KR102524050B1

KR102524050B1 - 다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102524050B1
Application number: KR1020210078106A
Authority: KR
Inventors: 김대일; 김정; 오세원; 이동윤; 오지현; 조혜미; 김도영; 한현대
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2023-04-19
Also published as: KR20220168405A

Abstract

본 발명은 다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 CAPS 분자마커는 다래 유전자원의 배수성 또는 생육단계와 관계없이 성별의 판별이 가능하므로, 다래 유전자원을 이용하는 육종 과정에서 과실과 종자를 맺는 암나무 계통 또는 수분수가 되는 수나무 계통의 조기 선발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating sex of Actinidia arguta and uses thereof}

본 발명은 다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

다래나무(Actinidia arguta)는 다래나무과 다래나무속에 속하는 대표적인 암수딴그루(자웅이주) 식물로, 암나무와 수나무로 구분된다. 다래는 보통 암나무만 심어 과실을 생산하는데, 주변에 있는 수나무로부터 꽃가루를 받지 못하거나 인위적으로 꽃가루를 묻혀주지 않으면 스스로 열매를 맺을 수 없고, 수나무만 있는 경우에도 열매가 열리지 않는다. 다래나무의 암수 구별은 잎이나 가지 모양으로는 구별이 어려워 꽃 기관의 생김새로 확인을 해야하기 때문에 육종 초기에 암나무 또는 수나무 계통을 선발하는 것은 다래의 육종에서 중요한 문제 중 하나이다.

다래는 내한성이 강하고, 비타민과 무기질, 식이섬유 등의 함량이 높아 잠재적인 효용 가치가 높은 종이다. 다래를 교배친으로 하는 육종을 통해 고품질의 키위를 생산할 수 있고, 재배종의 획일화로 인한 유전적 다양성 감소도 해소할 수 있다.

최근에는 분자표지를 이용한 MAS(marker assisted selection)에 의하여 다수의 유용 유전자들을 집적한 내병충성, 내재해성, 다수성 우량 품종의 개발 등이 이루어지고 있다. 분자표지를 이용하면 유전 현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 하기 때문에 그 수적 제한성이 적으며, 식물의 발육 단계와 관계없이 안정되고, 모든 조직에서 탐지할 수 있으며, 환경에 영향을 받지않고 유전자 간의 상위 작용이나 다면 발현에 의한 영향을 받지 않을 뿐만 아니라, 공우성 또는 우성 표지를 선택하여 사용할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이러한 분자표지가 개발되어서 주요 작물에 대한 게놈 유전자 지도 작성이 활발하게 진행되고 있으며, 육종의 선발과정에서 실제적으로 활용되고 있다. 처음 분자표지에 대한 연구보고는 주로 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 표지에 대한 연구가 많았으나, 이러한 장비와 시간이 많이 소요되는 기술은 퇴조하고, PCR을 이용한 RAPD(Random amplified polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), SSR(Simple sequence repeat), SNP(Single nucleotide polymorphism)와 같은 다양한 분자표지 탐지 기술이 폭넓게 이용되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1716021호에 '은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 이를 이용한 암, 수 구별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0685518호에 '아스파라거스 암수판별용 프라이머 및 아스파라거스 암수판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 다래의 성 판별용 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 다래 유전자원 33점(female 12점, male 21점)으로부터 게놈 DNA를 추출하고 다래 참조유전체 서열에 재정렬하여 SNP를 추출한 후 상기 추출된 SNP 중에서 성염색체로 알려져 있는 25번 염색체에 위치하는 SNP를 선별하였다. 상기 선별된 SNP 중에서 성별과 밀접한 연관성을 보이면서 제한효소 인식서열에 포함되는, 25번 염색체 10,236,410 bp 위치에 존재하는 SNP에 기반한 CAPS 마커를 개발하였으며, 상기 CAPS 마커가 다래의 성별을 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 다래(Actinidia arguta)의 성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 다래의 성 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 다래 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 다래의 성 판별방법을 제공한다.

본 발명의 CAPS 분자마커는 다래 유전자원의 배수성 또는 생육단계와 관계없이 성별의 판별이 가능하므로, 다래 유전자원을 이용하는 육종 과정에서 과실과 종자를 맺는 암나무 계통 또는 수분수가 되는 수나무 계통의 조기 선발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 다양한 다래 유전자원에 대한 GBS 분석을 통해 탐색된 SNP 중에서 필터링된 SNP를 이용하여 작성된 계통수로, 다래의 male 유전자원들은 파란선으로, female 유전자원들은 빨간선으로 표시하였다.
도 2는 다래의 성 염색체로 알려진 25번 염색체에 위치하는 성 연관 후보 SNP 정보를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 CAPS 마커를 이용하여 다래의 male 및 female 유전자원을 대상으로 PCR을 수행한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 다래(Actinidia arguta)의 성 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는 서열번호 1 및 2의 각 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 따른 프라이머 세트는 바람직하게는 CAPS 프라이머 세트이다. 상기 용어 "CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)"는 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 개체간 다형성 PCR(Polymerase chain reaction) 산물에 제한효소를 처리하여 생성된 다형성 단편을 의미한다. 사전에 품종 간 염기서열의 차이가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 표지에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차이가 없으나, 유전자 내부의 서열은 다르기 때문에 그 서열의 차이를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA를 보유한 품종과의 차이를 구별할 수 있으며, 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소를 포함하는 다래의 성 판별용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명의 조성물 또는 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있으며, 상기 제한효소는 바람직하게는 MboI일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

다래 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 다래 성 판별방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 다래 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 다래의 성을 판별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "제한효소"란 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제로서 특수한 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 선택되어진 프라이머 세트를 기반으로 PCR를 수행하고 PCR 정제 키트로 정제한 후 프라이머와 조합인 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 다래의 성 판별방법에 있어서, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 증폭된 증폭 산물이 제한효소 MboI 처리에 의해 절단되지 않아 300 bp 크기의 밴드를 나타내면 암나무 계통으로 판별할 수 있고, 증폭 산물이 제한효소 MboI 처리에 의해 절단되어 153/147 bp 크기의 밴드를 나타내면 수나무 계통으로 판별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 게놈 DNA 추출

실험에 사용된 33점의 다래 유전자원은 국립원예특작과학원 남해출장소에서 제공받았다(표 1). 33점의 다래 선단부 덩굴에서 채취한 유엽을 증류수로 세척하고 개별포장하여 -70℃에서 보관하였다. Plant DNeasy Mini Kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였고, 추출한 게놈 DNA의 농도와 순도는 DS-11 Spectrophotometer(DeNovix, 미국)를 이용하여 확인하였으며, 10 ng/㎕로 정량하였다.

본 발명에 사용된 다래 유전자원

학명	성별	유전자원
Actinidia arguta	female	K5-1-8, K5-1-12, K5-2-3, K5-2-13, K5-2-18, K5-4-7, K5-7-3, K5-7-5, K5-10-1, K5-10-5, K5-12-6, 치악
Actinidia arguta	male	K5-2-22, K5-3-3, K5-3-6, K5-3-7, K5-3-8, K5-3-12, K5-3-13, K5-3-18, K5-4-8, K5-5-1, K5-5-12, K5-5-14, K5-6-10, K5-9-1, K5-9-8, K5-11-1, K5-11-2, K5-11-3, K5-11-8, K5-13-6, K5-14-1

2. 다래의 성 연관 후보 SNP 선발

2.1. GBS 리드 재정렬 및 SNP 필터링

선행연구(Horticulture, Environment, and Biotechnology., 2019, 60:105-114)를 통해 얻은 다양한 다래 유전자원의 GBS(Genotyping-by-sequencing) 리드(read)를 염색체 수준에서 어셈블리된 참조유전체(BMC Genomics, 2018, 19:257)에 재정렬(re-alignment)하였다. 재정렬을 통해 추출된 SNP 101,301개의 필터링은 다음과 같은 기준으로 수행하였다.: (1) minor allele 빈도가 5% 이상일 것, (2) missing data가 10% 이내일 것.

도 1은 필터링된 SNP 40,099개를 이용하여 MEGA7 프로그램에서 작성된 다래(A. arguta) 유전자원들의 계통수이다. 다래의 male 유전자원들은 파란선으로, female 유전자원들은 빨간선으로 표시하였다. 작성된 계통수는 성별에 따라 명확한 차이를 보였으며, 이를 통해 GBS 분석을 통해 발굴된 SNP들을 다래의 성 판별 분자표지 개발의 기반으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

2-2. 성 연관 후보 SNP 선발

상기 필터링된 SNP 중에서 성염색체로 알려져 있는 25번 염색체에 위치하는 SNP 1,239개를 선발하였다. 이후 성별과 밀접한 연관성을 보이는 성 연관 후보 SNP(도 2)를 다음과 같은 기준으로 선발하였다.: (1) 각 성별에서 가장 높은 빈도를 보이는 염기가 서로 다를 것, (2) 기준이 되는 염기가 각 성별 내 유전자원들의 50% 이상일 것.

선발된 21개의 성 연관 후보 SNP의 위치를 중심으로 참조유전체(GenBank accession No. CM009678.1)로부터 약 600 bp의 인접 서열(flanking sequence)을 추출하였다. 참조유전체 상의 SNP 위치와 검출(calling)된 참조 대립유전자(reference allele)의 염기가 일치하지 않는 경우를 제외하여, 최종적으로 총 13개의 SNP를 CAPS 분자표지 제작에 이용하였다.

3. 성 판별 분자마커 디자인 및 적용

3.1. 성 연관 후보 SNP 기반 분자마커 디자인

최종 선발된 13개의 성 연관 후보 SNP 중에서 제한효소 인식서열에 포함되는 SNP 9개를 확인하였고, 제한효소 인식서열에 포함되지 않는 SNP 4개는 분석에서 제외하였다. 해당 인식서열을 절단하는 제한효소는 SNP의 인접서열과 NEBcutter를 이용하여 탐색하였다. 이후 프라이머는 다음과 같은 기준으로 설계되었다.: (1) SNP 위치를 기준으로 5' 및 3' 방향으로 99 bp 범위 이내에 프라이머가 설계되지 않을 것, (2) PCR 산물 크기가 300~600 bp일 것, (3) 프라이머 크기가 20 bp일 것, (4) 프라이머 Tm이 60℃에 근접할 것, (5) 프라이머 GC 함량이 50%에 근접할 것, (6) 제한효소 digestion 진행 후 성별 간 다형성을 나타내는 단편의 크기가 최소 20 bp 이상일 것.

3.2. CAPS 분자마커 적용

다래 유전자원(female 12점, male 21점)을 대상으로 디자인된 성 판별 후보 분자마커(도 2)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응물은 Taq polymerase 10 ㎕, 10 ng/㎕의 DNA 4 ㎕, 10 pmole/㎕의 정방향 프라이머 2 ㎕와 역방향 프라이머 2 ㎕ 및 TDW(triple distilled water) 2 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕가 되도록 하였다. PCR은 전변성(pre-denaturation) 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 60℃ 1분, 신장(extension) 72℃ 2분의 과정을 총 33회 반복; 최종 신장(final extension) 72℃ 3분의 조건으로 수행하였으며, PCR을 3회 수행하여 총 60 ㎕의 PCR 산물을 생산하였다. 이후 Accuprep PCR/Gel Purification Kit(BIONEER, 한국)를 이용하여 PCR 산물을 정제하였다.

제한효소 digestion 과정은 총 50 ㎕의 반응물(DNA 1 ㎍, 제한효소 1 ㎕, enzyme buffer 5 ㎕ 및 TDW)을 이용하여 수행되었으며, 배양 조건은 각 제한효소의 프로토콜에 따라 수행하였다. 제한효소 처리 후 37℃에서 15분 배양하고, 65℃에서 20분 동안 배양하는 과정(heat inactivation)을 통해 제한효소를 불활성화시켰으며, digestion product 15 ㎕와 6X loading buffer 6 ㎕를 혼합하여 2% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 다형성을 확인하였다.

그 결과, 25번 염색체의 10,236,410 bp 위치에 있는 SNP를 기반으로 제작된 CAPS 분자표지를 이용하였을 때 다래의 성별에 따라 다형성이 확인되었으며, 이러한 CAPS 마커는 CBk25ca01로 명명하였다(표 2). 제한효소 MboI의 인식서열은 5'-GATC-3'이며, 25번 염색체의 10,236,410 bp 위치에서 염기 G를 인식하여 digestion이 진행된다. CBk25ca01의 기반이 되는 SNP 위치에서 male 유전자원들은 염기 G를 나타내어 digestion이 발생하고, female 유전자원들은 alternative allele인 염기 A를 나타내어 digestion이 발생하지 않는다.

본 발명의 CAPS 마커 정보

명칭	서열(5'→3') (서열번호)	Tm (℃)	제한효소	expected size (bp)
CBk25ca01	F:GTCAACCGAACAGGGAGAAA (1)	60	MboI	Male : 153/147 Female : 300
	R:AGCCAAGCAGGAAGAACAAA (2)

실시예 1. 본 발명의 CAPS 분자마커 검증

본 발명의 CBk25ca01 마커를 이용하여 다양한 다래 유전자원(female 12점, male 21점)을 대상으로 PCR을 수행한 결과, female 유전자원에서는 제한효소 MboI에 의해 절단되지 않아 300 bp 크기의 밴드를 나타내었고, male 유전자원에서는 제한효소 MboI에 의해 절단되어 153/147 bp 크기의 밴드를 나타내었다. 다만, MboI에 의해 절단된 153 bp와 147 bp의 두 단편은 크기 차이가 적어 단일 밴드로 보였다(도 3).

그리고, 도 3의 결과에서 female 유전자원에서 나타날 것으로 예측되었던 300 bp의 밴드와 male 유전자원에서 나타날 것으로 예측되었던 153/147 bp의 밴드가 서로 다른 성별의 유전자원에서도 흐리게 검출되었으나, 이는 다래 유전자원이 동질 4배체이기 때문에 일부 대립유전자들의 변이로 인한 유전자형 차이에 의한 것으로 사료되었고, 대부분 female 유전자원에서는 300 bp 크기의 밴드가, male 유전자원에서는 153/147 bp 크기의 밴드가 가장 선명하게 보였다. 또한, 100 bp 부근에서 72 bp에 해당하는 밴드가 검출되었는데 이는 male과 female 유전자원에서 모두 발현되는 internal control에 해당하는 밴드이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discriminating sex of Actinidia arguta and uses thereof <130> PN21146 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtcaaccgaa cagggagaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agccaagcag gaagaacaaa 20

Claims

삭제
서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 제한효소 MboI를 포함하는 다래(Actinidia arguta)의 성 판별용 키트.
삭제
제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
다래 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭 단계의 산물을 제한효소 MboI로 절단하는 단계; 및
상기 제한효소 절단 단계의 산물을 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계;를 포함하는 다래(Actinidia arguta)의 성 판별방법.
삭제