방제 효과가 그리 높지 않은 것이 현실이다. 또한, 지속적인 약제 살포에 의한 화학적 방제의 경우 변종 병원균 발생 및 우점 병원균 변화로 인하여 그 실효성이 매우 의심되고 있다. 따라서 병 저항성 품종을 육성하여 재배하는 것이 환경 친화적이면서 경제적으로 효과적인 최선의 방제 대책이 될 수 있을 것이다.
한편, 한국등록특허 제1266193호에는 '종간교잡을 통해 육성된 탄저병 저항성 고추 품종 및 이를 선별하기 위한 프라이머 세트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1453403호에는 '중탄산 암모늄을 포함하는 포도 갈색무늬병 방제용 조성물 및 방제 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내 포도 속(Vitis spp.) 유전자원 350 품종을 이용한 탄저병 병원성 검정(표현형) 및 GBS(유전자형) 분석 결과를 통해 GWAS(genomewide association study) 연관 분석을 수행하여, 3번 염색체에서 NBS-LRR 타입의 RPP(Recognition of Peronospora parasitica) 유전자와 유사한 RPP8-like, RPP13-like 유전자를 확인하였다. 또한, 탄저병 저항성을 나타내는 대표 품종인 Muscat Bailey A 및 Bailey Alicante A와 감수성을 나타내는 대표 품종인 Emerald Seedless 및 Pinot Noir를 선별하고 상기 품종 내에 존재하는 RPP8-like 및 RPP13-like 유전자의 염기서열을 분석하여 RPP8-like 유전자로부터 3개, RPP13-like 유전자로부터 6개의 SNP 마커를 개발하였으며, 상기 SNP에 대한 프라이머 세트와 루나 프로브(luna probe)를 제작하여 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종의 게놈 DNA를 주형으로 real-time PCR을 수행한 결과, 본 발명의 SNP 마커에 대한 프라이머 세트 및 프로브가 탄저병 저항성 또는 감수성 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 프로브로 이루어진 총 9개 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 탄저병(anthracnose) 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 탄저병 감염 의심 포도 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종 간의 유전형 판별이 가능하므로, 탄저병에 저항성을 나타내는 포도 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 육성한 탄저병 저항성 포도 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 포도 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum) 및 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(C. gloeosporioides) 병원균에 대해 저항성 또는 감수성을 나타내는 탄저병 저항성(Resistant; Muscat Bailey A, Bailey Alicante A) 또는 감수성(Susceptible; Emerald Seedless, Pinot Noir) 포도 품종을 확인한 결과이다.
도 2 및 도 3은 탄저병 저항성 포도 품종(도 2; Muscat Bailey A, Bailey Alicante A)과 탄저병 감수성 포도 품종(도 3; Emerald Seedless, Pinot Noir)의 게놈 염기서열 중 RRP8(Recognition of Peronospora parasitica 8)-like 유전자 영역에 존재하는 SNP를 나타낸 그림이다.
도 4 및 도 5는 탄저병 저항성 포도 품종(도 4; Muscat Bailey A, Bailey Alicante A)과 탄저병 감수성 포도 품종(도 5; Emerald Seedless, Pinot Noir)의 게놈 염기서열 중 RRP13-like 유전자 영역에 존재하는 SNP를 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 VvCRP8-1의 프라이머 세트와 프로브(a), VvCRP8-2의 프라이머 세트와 프로브(b) 또는 VvCRP8-3의 프라이머 세트와 프로브(c)를 이용한 탄저병 저항성(R) 또는 탄저병 감수성(S) 포도 품종의 유전형 분석 결과이다. Res1(H), Bailey Alicante A(Heterozygote); Res2, Muscat Bailey A; Sus1, Emerald Seedless; Sus2, Pinot Noir.
도 7은 VvCRP13-1의 프라이머 세트와 프로브(a), VvCRP13-2의 프라이머 세트와 프로브(b), VvCRP13-3의 프라이머 세트와 프로브(c), VvCRP13-4의 프라이머 세트와 프로브(d), VvCRP13-5의 프라이머 세트와 프로브(e) 또는 VvCRP13-6의 프라이머 세트와 프로브(f)를 이용한 탄저병 저항성(R) 또는 탄저병 감수성(S) 포도 품종의 유전형 분석 결과이다. Res1(H), Bailey Alicante A(Heterozygote); Res2, Muscat Bailey A; Sus1, Emerald Seedless; Sus2, Pinot Noir.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 탄저병(anthracnose) 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 마커 조성물은 바람직하게는 상기 9개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 프로브 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상의 프라이머 세트 및 프로브 조합을 포함하며, 가장 바람직하게는 9개의 프라이머 세트와 프로브 조합을 모두 포함할 수 있다. 상기 9개의 프라이머 세트와 프로브 조합을 동시에 이용하면 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.
본 발명의 상기 마커 조성물은 탄저병 저항성 포도 품종과 탄저병 감수성 포도 품종의 게놈 DNA를 분석하여 찾은 9개의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트와 상기 SNP 염기를 포함하는 프로브로 이루어져 있다. 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 및 17은 정방향 프라이머이며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18은 역방향 프라이머이며, 서열번호 19 내지 27은 프로브이다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 18의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 18의 염기서열 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "프로브(probe)"란 상보적인 단일가닥 표적서열과 혼성화하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 마커 조성물에 있어서, 상기 프로브는 3'이 블로킹된(blocked), 비표지된 올리고뉴클레오티드 루나 프로브(luna probe)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 프로브는 각 프로브의 서열 내에 포도 탄저병에 대한 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별할 수 있는 SNP 염기를 포함하여 제작된 것이다.
본 발명은 또한, 상기 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
탄저병 감염 의심 포도 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 프로브를 포함하는 마커 조성물을 이용하여 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 효과적으로 구별할 수 있다.
본 발명의 방법은 탄저병 감염 의심 포도 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 본 발명의 일 실시예 따른 증폭된 표적서열은 루나 프로브와 PCR 반응 시약 혼합물 내에 포함된 형광 물질을 통해 표지될 수 있고, 루나 프로는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시료의 선발 및 고순도 DNA 분리
국립원예특작과학원이 보유하고 있는 국내 포도 속 유전자원 350 품종의 유전체 정보 해독을 위해 5월 중순부터 6월 동안 자라나는 잎을 채취하여 게놈 DNA 추출에 사용하였다. 잎은 액화질소로 냉동시킨 다음 pestle을 이용하여 조직을 완전히 마쇄하였고, DNA의 순도를 높이기 위해 DNeasy Plant mini 키트(Qizgen, 미국)를 사용하여 매뉴얼에 따라 수행하였으며, RNase는 30분 동안 충분히 처리하여 RNA의 오염을 완전히 제거하였다.
2. 후보 SNP(single nucleotide polymorphism)의 선발
국립원예특작과학원이 보유하고 있는 국내 포도 속 유전자원 350 품종의 어린 잎을 채취하여 탄저병 병원성 검정(표현형) 및 GBS(유전자형) 분석을 수행하였다. 표현형은 포도 속 유전자원 350 품종에 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)과 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(C. gloeosporioides)를 접종(1x107 포자/mL, 10 ㎕)하여 나타나는 증상을 통해 분석하였고, 상기 두 균주에 대해 모두 저항성을 나타내는 품종(Muscat Bailey A 및 Bailey Alicante A)과 모두 감수성을 나타내는 품종(Emerald Seedless 및 Pinot Noir)을 선별하였다(도 1).
표현형과 유전자형 결과를 이용하여 GWAS(genomewide associated study)를 통해 병 저항성 형질과 연관된 description을 나타내는 유전자를 기준으로 2 Mb 주변을 탐색하였으며, 최종적으로 3번 염색체에서 병 저항성 유전자로 잘 알려진 NBS-LRR(Nucleotide-Binding site and Leucine-Rich Repeats) 타입의 RPP8(Recognition of Peronospora parasitica 8)-like(LOC109122296), RPP13(LOC100260633) 유전자를 찾았으며, 전장 유전체의 서열 정보는 NCBI를 통해 얻었다. 상기 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종 내 존재하는 해당 유전자의 염기서열을 분석하여 RPP8-like 유전자로부터 3개, RPP13-like 유전자로부터 6개의 SNP를 확인하였다(도 2 내지 도 5).
3. 프라이머 및 프로브 설계
선발된 SNP를 검증하기 위해 Primer3 프로그램(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용하여 프라이머를 설계하였다. 프라이머는 AT 혹은 GC-rich를 피하고, GC 비율은 약 50%로 하였으며, 최종 PCR 산물의 크기는 후보 SNP를 포함하여 150 bp 내외가 되도록 설계하였다(표 1).
또한, 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종 간에 차이를 보이는 SNP를 루나 프로브로 설계하였다. 대부분의 저항성 품종이 이형접합성을 보였기 때문에 저항성 품종의 대립형질을 포함하도록 하였고, 프라이머와 Tm 값이 비슷한 수준으로 하였으며 3' 말단에 phosphate를 처리하여 특이성을 높였다(표 2).
본 발명에 사용된 프라이머 정보
No.
 명칭
 염기서열 (5'→3') 크기 (bp)
정방향 (서열번호) 역방향 (서열번호)
1 VvCRP8-1 GTTGAGTTCTCAAACTCCATTGC (1) AGGTAACTGTGGTATGCGTCC (2) 147
2 VvCRP8-2 GAAGAGACTGAGTTGGACTATGA (3) GAATTACTTTGAGTCTAGGAAAGC (4) 142
3 VvCRP8-3 GCTTTCCTAGACTCAAAGTAATTC (5) GTAATGACATCTACCTTCTGCAG (6) 170
4 VvCRP13-1 TGAAGGCGATCAACTGCTTCTTA (7) CTCAGCCTTAAGGATGAACATGT (8) 140
5 VvCRP13-2 GGGAGTTTGCAGGACTGTGTA (9) TCAATCCGTAATGGCTTGTCATC (10) 173
6 VvCRP13-3 CACAAGTGACTTAACTAGCCTTC (11) AGCAAAGAGCTCATGTCAAAGGA (12) 162
7 VvCRP13-4 ATGTGGTCATACCGTGGATGG (13) AGTCCATAGATGTCCAAGACACT (14) 176
8 VvCRP13-5 ATGTGGTCATACCGTGGATGG (15) AGTCCATAGATGTCCAAGACACT (16) 176
9 VvCRP13-6 ATGTGGTCATACCGTGGATGG (17) AGTCCATAGATGTCCAAGACACT (18) 176
본 발명에 사용된 프로브 정보
No. 명칭 Allele 염기서열 (5'→3', 3'-phosphate) (서열번호) 길이
1 VvCRP8-1 A/G CCC GGC G TG CCA TCC TTT GTC ATG AA (19) 26 mer
2 VvCRP8-2 T/G GCA ATT TTG GAG AAG C G G CAA AAA TTG TTG AC (20) 32 mer
3 VvCRP8-3 C/T TTG GGT TAA ACC GCA T GA GGA GGT TGA ATA T (21) 31 mer
4 VvCRP13-1 C/T AGG AAG ACC CAA GAG TG T GTA ACT GG (22) 26 mer
5 VvCRP13-2 C/T GTA TTT CTA AAG GAA T AC CAA CTA TGA TAG AG (23) 32 mer
6 VvCRP13-3 C/T TGA CGC GAT AGT GGT T GA GTT TTC AAA CTC (24) 30 mer
7 VvCRP13-4 C/T ATC CTT CAA CTT TCT GAC TTA TA T GGA CCG A (25) 31 mer
8 VvCRP13-5 C/T GGA CCG A T G AAG TTG TTG ATT ATA GAG A (26) 28 mer
9 VvCRP13-6 T/A GAA GGG TGG CAT G A C AAA CCT TAC TC (27) 26 mer
Allele : 탄저병 감수성 포도 품종(Emerald Seedless 및 Pinot Noir) / 탄저병 저항성 포도 품종(Muscat Bailey A 및 Bailey Alicante A)
4. Real-time PCR
상기 제작된 프라이머와 프로브를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다. 반응 혼합물은 게노믹 DNA(25 ng/㎕) 1 ㎕, 정방향 프라이머(1 pmol) 1 ㎕, 역방향 프라이머(10 pmole) 0.5 ㎕, 5x Evagreen(HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix, Solis Biodyne, Estonia) 4 ㎕, 루나 프로브(10 pmole) 1 ㎕ 및 증류수 12.5 ㎕을 넣어 총 20 ㎕로 맞추고, 잘 섞어준 후 PCR을 수행하였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같이 수행하였다: 초기 변성(denaturation) 95℃, 5분 → 변성 95℃, 20초; 어닐링(annealing) 60℃, 20초; 및 신장(extension) 72℃, 20초;의 과정을 40~45회 반복 → 최종 종결 반응 95℃, 15초/ 40℃, 30초. PCR 반응 종결물은 0.5℃/초 상승 조건으로 50℃에서 90℃까지 온도를 증가시켜 융해(melting) 곡선 분석을 수행하였다. 모든 실험은 각 3회 반복하였으며, 결과는 평균값으로 나타내었다.
실시예 1. 유전형 분석
탄저병 감수성 포도 품종인 Emerald Seedless 및 Pinot Noir와 탄저병 저항성 포도 품종인 Muscat Bailey A 및 Bailey Alicante A 샘플에 대하여 표 1 및 표 2에 나타낸 프라이머와 프로브 세트를 이용하여 Real-time PCR을 통해 유전형 분석(genotyping)을 수행하였다.
그 결과, 도 6 내지 7에 나타난 바와 같이, 탄저병 저항성 포도 품종( Res1(H), Bailey Alicante A(Heterozygote); Res2, Muscat Bailey A)과 감수성 포도 품종(Sus1, Emerald Seedless; Sus2, Pinot Noir) 샘플의 융해 곡선 피크가 명확히 구별되는 것이 확인되었다. 특이한 점은, Bailey Alicante A 품종의 경우 표현형은 포도 탄저병에 대해 저항성을 보였지만, 모든 SNP 위치에서 이형접합성을 보이는 것이 확인되었다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 SNP 마커가 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 정확하게 구별할 수 있는 신규의 분자 마커임을 알 수 있었다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Marker composition for discriminating anthracnose-resistant or sensitive grape cultivar and uses thereof <130> PN19170 <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gttgagttct caaactccat tgc 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aggtaactgt ggtatgcgtc c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaagagactg agttggacta tga 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gaattacttt gagtctagga aagc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctttcctag actcaaagta attc 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtaatgacat ctaccttctg cag 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgaaggcgat caactgcttc tta 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctcagcctta aggatgaaca tgt 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gggagtttgc aggactgtgt a 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcaatccgta atggcttgtc atc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cacaagtgac ttaactagcc ttc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agcaaagagc tcatgtcaaa gga 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atgtggtcat accgtggatg g 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agtccataga tgtccaagac act 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atgtggtcat accgtggatg g 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 agtccataga tgtccaagac act 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atgtggtcat accgtggatg g 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agtccataga tgtccaagac act 23 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 cccggcgtgc catcctttgt catgaa 26 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 gcaattttgg agaagcggca aaaattgttg ac 32 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 21 ttgggttaaa ccgcatgagg aggttgaata t 31 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 22 aggaagaccc aagagtgtgt aactgg 26 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 23 gtatttctaa aggaatacca actatgatag ag 32 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 24 tgacgcgata gtggttgagt tttcaaactc 30 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 atccttcaac tttctgactt atatggaccg a 31 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 ggaccgatga agttgttgat tatagaga 28 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 27 gaagggtggc atgacaaacc ttactc 26

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 22의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 프로브; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 26의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 27의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는 탄저병(anthracnose) 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 탄저병(anthracnose) 감염 의심 포도 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
KR1020190111364A 2019-09-09 2019-09-09 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도 KR102162805B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190111364A KR102162805B1 (ko) 2019-09-09 2019-09-09 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190111364A KR102162805B1 (ko) 2019-09-09 2019-09-09 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102162805B1 true KR102162805B1 (ko) 2020-10-07

Family

ID=72884774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190111364A KR102162805B1 (ko) 2019-09-09 2019-09-09 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102162805B1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101054595A (zh) * 2007-02-05 2007-10-17 西北农林科技大学 一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法
CN100402665C (zh) * 2005-11-30 2008-07-16 辽宁省农业科学院植物保护研究所 葡萄炭疽病生物芯片的制取方法
CN101691604A (zh) * 2009-08-27 2010-04-07 西北农林科技大学 一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法
CN106167798A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 中国农业科学院郑州果树研究所 葡萄抗炭疽病主效qtl的分子标记及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100402665C (zh) * 2005-11-30 2008-07-16 辽宁省农业科学院植物保护研究所 葡萄炭疽病生物芯片的制取方法
CN101054595A (zh) * 2007-02-05 2007-10-17 西北农林科技大学 一种用于葡萄抗黑痘病育种的基因分子标记方法
CN101691604A (zh) * 2009-08-27 2010-04-07 西北农林科技大学 一种检测葡萄抗黑痘病基因的分子标记方法
CN106167798A (zh) * 2016-08-30 2016-11-30 中国农业科学院郑州果树研究所 葡萄抗炭疽病主效qtl的分子标记及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. H. Kim et al., Plant Breeding, 127, p.418-423, 2008.* *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101752658B1 (ko) 더덕 품종 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도
KR101516190B1 (ko) 참외 계통 또는 품종의 구별을 위한 ｓｓｒ 프라이머 세트 및 이들의 용도
KR101011694B1 (ko) 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법
KR102198566B1 (ko) 고구마 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 arms-pcr용 분자마커 및 이의 용도
CN111961750A (zh) 检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用
CN107723378A (zh) 葡萄果实无核主效qtl位点sdl的snp分子标记及应用
KR101073000B1 (ko) Ｓｔｓ 프라이머를 이용한 인삼 품종 판별 방법
KR101699149B1 (ko) 수박의 과형 구별용 dna 마커
KR102186239B1 (ko) 순무의 유전자형 또는 브라시카 라파의 아종 구별용 분자마커 및 이의 용도
KR102163233B1 (ko) 양송이 품종 새정, 새아, 설강 구별을 위한 ssr 프라이머 세트 및 이의 용도
CN108977563B (zh) 基于萝卜全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
KR102150113B1 (ko) 키위 품종 판별용 scar 마커 및 이의 용도
KR101783347B1 (ko) 배의 화분 유무 판별용 caps 마커 및 이의 용도
KR102524050B1 (ko) 다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도
KR102162805B1 (ko) 탄저병 저항성 또는 감수성 포도 품종을 구별하기 위한 마커 조성물 및 이의 용도
KR101946162B1 (ko) 무 품종을 판별하기 위한 snp 마커 및 이의 용도
KR102261896B1 (ko) 들깨 속 식물의 유전적 배경을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20180075451A (ko) 체리 대목 품종 판별 방법
KR101649589B1 (ko) 사과에서 유래된 ssr 프라이머 및 이의 용도
KR102273611B1 (ko) 흰가루병 저항성 호박 자원을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도
KR101359542B1 (ko) 복숭아 품종 식별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101301867B1 (ko) 양파 품종식별용 초위성체 프라이머 세트
KR101993289B1 (ko) 들깨 잎의 보라색 판별용 분자마커 및 이의 용도
KR101301863B1 (ko) 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법
KR102686449B1 (ko) 다래나무의 성 판별용 InDel 분자마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant