KR102186239B1 - 순무의 유전자형 또는 브라시카 라파의 아종 구별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 순무의 유전자형 또는 브라시카 라파의 아종 구별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무; 또는 배추와 순무를 정확하게 판별할 수 있으므로, 강화순무의 순계 육종이 가능할 뿐만 아니라 농가에서 배추와 순무가 혼용되어 재배되는 것을 효과적으로 방지할 수 있을 것이다.

Description

순무의 유전자형 또는 브라시카 라파의 아종 구별용 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating genotype of turnip or subspecies of Brassica rapa and uses thereof}

본 발명은 순무의 유전자형 또는 브라시카 라파의 아종 구별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

배추과(Brassicaceae)는 분류학적으로 애기장대와 같은 과에 속하는 작물로, 십자화과 또는 겨자과라고도 불린다. 배추과 작물들은 각각 극대화된 기관의 형태에 따라 분류되는데, 대표적으로 꽃봉오리가 발달한 꽃양배추(Brassica oleracea var. botrytis)와 브로콜리(B. oleracea var. italica), 줄기조직이 발달한 콜라비(B. oleracea var. gongylodes), 뿌리 기관이 발달된 순무(B. rapa subsp. rapa), 구불구불한 잎 조직이 발달된 배추(B. rapa subsp. pekinensis)와 청경채(B. rapa subsp. chinensis), 단일 정단 봉오리가 발달한 양배추(B. oleracea var. capitata), 다양한 측아조직이 발달된 방울다다기양배추(B. oleracea var. gemmifera) 등이 있다. 배추과 작물은 종 또는 아종 간에 다형성이 매우 높은데, 이는 식물 게놈 내에 가장 빈번하면서 빠른 염색체 대단위 변화를 초래하는 현상을 의미하는 다배체화(polyploidy)에서 그 원인을 찾을 수 있다. 배추과 작물 중 브라시카 라파(Brassica rapa)는 순무, 배추, 청경채, 순무유채 등의 브라시카 라파 아종으로 구성된 식물종이다.

순무(turnip)는 뿌리의 색깔에 따라 백색, 자색, 적색으로 구분되며 대부분 자색 순무가 재배 및 유통되고 있다. 일반 무와 달리 과일처럼 단맛이 난다고 해서 과일 무라고도 불리며, 식감은 참외와 유사하다. 순무는 글루코시놀레이트, 트립토판, 리신 등의 항암물질을 다량 함유하고 있어 암 예방에 효과적인 식재료 중 하나로, 이외에 칼슘, 칼륨, 인, 철분 등의 무기질과 비타민 C, B6, 판토텐산, 엽산 등의 비타민이 다량 함유되어 있으며, 식이섬유도 많아 변비 해소에 효과적이다. 원래 순무는 봄, 가을에 파종하고 여름과 초겨울에 수확하였으나 현재는 품종개량을 통해 연간 재배가 가능하며, 순무의 대표 생산지인 강화도에서 약 80~90%가 생산되고 있다. 그러나 현재 강화도에서 재배되고 있는 순무는 안정화된 품종이 없고 농가에서 자체적으로 채종하여 계통을 유지하고 있기 때문에 뿌리의 색, 형태, 크기 등이 균일하지 못하다. 강화 순무의 차세대 염기서열 분석 결과를 살펴보면 유전체 전반에 걸쳐 이형접합성의 대립유전자가 분포되어 있어 강화 순무의 불균일성이 나타나는 것임을 확인할 수 있다. 이러한 이유로 동형접합 유전자형의 순무 개체를 선발하고 순계 육종을 통해 균일한 특성을 지닌 순무 품종의 개발이 필요하나, 순무는 이형접합성이 높은 식물 중 하나이기 때문에 다양한 표현형의 개체가 발생할 확률이 높으므로, 재배 시작 전 단계에 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무를 구별할 필요성이 있다.

또한, 배추(chinese cabbage)는 무, 고추, 마늘과 함께 사용하는 4대 채소 중 하나로, 김치 외에 국, 샐러드, 무침, 볶음 등 다양한 용도로 활용되고 있다. 일반적으로 재배 시기에 따라 봄배추, 여름배추, 가을배추, 겨울배추로 구분하지만, 이러한 재배 시기뿐 아니라 재배 기간, 지역, 결구(잎이 여러 겹으로 겹쳐서 속이 드는 모양) 형태 등에 따른 약 7가지 품종이 국내에 유통되고 있다. 배추는 수분함량이 약 95%로 매우 높아 원활한 이뇨작용을 도와주며, 열량은 낮고 식이섬유 함유량은 많아 장 활동을 촉진해 변비와 대장암 예방에도 효과적이다. 또한, 칼슘, 칼륨, 인 등의 무기질과 비타민 C가 풍부해 감기 예방과 치료에 효과적이며 특히 배추의 푸른 잎에는 비타민 A의 전구체인 베타카로틴이 많이 함유되어 있어 면역력 강화에 도움을 준다.

순무는 무(Raphanus raphanistrum)와 생김새가 비슷하지만 속(genus)이 다른 식물이며, 실제로는 배추와 매우 유사한 유전자를 가지고 있다. 종래에는 생물의 종 또는 품종을 식별하기 위해 형태적, 이화학적 방법이 사용되어 왔으나, 순무와 배추와 같은 배추과 작물은 염색체 구성이 복잡하여 분속지표가 확립되기 어려워 거의 주관적으로 품종 및 종 판별이 이루어지고 있는 실정이다. 최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다.

InDel(insertion/deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR(simple sequence repeat) 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다. 또한, CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 단형성 PCR 산물에 대한 제한효소 처리로 생성된 다형성 단편이다. 사전에 품종 간에 염기서열의 차가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차이가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA를 가지는 품종과의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.

한편, 한국등록특허 제1955074호에는 '무 판별용 SNP 마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1241482호에는 '배추과 작물의 사코 세포질웅성불임성 판별용 마커 및 그를 이용한 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 순무의 유전자형 또는 브라시카 라파의 아종 구별용 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 이형접합 유전자형 강화순무와 이로부터 만들어진 배가반수체 강화순무를 대상으로 차세대 염기서열 분석을 수행한 후 배추 표준유전체(Chiifu-401)에 맵핑하고 정렬시켜 이형접합성을 나타내는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 확인하였고, 상기 SNP를 기반으로 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 제작한 후 이형접합 유전자형의 순무 개체와 동형접합 유전자형의 배가반수체 순무 개체를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 상기 CAPS 마커가 이형접합 유전자형의 순무와 동형접합 유전자형의 순무를 정확하게 구별할 수 있음을 확인하였다. 또한, 배추 표준유전체와 배가반수체 순무 개체의 게놈 염기서열을 분석하여 SNP에 기반한 CAPS 마커 및 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)을 보이는 염기서열에 기반한 InDel 마커를 제작하여 배추 및 순무를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 상기 SNP 기반 CAPS 마커 및 InDel 마커가 배추(Brassica rapa subsp. pekinensis)와 순무(B. rapa subsp. rapa)를 명확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 7개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 이형접합 유전자형(heterozygotic genotype)과 동형접합 유전자형(homozygotic genotype)의 순무 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 구별용 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 순무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 구별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무를 구별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 21 및 22;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배추(Brassica rapa subsp. pekinensis)와 순무(Brassica rapa subsp. rapa) 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 배추와 순무 구별용 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배추와 순무 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 배추 또는 순무 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 배추와 순무 구별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 배추와 순무를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 개체; 또는 배추와 순무를 정확하게 구별할 수 있으므로 유전적으로 균일하고 안정적이며 형질이 우수한 순무 개체를 육종하는데 매우 유용하게 활용될 수 있으며, 배추과 작물 중 유전적 유사성이 매우 높은 배추와 순무의 유전학적 연구에도 활용될 수 있다.

도 1은 순무의 동형접합 또는 이형접합 유전자형을 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 마커를 이용한 이형접합 유전자형의 강화순무(GH) 및 동형접합 유전자형을 가진 배가반수체 순무 개체(G14, G31 또는 G36)의 PCR 결과이다. H₂O; 제한효소 처리 전.
도 2는 배추와 순무를 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 마커(A) 및 InDel 마커(B)를 이용한 배추(CF), 배가반수체 순무(G14) 및 배추와 순무의 잡종 1세대(F₁)의 PCR 결과이다. H₂O; 제한효소 처리 전.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 이형접합 유전자형(heterozygotic genotype)과 동형접합 유전자형(homozygotic genotype)의 순무 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 이형접합 유전자형의 강화순무 개체와 이로부터 만들어진 배가반수체 계통의 순무(G14)를 대상으로 차세대 염기서열 분석을 수행한 후 배추 표준유전체(Chiifu-401)에 맵핑하고 정렬하여 강화순무 개체의 SNP를 확인한 후, 강화순무의 SNP 정보에서 이형접합성을 보이는 부분들 중 동일한 제한효소에 의해 같은 유전자좌에 위치한 대립유전자좌의 염기서열이 한쪽은 잘릴 수 있고 다른 한쪽은 잘리지 않는 SNP를 선별하고, 선별된 부위를 중심으로 2 Kb의 염기서열 구간 내에 같은 제한효소가 작용할 수 있는 부위가 있는지 확인한 후 그렇지 않은 부위를 증폭시키기 위한 프라이머 세트이다(표 2). 또한, 본 발명의 상기 프라이머 세트에 있어서, 이형접합 및 동형접합은 상동염색체상에서 해당 염기서열 하나의 이형(heterogenous) 또는 동형(homogenous)을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 동형접합 유전자형의 순무는 소포자 배양(microspore culture)을 통해 얻어진 배가반수체(doubled haploid) 계통의 순무를 의미한다. 상기 '배가반수체'는 반수체를 염색체가 배가하도록 한 개체를 의미하는 것으로, 식물에서는 꽃밥배양, 이종간교배 등의 방법에 의해 얻어지는 수컷배우자 유래의 반수체에 콜히친(colchicine)을 처리하여 배수체(2n)가 생성되도록 유도할 수 있다. 유전체 전체에 관해서 유전적으로 동형접합이며, 자가생식성 작물의 육종에서 F₁ 세대의 배가반수체를 이용함에 따라 유전적 고정이 한 번에 가능해져서 육종 연한의 대폭적인 단축에 도움이 된다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 7개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 7개의 프라이머 세트, 즉 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함할 수 있다. 7개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무를 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 14의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 14의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 구별용 프라이머 세트; 증폭 반응을 수행하기 위한 시약; 및 제한효소를 포함하는 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 제한효소는 바람직하게는 BamHI 또는 HindⅢ일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

순무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무 구별용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 순무 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 순무 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다. 본 발명의 순무 유전자형 구별 방법에 있어서, 상기 제한효소는 EcoRI, Bsu36I, HindⅢ, MboⅡ, PstI, SpeI, BamHI, MluI, AluI, DraI, PvuI, XhoI, BclI, TaqI, KpnI 또는 MspI일 수 있고, 바람직하게는 BamHI 또는 HindⅢ일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무를 구별하는 방법에 있어서, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물은 BamHI 제한효소 처리에 의해 절단될 수 있고, 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물은 HindⅢ 제한효소 처리에 의해 절단되어 이형접합 유전자형의 순무와 동형접합 유전자형의 순무로 구별될 수 있다(표 2 참고).

본 발명은 또한, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배추(Brassica rapa subsp. pekinensis)와 순무(Brassica rapa subsp. rapa)를 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 마커 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배추와 순무를 구별하기 위한 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 배추와 순무를 구별하기 위한 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 4개의 배추와 순무 구별용 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 4개의 프라이머 세트, 즉 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 4개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 배추와 순무를 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 15 내지 22의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 15의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 15의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 15 내지 22의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 배추와 순무를 구별하기 위한 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배추와 순무 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 키트는 제한효소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제한효소는 바람직하게는 HindⅢ일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, 상기 배추와 순무를 구별하기 위한 프라이머 세트를 이용하여 배추와 순무를 구별하는 방법을 제공한다. 구체적으로는,

배추 또는 순무 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 배추와 순무를 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 배추와 순무를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 배추와 순무를 구별하는 방법에 있어서, 상기 SNP 기반 CAPS 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 배추와 순무를 구별하는 또 다른 방법은,

배추 또는 순무 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 배추와 순무를 구별하기 위한 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 배추와 순무를 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 배추와 순무를 구별하는 방법에 있어서, 상기 InDel 마커 증폭용 프라이머 세트는 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 배추와 순무를 구별하는 방법에 있어서, 상기 배추 또는 순무 의심 시료는 종자 또는 유묘(새싹 또는 어린모종)를 시료로 사용할 수 있으며, 배추와 순무의 종자 또는 유묘의 외형적 특징은 매우 유사하기 때문에 재배 전에 배추와 순무의 구별이 가능하다면 재배에 소요되는 시간 및 노력이 절감되는 효과가 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 EcoRI, Bsu36I, HindⅢ, MboⅡ, PstI, SpeI, BamHI, MluI, AluI, DraI, PvuI, XhoI, BclI, TaqI, KpnI 또는 MspI일 수 있고, 바람직하게는 HindⅢ일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 강화순무의 유전체 분석 및 분자마커 탐색

강화순무 종자(동원농산종묘(주), 한국)를 파종하여 수확한 후 강화순무 식물체(이형접합 유전자형의 순무)의 잎 부분을 채취하여 사용하였다. 채취된 강화순무의 잎 시료를 대상으로 CTAB 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다.

유전체 분석은 Illumina 시퀀싱 방법으로 생산된 단편(read)에 대하여 manual python code와 trimmomatic 프로그램을 이용하여 필터링(filtering) 및 트리밍(trimming) 과정을 통해 수행되었다. 필터링된 단편은 BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)-MEM을 이용하여 배추 표준유전체에 맵핑하여 정렬하였고, Genome Analysis Toolkit(GATK) 중에서 HaplotypeCaller를 이용하여 SNP와 InDel 영역을 탐색한 후 필터링 과정을 수행하였다. 이러한 과정을 통해 얻어진 SNP 또는 InDel 영역을 이용하여 마커를 제작하였다.

2. CAPS 마커 및 InDel 마커의 검증

*PCR 반응물은 게노믹 DNA 1 ㎕(50 ng), 정방향 프라이머(100 pmol) 1 ㎕, 역방향 프라이머(100 pmol) 1 ㎕, 200 mM의 dNTP(Takara) 2 ㎕, 5 unit의 Taq polymerase(Takara) 0.2 ㎕ 및 증류수를 혼합하여 총 20 ㎕가 되도록 하였다. PCR 증폭 조건은 초기 변성 단계(95℃, 5분)에 이어 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 결합 단계 및 72℃에서 1분 30초간 신장 단계를 조합하여 30 사이클로 구성하였다. CAPS 마커의 경우 증폭된 PCR 산물을 제한효소 BamHI 또는 HindⅢ로 절단시켰다. 제한효소의 반응은 총 30 ㎕에서 이루어졌고, 반응 혼합액은 각각 PCR 증폭산물 6 ㎕, NEB Cutsmart 버퍼 3 ㎕, 제한효소(20 Unit) 1 ㎕ 및 정제수 20 ㎕로 구성되었다.

실시예 1. 이형접합 유전자형과 동형접합 유전자형의 순무를 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 마커 검증

이형접합 유전자형의 강화순무 개체(GH)와 이로부터 만들어진 배가반수체 계통의 순무(G14)를 대상으로 차세대 염기서열 분석을 수행한 후 배추 표준유전체(Chiifu-401, http://brassicadb.org/)에 맵핑하고 정렬하였다. 특히 강화순무의 SNP 정보에서 이형접합성을 보이는 부분들 중 동일한 제한효소에 의해 같은 유전자좌에 위치한 대립유전자좌의 염기서열이 한쪽은 잘릴 수 있고 다른 한쪽은 잘리지 않는 SNP를 선별하였으며, 선별된 부위를 중심으로 2 Kb의 염기서열 구간 내에 같은 제한효소가 작용할 수 있는 부위가 있는지 확인한 후 그렇지 않은 부위를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 제작하였다. 각 대립유전자에 대한 SNP 정보 및 프라이머 세트 정보는 하기 표 1 및 표 2와 같다.

각 대립유전자에 대한 SNP 정보

프라이머 명칭	염색체	위치	유전자형
			allele 1	allele 2
marker GB1	A01	26,029,895	C	T
marker GB2	A02	1,629,193	G	T
marker GB9	A09	13,400,146	A	T
marker GH3	A03	26,717,794	A	C
marker GH4	A04	11,461,885	C	T
marker GH6	A06	15,802,544	C	A
marker GH9	A09	15,350,026	A	T

강화순무 유전자형 구별을 위한 프라이머 세트 정보

프라이머 명칭	서열정보(5'→3') (서열번호)	Tm(℃)	Expected siza(bp)		Restriction enzyme
			Genotype 1	Genotype 2
marker GB1	F: CTTAGGACGTGCGAGGAAGG (1)	59.2	696	696 (547/149)	BamHI
	R: TCCCACGTTCTCCAATGACG (2)	59.1
marker GB2	F: TCGTTAAGACCAGCCACCAC (3)	59.0	736	736 (449/287)
	R: CCAAGCATCCTCTATCCGGG (4)	58.7
marker GB9	F: ACAAGGTAGATGGGGCGTTG (5)	59.1	784	784 (489/295)
	R: AACTCAGCCGTCTCATGTCC (6)	58.8
marker GH3	F: TGCAAAGGCTAGTGGAGAGC (7)	59.1	2,162	2,162 (1,297/865)	HindⅢ
	R: CAGCTACGCGTTTGACGATG (8)	59.1
marker GH4	F: ACCCGCAAACACACAAATGG (9)	58.9	2,156	2,156 (1,272/884)
	R: TCCAGATGATCGTTGAGCCG (10)	58.9
marker GH6	F: CAGCCGCCATTAGAAAAGGC (11)	58.9	2,091	2,091 (1,297/794)
	R: TCATCGGCAAGGGTTGACTC (12)	59.1
marker GH9	F: CACATCGGCCAAGAGGAGAG (13)	59.2	2,086	2,086 (1,244/842)
	R: TAGGGGTGGGCATTTTTCCC (14)	59.0

Genotype 1; 제한효소 인식부위(reconition site) 내에 SNP가 존재하지 않는 경우

Genotype 2; 제한효소 인식부위 내에 SNP가 존재하는 경우

모체로 사용된 강화순무(GH)와 이로부터 만들어진 배가반수체 계통들(G14, G31 또는 G36)을 대상으로 상기 제작된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 제한효소를 처리하여 CAPS 분석을 수행한 결과, 이형접합 유전자형 강화순무(GH)의 경우 제한효소를 인식하지 않는 자리와 인식하는 자리를 모두 갖고 있어 단일 크기의 밴드 및 제한효소의 절단에 의한 2개의 밴드(double-band)를 모두 나타내었으나, 동형접합 유전자형의 배가반수체 순무 계통은 각 계통에 따라 단일 크기의 밴드를 나타내거나 제한효소의 절단에 의한 2개의 밴드를 나타내었다. 특히 마커 GB2, GB9, GH4, GH6 및 GH9의 경우에는 서로 다른 배가반수체 계통 간 유전형의 차이가 있음을 확인할 수 있는 마커였으며, 마커 GB1 및 GH3는 배가반수체 계통 사이에서는 차이를 보이지 않지만 강화순무와 다르게 배가반수체 개체들은 해당 유전자좌에서 동형접합임을 확인할 수 있는 마커임을 확인하였다(도 1A).

또한, 마커 GB2 및 GH9의 PCR 산물에 대한 염기서열 분석을 수행한 결과, 강화순무의 제한효소 작용 부위에서는 피크가 겹쳐져 있었으나, 배가반수체 계통들의 제한효소 작용 부위에서는 하나의 피크만 존재하는 것을 확인하였다(도 1B). 이를 통해, 상기 마커들을 이용할 경우 배가반수체 계통 G14와 G36이 해당 유전자좌에서 동형접합임을 확인할 수 있으므로 순무의 유전자형을 성공적으로 구분할 수 있을 것으로 사료되었다.

실시예 2. 배추와 순무를 구별하기 위한 SNP 기반 CAPS 마커 및 InDel 마커 검증

상기에서 분석된 배추 표준유전체(CF; chiifu-401, http://brassicadb.org/)와 배가반수체 순무(G14) 간의 SNP 정보(표 3)를 이용하여 한쪽 아종에서만 제한효소가 작용할 수 있는 SNP를 탐색하고, 상기 실시예 1의 강화순무 유전자형을 구별하기 위한 마커와 동일한 방식으로 선별 과정을 거쳤다. 또한, 배추 표준유전체(CF)와 배가반수체 순무(G14) 간의 InDel 정보를 이용하여 배추와 순무의 PCR 산물 간에 크기 차이를 확인할 수 있는 부위를 선별하였고, 이 부위를 포함하는 PCR 프라이머 세트를 제작하였다(표 4).

배추와 순무에 대한 SNP 정보

프라이머 명칭	염색체	위치	유전자형
			배추	순무
marker SH1	A03	2,562,110	C	T
marker SH2	A07	9,123,035	G	A
marker SI1	A06	6,836,543~6,837,678	-	300 bp 결실
marker SI2	A07	21,667,591~21,669,221	-	700 bp 결실

배추와 순무 구별을 위한 프라이머 세트 정보

프라이머 명칭	서열정보(5'→3') (서열번호)	Tm(℃)	Expected siza(bp)		Restriction enzyme
			Genotype 1	Genotype 2
marker SH1	F: TCCGTCGTCTGAAACACCAG (15)	57.1	1,076	1,076 (636/440)	HindⅢ
	R: GCCGTATAGTCCCCGTCAAG (16)	57.4
marker SH2	F: CTCAGAGATCGCAAAAGCGC (17)	56.7	2,239	2,239 (1,333/906)
	R: GACGGCCCTATCCAGCTTAC (18)	57.5
marker SI1	F: TGGTGCAGAGAATCCGGTTC (19)	57.3	1,135	~800 (835)	(InDel)
	R: TCGAGCTTGACGTCACAGTC (20)	57.0
marker SI2	F: CGTCGTCATATCCTAGGCGG (21)	57.1	1,630	~900 (930)
	R: TCACTCCGCTGGTTGATGAG (22)	57.0

배추 표준유전체(GF), 배가반수체 계통의 순무(G14) 및 배추와 순무의 잡종 1세대(F₁)에 대하여 상기 제작된 프라이머 세트(서열번호 15 내지 18)를 이용하여 PCR을 수행한 후 제한효소를 처리하여 CAPS 검정을 수행한 결과, 밴드 패턴에 따라 배추와 배가반수체 순무 G14를 구별할 수 있음을 확인하였고, 잡종 1세대는 CF와 G14의 밴드 패턴이 모두 나타나 이형접합 유전자형의 순무 개체임을 알 수 있었다(도 2A). 또한, InDel 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트(서열번호 19 내지 22)를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 순무 게놈 염기서열에서 일부 염기의 결실에 의한 밴드 크기 차이로 인해 CF와 G14를 명확하게 구별하였고, 잡종 1세대에서는 CF와 G14의 밴드 패턴이 모두 나타나 이형접합 유전자형의 순무 개체임을 알 수 있었다(도 2B).

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Molecular marker for discriminating genotype of turnip or subspecies of Brassica rapa and uses thereof <130> PN20177 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cttaggacgt gcgaggaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcccacgttc tccaatgacg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcgttaagac cagccaccac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccaagcatcc tctatccggg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acaaggtaga tggggcgttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aactcagccg tctcatgtcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgcaaaggct agtggagagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cagctacgcg tttgacgatg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acccgcaaac acacaaatgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tccagatgat cgttgagccg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cagccgccat tagaaaaggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcatcggcaa gggttgactc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cacatcggcc aagaggagag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 taggggtggg catttttccc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tccgtcgtct gaaacaccag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gccgtatagt ccccgtcaag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctcagagatc gcaaaagcgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gacggcccta tccagcttac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tggtgcagag aatccggttc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcgagcttga cgtcacagtc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgtcgtcata tcctaggcgg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcactccgct ggttgatgag 20

Claims (8)

1. 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배추(Brassica rapa subsp. pekinensis)와 순무(Brassica rapa subsp. rapa)를 구별하기 위한 SNP(single nucleotide polymorphism) 기반 CAPS 마커 증폭용 프라이머 세트로서,
   상기 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 표준유전체(chiifu-401, http://brassicadb.org/) A03 염색체의 2,562,110번째에 위치하는 C 또는 T 염기를 검출할 수 있고; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 A07 염색체의 9,123,035번째에 위치하는 G 또는 A 염기를 검출;할 수 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
2. 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배추(Brassica rapa subsp. pekinensis)와 순무(Brassica rapa subsp. rapa)를 구별하기 위한 InDel(insertion/deletion) 마커 증폭용 프라이머 세트.
3. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 제한효소 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배추와 순무 구별용 키트.
4. 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배추와 순무 구별용 키트.
5. 배추 또는 순무 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
   상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
   상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 배추와 순무를 구별하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 제한효소는 HindⅢ인 것을 특징으로 하는 배추와 순무를 구별하는 방법.
7. 배추 또는 순무 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는 배추와 순무를 구별하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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