KR101876273B1

KR101876273B1 - 배추 뿌리혹병 판별용 분자마커 및 이를 이용한 배추 뿌리혹병 판별방법

Info

Publication number: KR101876273B1
Application number: KR1020170101881A
Authority: KR
Inventors: 노일섭; 박종인; 양기웅; 김회택; 정희정
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2018-07-09

Abstract

본 발명은 배추 뿌리혹병 판별용 분자마커 및 이를 이용한 배추 뿌리혹병 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분자마커를 이용하여 뿌리혹병 race 2 또는 race 4을 판별함으로써 간단하고 정확하게 배추 뿌리혹병을 판별할 수 있으므로, 배추 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

배추 뿌리혹병 판별용 분자마커 및 이를 이용한 배추 뿌리혹병 판별방법 {Molecular marker for selecting clubroot of Chinese cabbage and selection method using the same molecular marker}

본 발명은 배추 뿌리혹병(clubroot disease) 판별용 분자마커 및 이를 이용한 배추 뿌리혹병 판별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 배추과 작물에서 심각한 병해를 주는 뿌리혹병의 리보좀 DNA를 동정하여 뿌리혹병 race2 또는 race4를 판별할 수 있는 분자마커 및 이를 이용한 배추 뿌리혹병 판별방법에 관한 것이다.

뿌리혹병(clubroot disease)은 무사마귀병 또는 근류병이라고도 불리는 토양 전염병으로서, 반드시 살아있는 식물체 내에서만 증식이 가능한 절대 기생균의 일종인 플라스모디오포라 브라시케 워론(Plasmodioophora brasicae WORON.)에 의해 발병된다. 1887년 워런인(Woronin)에 의해서 최초로 보고된 이래, 영국, 프랑스 등 유럽 및 캐나다, 미국 등 미주대륙에서 발생하여 많은 피해를 주고 있으며, 발생생태, 방제방법 그리고 저항성 품종 육성에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 우리나라의 경우, 1928년 수원과 서울에서 최초로 발병했다는 기록이 보고된 이후 크게 문제시되지 않았으나, 최근 경기와 강원 등 배추 주산단지에서 발생이 급증하고 있지만 발생생태, 품종 저항성검정, 방제체계에 대해서는 일부 보고만 있을 뿐이다.

배추과 작물에서의 뿌리혹병 저항성 품종 육성은 초기에는 교배에 의해 저항성을 도입하고 저항성이 도입된 후대를 선발, 세대진전하여 계통이나 품종을 육성하는 방법을 주로 이용해왔다. 또한 저항성 인자가 동일 작물에는 없거나 저항성 정도가 낮을 경우 종간잡종에 의해 종이 다른 작물에서 안정적인 저항성을 도입하려는 경우가 종종 있는데, 순무(Brassica rapa L.)에서 저항성을 도입하여 저항성 품종을 육성한 사례가 보고되고 있다. 그러나 뿌리혹병은 변이가 심하여 포장에서 발병 정도를 보고 저항성을 검정할 경우 선발기준이 명확하지 않고 세대진전에 많은 시간을 소요하게 되므로 보통 저항성 품종 육성 기간이 10년 이상 소요되는 것이 보통이다. 그러나 많은 시간과 경비를 들여 육성한 저항성 품종의 저항성이 안정적으로 유지되는 경우는 그리 많지 않아 병원균의 변이나 지역에 따라 저항성이 붕괴되는 현상이 자주 발생한다.

국내에서 배추는 가장 중요한 채소 작물 중 하나로 다양한 기능성 물질을 함유하고 있다. 최근에 뿌리혹병이 심하게 발생하여 배추 품질을 떨어뜨리거나 생산량 감소를 초래하고 있다. 뿌리혹병은 활물기생으로 병든 조직에 휴면포자를 형성하여 7년 이상 생존한다. 이러한 뿌리혹병균은 기주의 종 및 계통에 따라 다양한 병원성을 보인다. 현재 배추과 작물의 뿌리혹병균의 동정은 양배추 2품종과 rutabaga 2품종을 이용하여 16개 레이스를 구분하는 williams 방법을 주로 사용한다.

뿌리혹병 저항성 유전자에 관한 연구가 많이 이루어졌으나, 저항성 유전자의 정확한 위치가 알려지지 않았다. 그 중 Suwabe 등이 Brassica rapa L. 의 두 개의 뿌리혹병 저항성 유전자 Crr1 및 Crr2와 그 표지에 대하여 보고하였고(Suwabe,K. et al., 2003, Theor Appl Genet 107:997-1002), Hirai 등은 뿌리혹병 저항성 유전자 Crr3에 대한 표지에 대하여 보고하였다(Hirai, M. et al., 2003, Theor Appl Genet). 또한 Matsumoto 등이 Brassica rapa L.의 두 개의 뿌리혹병 저항성 유전자 CRk 및 CRc와 그 표지에 대하여 보고하였다(Matsumoto et al.. 2008, Theor. Appl. Genet.). 한국특허 제10-490483호에는 무사마귀병 내성 식물의 효과적 선발을 위한 유전자 마커, 프라이머 키트 및 무사마귀병 내성 식물의 선발 방법이 개시되어 있다. 하지만 뿌리혹병은 다양한 race를 가지고 있어 이에 따른 저항성 품종을 개발하는데 많은 어려움이 있다. 따라서, 배추 뿌리혹병을 판별할 수 있는 분자마커 (molecular marker) 개발은 이러한 난점 해결에 있어서 시급하고 중요한 사항이다.

단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 개체마다 차이를 나타내는 외형적 특성, 유전병의 원인, 맞춤약 처방 등 유전정보상의 중요한 실마리를 제공하므로 유전정보학문의 초기부터 많은 연구가 이루어져왔다. 특히 현재까지 사람의 게놈에서 20만개 이상의 단일염기다형성 부위(SNP)가 발견되었으며, 점차 그 양은 엄청난 속도로 축적되고 있다(Wang, D.G., et al., 1998, Science, 280:1077-1082.). 이러한 염기서열의 변화는 비암호화 영역(non-coding region)에서 가장 높게 나타나며, 암호화 영역(coding region) 안에서는 인트론 영역이 엑손 영역에 비해 서열변화의 정도가 높은 것으로 알려져 있다(Ching, A., et al., 2002, BMC Genet., 3:19.; Van Deynze, A.E., et al., 2007b, In Plant and Animal Genome XV. San Diego, CA. Scherago International.). 즉, 인트론의 서열은 서로 다른 종간에도 동일한 형태로 보존되어 있는 경우가 많기 때문에 SNP를 찾기 위하여 인트론이나 비암호화 영역으로부터 SNP를 만드는 방법이 이용된다(Fourmann, M.P., et al., 2002, Theor. Appl. Genet., 105:1196-1206.). 이러한 염기서열의 차이를 이용한다면 매우 가까운 품종 간에도 구분이 가능한 분자마커를 개발할 수 있다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 배추 뿌리혹병 판별용 분자마커를 제공하기 위한 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 배추 뿌리혹병 판별용 프로브를 제공하기 위한 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 또다른 기술적 과제는 배추 뿌리혹병을 판별하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 세트, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별을 위한 분자마커를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별을 위한 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 배추 뿌리혹병 균주로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프로브를 사용하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브(melting curve)를 분석하여 확인하며, 상기 멜팅 커브가 68℃에서 확인되는 경우 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4를 판별하는 것을 특징으로 하는 판별방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 배추 뿌리혹병 균주로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프로브를 사용하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브(melting curve)를 분석하여 확인하며, 상기 멜팅 커브가 64℃에서 확인되는 경우 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4를 판별하는 것을 특징으로 하는 판별방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 배추 뿌리혹병 균주로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프로브를 사용하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브(melting curve)를 분석하여 확인하며, 상기 멜팅 커브가 64℃에서 확인되는 경우 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4를 판별하는 것을 특징으로 하는 판별방법을 제공한다.

뿌리혹병은 활물기생으로 병든 조직에 휴면포자를 형성하여 7년 이상 생존한다. 이러한 뿌리혹병균은 기주의 종 및 계통에 따라 다양한 병원성을 보인다. 현재 배추과 작물의 뿌리혹병균의 동정은 양배추 2품종과 rutabaga 2품종을 이용하여 16개 레이스를 구분하는 williams 방법을 주로 사용하고 있다.

리보솜 DNA는 매우 안정적으로 대단위체와 소단위체로 분리되어 있으며, 두 단위체가 결합하여 단백질 합성을 수행한다. 리보솜 DNA는 매우 안정적으로 보존되어 있어 많은 연구자들이 다양한 동식물의 분류에 활용하고 있다. 또한, Niwa et al., (2011)도 리보솜 DNA의 염기서열을 활용하여 일본 지역내의 다양한 뿌리혹병 균을 동정하였다. 본 발명에서는 Niwa et al., (2011)의 rDNA 염기서열을 활용하여 국내 뿌리혹병 균의 염기서열을 확인하고 다형성을 보이는 서열을 활용하여 뿌리혹병 균을 동정하였다.

본 발명에서는 기존 보고된 뿌리혹병 병원성과 새로운 뿌리혹병 병원성을 구분할 수 있는 분자마커를 개발하였으며, 또한 williams race 중 race 2 또는 race 4를 분리된 횡성과 연천 균주를 확인할 수 있는 분자마커 3점을 개발하였다.

본 발명에서는 기존 보고된 뿌리혹병과 새로운 뿌리혹병을 구분할 수 있는 분자마커를 개발하였으며, 또한 williams race 중 race 2로 분리된 횡성과 연천 균주 또는 race 4로 분리된 해남 2를 확인할 수 있는 분자마커로서 3가지의 프라이머 세트로 이루어진 뿌리혹병 판별용 분자마커를 개발하였다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는 효소 (예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소 (예를 들어, P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 비오틴 (biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체 (hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 뿌리혹병의 확인은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR, quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR), 웨스턴 블롯(western blot), DNA 마이크로어레이(microarray) 등과 같이 당 업계에 공지된 다양한 DNA 분석을 이용하여 확인할 수 있으며, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 서열분석, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용할 경우, 뿌리혹병 품종에서는 388bp의 증폭 산물을 확인할 수 있다. 또한, 서열분석 방법은 Sanger 방법, 마이크로 전기영동 서열분석, 파이로 서열분석, 나노 포어 단일 DNA 서열분석 등을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기 (Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 분자마커를 이용하여 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 를 판별함으로써 보다 간단하고 정확하게 배추 뿌리혹병을 판별할 수 있으므로, 배추 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 뿌리혹병 균의 수집 지역을 나타낸 지도이다.
도 2은 뿌리혹병 균주의 rDNA 분석결과를 도식으로 나타낸 것이다.
도 3A는 뿌리혹병 rDNA 염기서열 중 SSU(small subunits)의 인트론의 변화를 나타낸 것이고, 도 3B는 SSU를 도식으로 나타낸 것이다.
도 4는 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별용 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 HRM 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 뿌리혹병 지역별 분류

본 발명에서는 이전의 Jo et al., (2011)의 논문에서 분리한 isolates를 활용했다. Jo et al.,(2011)에서 횡성, 연천은 레이스 2, 해남2는 레이스 4, 대전, 서산은 레이스 5, 괴산, 강릉, 정선, 평창은 레이스 9번으로 동정하였다. 이 중 해남1은 병리 검정 결과가 정확하게 판별되지 않았음을 확인하였고, 전반적으로 9지역에서 williams 방법으로 레이스 2, 4, 5, 9번을 동정하였음을 보고하였다. 또한, Hatakeyama et al.,(2004)는 뿌리혹병 저항성 배추 품종인 'Akimeki'로 병원성을 4 group으로 결정했는데 이를 활용하여 국내 뿌리혹병 균도 기존의 병원성과 변이 병원성으로 다시 그룹을 지었다. 기존의 병원성은 강릉1, 강릉2, 해남1, 괴산, 횡성으로 나타났고, 변이 병원성은 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이 연천, 해남2, 서산, 대전, 평창, 금산으로 구분했다. 배추 불암3호 품종으로 한국화학연구소에서 받은 다양한 균주를 증식하였다. 분양받은 균주는 강릉1, 강릉2, 횡성, 연천, 해남1, 해남2, 대전, 금산, 서산, 정선, 괴산으로 11 지역의 균주로 전반적인 실험을 수행하였다. 도 1은 뿌리혹병 균의 수집 지역을 나타낸 지도이다.

윌리엄스 레이스 분류
윌리엄스 레이스	Race 1	Race 2	Race 4	Race 5	Race 9
동정 지역	강릉2	횡성, 연천	해남2	대전, 금산, 서산	강릉1, 정선, 괴산

배추 저항성 품종을 이용한 병증 분류
병원성 분류	기존의 병원성	변이 병원성-1	변이 병원성-2	변이 병원성-3
동정 지역	강릉1, 강릉2, 해남1, 횡성, 괴산	연천, 평창	대전, 금산	서산, 해남2

< 실시예 2> 뿌리혹병 rDNA 분석

뿌리혹병 균의 접종방법으로는 뿌리혹병 균을 증류수로 수차례 세척하여 이물질을 제거한 후 2겹의 가제로 여과하여 식물조직을 제거한 후 뿌리혹병균의 포자 현탁액을 준비하였으며 광학현미경 하(300배)에서 hemocytometer를 이용하여 휴면포자의 수를 측정하였다. 접종한 뿌리혹병 균의 농도는 약 8 X 10⁷ 로 접종하여 뿌리혹병 균을 증식하였다.

뿌리혹병 균의 DNA는 증류수로 뿌리혹을 수차례 세척하여 이물질을 제거한 후 2겹의 가제로 여과하여 식물조직을 제거한 후 막사사발에 넣고 액체질소를 이용하여 곱게 간 후, DNeas Plant Mini Kit(QIAGEN, Cat No. 69104)의 방법으로 genomic DNA를 추출하였다.

PCR 반응 방법으로 DNA는 각 100ng을 사용하였고, 프라이머는 각 10pmol 로 희석하여 사용하였다. Taq 중합효소 및 PCR 완충액은 ㈜제넷바이오 프리믹스(Cat. No. G2002)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 조건으로는 94℃에 3분 반응 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응하여 34번 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 반응하였다. PCR 증폭이 끝난 생산물은 1.2% 아가로스 겔에 블루망고 0.5μg/mL을 첨가하여 UV상에서 밴드를 확인하였다.

정제한 DNA는 PCR^® TOPO TA vector(Invitrogen, USA)에 리게이션(ligation)한 후 유전자 정제키트(plasmid purification kit, Promega)를 사용하여 벡터를 정제하였다. 상기 정제된 벡터는 표 3에서 합성한 프라이머 세트를 이용하여 동일한 PCR 조건으로 유전자를 증폭한 후 EtBr(ethidium bromide) 0.5㎍/㎖이 혼합된 1.2% 아가로스 겔에 전기영동한 후 UV 상에서 밴드를 확인하였다. 또한, 상기 정제된 벡터는 마크로젠(Macrogen, korea)에 시퀀싱(sequencing)을 의뢰하여 분석하였다.

	정방향 (F) 및 역방향 (R)	위치	생산물 크기
CR_rDNA 1	F: GGTTGATCCTGCCAGTAGTC (서열번호1) R: GAAGCGATTCGGGCATAGAG (서열번호2)	6774	768
CR_rDNA 2	F: CCTATGCTAATCTCGTGGCG (서열번호3) R: TAAGAAGTCACGGACCTAGG (서열번호4)	7282182	1454
CR_rDNA 3	F: TTATGCCTATGCCTTCCCGG (서열번호5) R: GAAACACGCAGCTGGAGTCGC (서열번호6)	21643192	1028
CR_rDNA 4	F: TCCGTAGGTGAACCTGCGGA (서열번호7) R: CCCATTCTGACCTAGGCCAA (서열번호8)	30804142	1062
CR_rDNA 5	F: TTGGCCTAGGTCAGAATGGG (서열번호9) R: ATGCGGTTATGAGTACGACCA (서열번호10)	41105606	1496
CR_rDNA 6	F: CAGGTTCATATTCCTGAACC (서열번호11) R: CGTTCAAATCAAGTCGTCTAC (서열번호12)	53466981	1635

뿌리혹병 동정지역	NCBI 등록번호
강릉 1	KX430457
연천	KX430458
대전	KX430459
해남 2	KX430460
서산	KX430461
평창	KX430462
강릉 2	KX430463
해남 1	KX430464
횡성	KX430465
금산	KX430466
괴산	KX430467

도 2는 뿌리혹병 균주의 rDNA 분석결과를 도식으로 나타낸 것으로, 뿌리혹병 rDNA 염기서열을 확인하기 위한 프라이머 작성 지역 및 생산물의 시작점과 끝을 보여준다. 여기에서, SSU는 작은 부차적 단위를 나타내고; LSU는 큰 부차적 단위를 나타내고; ITS는 내부 전사 영역을 나타내고; IGS는 유전자간 영역을 나타내고; CR_DNA 1 내지 6은 목표 지역 클로닝으로 위해 개발된 마커 순서를 나타낸다.

전반적인 뿌리혹병 rDNA의 전체 염기서열을 확인하기 위해 NCBI에 등록되어 있는 AB526843.1의 염기서열을 활용하여 6점의 프라이머를 작성하였으며, 상기 작성한 프라이머를 이용하여 클로닝(cloning) 및 시퀀싱(sequencing)을 수행하였다. 결과적으로 거의 완벽한 뿌리혹병의 rDNA를 완성하였으며, 이를 활용하여 11 지역에서 수집한 균의 다형성을 확인하였다.

도 3A는 뿌리혹병 rDNA 염기서열 중 SSU(small subunits)의 인트론의 다형성을 나타낸 것으로, 여기에서 각 숫자는 SSU의 크기와 인트론 위치를 나타내고, 도 3B는 SSU를 도식으로 나타낸 것으로, 여기에서 빨간색 숫자는 인트론 1의 위치를 나타내고, a;강릉1, b;연천, c;대전, d;해남2, e;서산, f;평창, g;강릉2, h;해남1, i;횡성, j;금산, k;괴산을 나타낸다.

도 3A 및 도 3B에서는 뿌리혹병 rDNA 염기서열 중 SSU(small subunits)의 첫 번째 인트론 부위의 삽입과 결실로 인한 뿌리혹병의 종류를 구분할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 아가로스 겔에서 확인한 결과로서 기존병원성과 변이병원성을 구분할 수 있는 분자마커 임을 확인하였다.

여기에서 보듯이, 강릉1(a), 강릉2(g), 해남1(h), 횡성(i), 괴산(k)의 뿌리혹병은 388bp가 적은 생산물을 더 많이 포함하고 있으며, 이는 기존 뿌리혹 병원성(wild type)을 구분할 수 있는 분자표지로 판명되었다. 기존 알려진 뿌리혹병은 SSU 3부위와 인트론으로 구성되어 있는데 관련 프라이머 (GGACTGGTAATTGGAATGAGA: 서열번호 22과 TCACAGTAAACGATCAACCG: 서열번호 23)를 작성하여 확인해 본 결과 SSU의 첫 번째 인트론 부위가 제거된 개체가 다수 포함되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 강릉1, 강릉2, 해남1, 횡성, 괴산으로 기존의 병원성 균에서 나타나 이를 구분할 수 있는 마커임을 알 수 있었다. 상기 실험결과는 더욱 많은 뿌리혹병 균에서 확인해 볼 가치가 있다고 사료된다.

< 실시예 3> 뿌리혹병 race 2를 구분할 수 있는 분자마커 설계

하기 표 5에 나타낸 바와 같은 뿌리혹병 race 2와 race 4를 구분할 수 있는 분자마커를 설계하였다.

실험방법은 11지역의 샘플에서 차이가 나는 염기서열 부위를 찾아 프라이머를 설계하였다. 뿌리혹병 rDNA의 전체 길이에서 661번째 (서열번호 15), 856번째 (서열번호 18), 903번째의 4bp(CGCG) InDel 부위였다. 이 부분을 프로브로 제작하여 race2와 race4를 확인할 수 있는 분자마커를 개발하였다.

판별 마커명	정방향 (F), 역방향 (R) 및 프로브 서열	변이서열	생산물 크기 (bp)
CR_rDNA-661	F: TTAAACCTATTATCGAGGATCC(서열번호13) R: ACGAGATTAGCATAGGATTATC(서열번호14) Probe_661: TCGAGCAGCCCATTCTAGTTGTGGG(서열번호15)	T/A	212
CR_rDNA-856	F: GAAGCGATTCGGGCATAGAGGCC(서열번호16) R: CGCTATTGGAGCTGGTATTACC(서열번호17) Probe_856: TCGAAAGAATGCCGATCGACTGGAG(서열번호18)	C/T	212
CR_rDNA-903	F: GAAGCGATTCGGGCATAGAGGCC(서열번호19) R: CGCTATTGGAGCTGGTATTACC(서열번호20) Probe_903: CGGGGGTGTGTGTTTGATGGAGGAA(서열번호21)	----/CGCG	226

<실시예 4> 뿌리혹병 rDNA 지역을 이용한 race 2를 구분하기 위한 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 탐색을 위한 HRM(high-resolution melting) 분석

프라이머 제작시 사이즈는 250~300bp로 너무 크지 않는 범위 안에서 프로브는 SNP가 중간에 들어가도록 제작하는 것이 바람직하다(AATTTCGcTAGGAT). 프로브와 프라이머 온도차이는 10℃정도 차이가 나도록 제작하며 GC% 함량은 30-60%, 정방향 및 역방향의 온도는 서로 비슷한 것이 바람직하다.

이렇게 제작된 프라이머와 프로브를 이용하여 HRM을 시행하여 분석하였다.

프라이머 세트(5pM), 25mM MgCl₂ 및 2 X 반응용액(High resolution melting master mix^®)을 각각 넣고 최종 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 다음 Lightcycler(Lightcycler 480^® Roche Diagnostics, Penzberg, Geermany)를 사용하여 하기 표 6에 나타낸 바와 같은 조건으로 HRM (high resolution melting) 분석을 수행하였다.

Target(℃)	Acquisution mode	Hold(hh:mm:ss)	Cycles
95	None	0:10:00	1Cycles
Amplification
95	None	0:00:20	50Cycles
TD 63-55	None	0:00:20
72	Single	0:00:20
Melting Curve
95	None	0:01:00	1Cycles
40	None	0:02:00
83	Continuous(5R/℃)	0:00:01

도 4는 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별용 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 HRM 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명에 따른 분자마커를 이용하여 뿌리혹병 race 2 또는 race 4을 판별함으로써 보다 간단하고 정확하게 배추 뿌리혹병을 판별할 수 있으므로, 배추 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

<110> Industry-academic cooperation foundation of sunchon national university <120> Molecular marker for selecting clubroot of Chinese cabbage and selection method using the same molecular marker <130> PA-16-0125 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 1 forward primer <400> 1 ggttgatcct gccagtagtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 1 reverse primer <400> 2 gaagcgattc gggcatagag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 2 forward primer <400> 3 cctatgctaa tctcgtggcg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 2 reverse primer <400> 4 taagaagtca cggacctagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 3 forward primer <400> 5 ttatgcctat gccttcccgg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 3 reverse primer <400> 6 gaaacacgca gctggagtcg c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 4 forward primer <400> 7 tccgtaggtg aacctgcgga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 4 reverse primer <400> 8 cccattctga cctaggccaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 5 forward primer <400> 9 ttggcctagg tcagaatggg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 5 reverse primer <400> 10 atgcggttat gagtacgacc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 6 forward primer <400> 11 caggttcata ttcctgaacc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA 6 reverse primer <400> 12 cgttcaaatc aagtcgtcta c 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA-661 forward primer <400> 13 ttaaacctat tatcgaggat cc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA-661 reverse primer <400> 14 acgagattag cataggatta tc 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 661 <400> 15 tcgagcagcc cattctagtt gtggg 25 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA-856 forward primer <400> 16 gaagcgattc gggcatagag gcc 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA-856 reverse primer <400> 17 cgctattgga gctggtatta cc 22 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 856 <400> 18 tcgaaagaat gccgatcgac tggag 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA-903 forward primer <400> 19 gaagcgattc gggcatagag gcc 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR_rDNA-903 reverse primer <400> 20 cgctattgga gctggtatta cc 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe 903 <400> 21 cgggggtgtg tgtttgatgg aggaa 25

Claims

서열번호 13의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별을 위한 분자마커.
서열번호 15, 서열번호 18 또는 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별을 위한 프로브(probe).
배추 뿌리혹병 균주로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 프로브를 사용하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브(melting curve)를 분석하여 확인하며, 상기 멜팅 커브가 68℃에서 확인되는 경우 배추 뿌리혹병인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별방법.
배추 뿌리혹병 균주로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 프로브를 사용하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브(melting curve)를 분석하여 확인하며, 상기 멜팅 커브가 64 ℃에서 확인되는 경우 배추 뿌리혹병인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별방법.
배추 뿌리혹병 균주로부터 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트와 서열번호 21의 염기서열로 표시되는 프로브를 사용하여 실시간(real-time) 중합효소반응(PCR)을 실시한 다음 멜팅 커브(melting curve)를 분석하여 확인하며, 상기 멜팅 커브가 64 ℃에서 확인되는 경우 배추 뿌리혹병인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 배추 뿌리혹병 race 2 또는 race 4 판별방법.