KR101861592B1 - 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 ssr 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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홍탁기
박종열
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 52개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 청춘찰옥수수 품종을 구분하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 청춘찰옥수수 품종 구분용 특이 SSR 프라이머를 통하여 청춘찰옥수수 품종의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라, 청춘찰옥수수 품종과 같은 색소옥수수 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Description

청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도{Specific SSR primers for discriminating waxy corn cultivar Cheongchunchal and uses thereof}
본 발명은 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 52개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종 구분용 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종 구분용 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 청춘찰옥수수 품종을 구분하는 방법에 관한 것이다.
옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 중요 작물 중 하나이며, 식용뿐만 아니라 사료용, 공업용 등 다양한 용도로 이용되고 있다. 최근 웰빙(well-being)에 대한 관심이 높아지면서, 천연성분을 함유한 고품질, 고기능성 작물이나 이를 이용한 가공품의 선호도가 증가하고 있다. 더욱이 웰빙 건강식으로 블랙푸드가 각광을 받으면서 안토시아닌(anthocyanin) 색소에 대한 관심이 높아지고 있다. 안토시아닌 색소는 식물에 존재하는 천연 색소로 자색, 청색, 적색을 나타내며 인체에 무해하여 천연 착색료로 이용될 뿐만 아니라, 항산화, 항암, 항당뇨에 효과가 있다고 알려져 있다. 이러한 안토시아닌 색소의 중요성과 기능성 등으로 인해 고구마, 감자 등에서는 안토시아닌 함량이 높은 품종 육성이 상당 부분 추진되어 관련 품종이 있는 실정이지만, 옥수수 분야의 경우, 안토시아닌이 다량 함유된 색소옥수수의 육성은 현재 시작단계에 놓여있다.
색소옥수수의 품종개발을 위해서는 우수 형질을 지니고 있는 다양한 유전자원의 수집과 수집된 유전자원들의 유전학적 특성을 명확히 밝히는 것이 육종의 효율을 높이기 위해 매우 중요하다. 특히 타식성작물(allogamous crops, outcrossing crops)인 옥수수 품종의 경우, 다양한 지역에서 수집되어 고정된 육종재료들에서 유전자원들의 유전학적 특성을 밝히고, 우수한 자식계통을 선정하기 위해서 수집된 재료들의 유전적 다양성(genetic diversity), 계통유연관계(genetic relationship)를 명확히 평가하는 것이 신품종 개량을 위한, 자식계통 육성 및 발굴 그리고 교배조합 예측 등에 효율적으로 이용될 수 있고, 이형집단에서 자식계통의 선발과 품종 보호 등에도 매우 중요하다.
특히 본 발명에 이용한 SSR(simple sequence repeat) 분석법은 PCR을 이용하는 분석기법으로 재현성이 매우 뛰어나며, 식물 집단들 내에서 유전자좌(gene locus)마다 많은 대립인자들을 가지고 있고 대립유전자의 특성을 명확하게 나타낼 수 있어 옥수수와 같은 작물의 유전적 다양성, 계통유연관계를 분석하고 핑거프린팅(fingerprinting)과 분자 매핑(molecular mapping) 등에 활용되고 있다.
강원도농업기술원 옥수수연구소는 2003년부터 색소옥수수 육성을 진행하여 왔으며, 최근 기존의 자색 유색찰인 미흑찰의 알곡보다 5~10배 이상 증가된 색소를 함유한 청춘찰을 개발하였다. 청춘찰은 안토시아닌이 다량 함유된 찰옥수수로 풋옥수수나 알곡용으로 활용될 수 있으며, 또한 천연색소에 대한 국내 수요는 연간 100억원 이상으로 추정되지만 전량 수입에 의존하고 있어 국내 천연색소 산업에도 많은 기여를 할 것으로 생각된다. 따라서 본 발명에서는 강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 개발한 청춘찰 품종에 대하여 SSR 분자마커를 이용하여 양친 자식계통들에서 다형성을 나타내는 SSR 분자마커를 선발하여 청춘찰의 품종식별 및 품종보호 그리고 1대잡종 종자들의 순도검정에 활용하고자 한다.
한편, 한국특허등록 제1032868호에는 '미흑찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1055173호에는 '미백2호옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 특이 SSR 프라이머 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 육성하여 개발한 안토시아닌이 다량 함유된 찰옥수수 청춘찰 품종의 교배친 계통인 HCW1과 HCW2 자식계통에 대하여, 각 염색체당 30개씩의 SSR 프라이머를 제작하고, 이를 분석하여 양친 자식계통들에서 다형성을 나타내는 최종 52개의 SSR 프라이머를 선발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 52개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 청춘찰옥수수 품종을 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 청춘찰옥수수 품종 구분용 SSR 프라이머를 통하여 안토시아닌이 다량 함유된 청춘찰옥수수 품종 식별 및 품종보호, F1 잡종의 순도검정 그리고 청춘찰옥수수와 같은 색소옥수수 유전자원들을 효율적으로 평가할 수 있는 최적의 SSR 마커 선발과 분자육종연구 등에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대한다.
도 1은 본 발명에 따른 52개 SSR 프라이머 세트를 이용하여 청춘찰 품종의 두 교배친에 대한 SSR 프로필의 예를 보여주는 결과이다.♀, HC\1; ♂, HCW2.
도 2는 SSR 마커에 근거한 청춘찰 품종의 두 교배친에서의 대립유전자 특성 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 52개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종 구분용 SSR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 SSR 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 181 및 182의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 183 및 184의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 185 및 186의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 187 및 188의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 189 및 190의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 191 및 192의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 241 및 242의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 243 및 244의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 245 및 246의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 247 및 248의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 249 및 250의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 251 및 252의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 301 및 302의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 303 및 304의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 305 및 306의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 307 및 308의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 361 및 362의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 363 및 364의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 365 및 366의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 367 및 368의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 369 및 370의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 371 및 372의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 373 및 374의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 375 및 376의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 377 및 378의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 379 및 380의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 421 및 422의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 423 및 424의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 425 및 426의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 481 및 482의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 483 및 484의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 485 및 486의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 541 및 542의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 543 및 544의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 545 및 546의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 547 및 548의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 549 및 550의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 551 및 552의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 SSR 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 52개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상, 42개 이상, 43개 이상, 44개 이상, 45개 이상, 46개 이상, 47개 이상, 48개 이상, 49개 이상, 50개 이상, 51개 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 52개의 SSR 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 181 및 182의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 183 및 184의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 185 및 186의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 187 및 188의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 189 및 190의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 191 및 192의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 241 및 242의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 243 및 244의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 245 및 246의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 247 및 248의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 249 및 250의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 251 및 252의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 301 및 302의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 303 및 304의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 305 및 306의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 307 및 308의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 361 및 362의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 363 및 364의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 365 및 366의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 367 및 368의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 369 및 370의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 371 및 372의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 373 및 374의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 375 및 376의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 377 및 378의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 379 및 380의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 421 및 422의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 423 및 424의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 425 및 426의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 481 및 482의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 483 및 484의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 485 및 486의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 541 및 542의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 543 및 544의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 545 및 546의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 547 및 548의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 549 및 550의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 551 및 552의 SSR 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.
상기 52개의 SSR 프라이머 세트를 동시에 이용하면 청춘찰옥수수 품종을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.
상기 SSR 프라이머는 각 SSR 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 121 및 122; 서열번호 123 및 124; 서열번호 125 및 126; 서열번호 127 및 128; 서열번호 129 및 130; 서열번호 131 및 132; 서열번호 133 및 134; 서열번호 135 및 136; 서열번호 137 및 138; 서열번호 181 및 182; 서열번호 183 및 184; 서열번호 185 및 186; 서열번호 187 및 188; 서열번호 189 및 190; 서열번호 191 및 192; 서열번호 241 및 242; 서열번호 243 및 244; 서열번호 245 및 246; 서열번호 247 및 248; 서열번호 249 및 250; 서열번호 251 및 252; 서열번호 301 및 302; 서열번호 303 및 304; 서열번호 305 및 306; 서열번호 307 및 308; 서열번호 361 및 362; 서열번호 363 및 364; 서열번호 365 및 366; 서열번호 367 및 368; 서열번호 369 및 370; 서열번호 371 및 372; 서열번호 373 및 374; 서열번호 375 및 376; 서열번호 377 및 378; 서열번호 379 및 380; 서열번호 421 및 422; 서열번호 423 및 424; 서열번호 425 및 426; 서열번호 481 및 482; 서열번호 483 및 484; 서열번호 485 및 486; 서열번호 541 및 542; 서열번호 543 및 544; 서열번호 545 및 546; 서열번호 547 및 548; 서열번호 549 및 550; 및 서열번호 551 및 552 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 SSR 프라이머(27개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 121 및 122; 서열번호 123 및 124; 서열번호 125 및 126; 서열번호 127 및 128; 서열번호 129 및 130; 서열번호 131 및 132; 서열번호 133 및 134; 서열번호 135 및 136; 서열번호 137 및 138; 서열번호 181 및 182; 서열번호 183 및 184; 서열번호 185 및 186; 서열번호 187 및 188; 서열번호 189 및 190; 서열번호 191 및 192; 서열번호 241 및 242; 서열번호 243 및 244; 서열번호 245 및 246; 서열번호 247 및 248; 서열번호 249 및 250; 서열번호 251 및 252; 서열번호 301 및 302; 서열번호 303 및 304; 서열번호 305 및 306; 서열번호 307 및 308; 서열번호 361 및 362; 서열번호 363 및 364; 서열번호 365 및 366; 서열번호 367 및 368; 서열번호 369 및 370; 서열번호 371 및 372; 서열번호 373 및 374; 서열번호 375 및 376; 서열번호 377 및 378; 서열번호 379 및 380; 서열번호 421 및 422; 서열번호 423 및 424; 서열번호 425 및 426; 서열번호 481 및 482; 서열번호 483 및 484; 서열번호 485 및 486; 서열번호 541 및 542; 서열번호 543 및 544; 서열번호 545 및 546; 서열번호 547 및 548; 서열번호 549 및 550; 및 서열번호 551 및 552의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 청춘찰옥수수 품종을 구분하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 옥수수 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(프로메가사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SSR 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료
강원도 농업기술원 옥수수연구소에서 육성하여 개발한 청춘찰 품종의 교배친 계통인 HCW1과 HCW2 자식계통을 실험재료로 사용하였다(표 1).
청춘찰 품종의 두 교배친 정보
품종 Accession 번호 계통 청춘찰의 모부본계통
청춘찰 1 HCW1 청춘찰 모(♀)
2 HCW2 청춘찰 부(♂)
2. DNA 추출
옥수수 게노믹 DNA는 Dellaporta 등(1983, Mol Biol Rep 1:19-21)의 방법을 약간 수정하여 신선한 어린 잎으로부터 추출하였다. 식물체의 어린 잎 조직을 잘라내어 1.5㎖ 튜브에 액체 질소를 부어넣은 후 막자사발을 이용하여 곱게 갈아주었다. 65℃ 항온수조에 미리 넣어 준비한 추출 버퍼(1M Tris-HCl pH 8.0, 0.5M EDTA, 5M NACl 및 20% SDS)에 0.16g의 아황산수소나트륨(sodium bisulfate)를 넣은 후 튜브에 600㎕를 넣고 탭핑(tapping)하였다. 그리고 그 튜브에 다시 600㎕의 바이오 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(Bio phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, 50:24:1)을 첨가하고 탭핑한 후 65℃ 항온수조에 15분간 반응시키고, 그 후 바로 13,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액은 새 튜브에 옮겼다. 상층액에 클로로포름:이소아밀알콜(24:1) 용액을 600㎕를 첨가한 후 탭핑하고 다시 14,500rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮겨 95% 에탄올 600㎕를 넣은 후 인버팅(inverting)하고 14,500rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 침전된 펠렛이 떨어지지 않게 모든 용액을 버린 후 70% 에탄올을 600㎕를 넣고 가볍게 탭핑한 후, 10,000rpm에서 원심분리하고 에탄올을 버린 후 대기 건조시켰다. 그 후 30㎕의 증류수로 녹이고, RNAase를 1㎕ 첨가하여 RNA를 완전히 제거하였다.
3. SSR 프라이머 선발과 PCR 증폭
우리나라 청춘찰 품종의 교배친 자식계통(HCW1과 HCW2)들에 대한 다형성 분석을 위해서 분석에 이용한 SSR 프라이머는 각 염색체당 30개씩 총 300개의 SSR 프라이머 세트를 선발하여 사용하였다(표 2 내지 표 7).
Figure 112016119218519-pat00001
Figure 112016119218519-pat00002
Figure 112016119218519-pat00003
Figure 112016119218519-pat00004
Figure 112016119218519-pat00005
Figure 112016119218519-pat00006
PCR 증폭에서 용액의 조성은 총 30㎕로 구성되며 20ng의 게노믹 DNA와 1x PCR 버퍼, 0.3μM의 프라이머, 0.2mM의 dNTP 그리고 1unit의 Taq 중합효소(Biotools, B&M Labs, Madrid)로 하였다. PCR 반응은 처음 94℃에서 5분간 반응시킨 후, 1사이클로 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 65℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension)을 하고, 2번째 사이클부터 마지막까지 1℃씩 낮추며 최종 55℃까지 낮추었다. 마지막 사이클은 20번 반복하고, 사이클 완료 후 72℃에 10분간 연장하였다.
4. 전기영동과 은 염색(Silver-staining)
5㎕의 PCR 산물을 10㎕의 로딩 버퍼(98% formamide, 0.02% BPH, 0.02% Xylene C 및 5 mM of NaOH)와 섞었다. 끓는 물에 변성시킨 후에 바로 얼음에 냉각하여, 6% 변성 아크릴아미드:비스아크릴아미드 겔(19:1, 7.5M 요소)에 1x TBE 버퍼를 채운 후 2㎕의 샘플을 로딩하고, 1,800V의 60W에서 2시간 동안 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 겔은 은 염색 키트(Promega, 미국)을 이용하여 DNA 밴드를 확인하였다.
실시예 1. 청춘찰의 교배친 자식계통들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머 선발
청춘찰 품종의 전체 게놈을 대표할 수 있도록 각 염색체별로 30개씩 총 300개의 SSR 프라이머들을 선택하여(표 2 내지 표 7) 색소옥수수 품종인 청춘찰의 교배친 자식계통들에서 유전적 다형성을 나타내는 SSR 마커를 선발하였다.
그 결과, 분석에 이용된 300개의 SSR 프라이머들 중에서 청춘찰의 교배친 자식계통인 HCW1과 HCW2 계통들에서 다형성을 나타내는 SSR 프라이머를 52개를 선발하였다(도 1). 나머지 248개 SSR 프라이머들에서 134개의 SSR 프라이머들은 두 교배친 자식계통들에서 증폭되지 않았으며(null), 73개의 프라이머들은 자식계통 HCW1과 HCW2에서 같은 사이즈의 대립단편을 증폭시켜 다형성을 나타내지 못하였다(mono-morphic band). 그리고 나머지 41개의 SSR 프라이머들은 두 교배친 자식계통들 중에서 어느 한쪽에서만 DNA 밴드가 증폭되었다(dominant band)(표 8).
청춘찰 품종의 두 교배친에서 300개 SSR 프라이머의 증폭 경향 분석
증폭 경향 프라이머 개수
null 134
mono 74
dominant 40
codominant 52
실시예 2. 청춘찰의 품종식별 및 품종보호용 SSR 분자마커
분석에 이용된 300개의 SSR 프라이머들은 청춘찰의 교배친 자식계통인 HCW1과 HCW2 계통들에서 총 218개의 대립단편(allele bands)들을 증폭하였다. 그 중에서 62개의 대립단편은 청춘찰의 모본인 HCW1에 특이적으로 나타났으며, 58개의 대립단편은 청춘찰의 부본인 HCW2에 특이적으로 나타나는 것으로 확인되었다. 나머지 74개의 대립단편들은 HCW1과 HCW2 자식계통 모두에서 확인할 수 있었다(도 2).
그 결과 분석에 이용된 총 300개의 SSR 프라이머들 중에서 교배친 자식계통(HCW1 및 HCW2)들에서 공우성 마커를 나타내는 52개의 SSR 프라이머 umc1076, umc1354, phi001, umc2397, bnlg147, umc2255, umc2256, umc1392, bnlg1047a, bnlg1350a, bnlg1638, bnlg2241, umc1949, umc2275, umc1011, phi079, umc2278, umc2061, umc1051, umc1643, umc1935, mmc0351, umc2295, mmc0081, umc2406, umc1870, phi075, bnlg238, umc1779, phi025, umc1546, umc1986, phi034, bnlg1247, bnlg1792, umc1426, umc1409, umc1016, umc1066, umc1831, umc1960, umc1741, bnlg1607, bnlg2122, umc2131, bnlg244, bnlg1712, umc1344, umc1569, umc1938, umc2017 및 umc1381들은 앞으로 청춘찰 옥수수의 품종식별 및 품종보호 그리고 1대잡종 종자들에 대한 순도검정 등에 유용한 분자마커로 이용될 수 있을 것이다(표 9).
청춘찰 품종의 두 교배친에서 공우성 SSR 마커
품종 F1 잡종의 교배조합 공우성 SSR 마커
청춘찰 HCW1 X HCW2 umc1076, umc1354, phi001, umc2397, bnlg147, umc2255, umc2256, umc1392, bnlg1047a, bnlg1350a, bnlg1638, bnlg2241, umc1949, umc2275, umc1011, phi079, umc2278, umc2061, umc1051, umc1643, umc1935, mmc0351, umc2295, mmc0081, umc2406, umc1870, phi075, bnlg238, umc1779, phi025, umc1546, umc1986, phi034, bnlg1247, bnlg1792, umc1426, umc1409, umc1016, umc1066, umc1831, umc1960, umc1741, bnlg1607, bnlg2122, umc2131, bnlg244, bnlg1712, umc1344, umc1569, umc1938, umc2017, umc1381
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Specific SSR primers for discriminating waxy corn cultivar Cheongchunchal and uses thereof <130> PN16472 <160> 600 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttggaaatca ccaattgata tagtttg 27 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tctattgcaa acgccaaaag tagc 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatcagcccg ttcagcaagt t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagtggaggc ggaggatctg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgacggacgt ggatcgcttc ac 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agcaggcagc aggtcagcag cg 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgcatatata cttgtgcgca cttt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<220> <223> primer <400> 17 cccagctcct gttgtcggct cagac 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tccagatccg ccgcacctca cgtca 25 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tggtgataac tgtcaagcgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ttggggcatt ggcctatata 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aacgtaccat ccttgtgcct gtat 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cattattagt acggagcgct ggtc 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cggacggggg ttattaaaat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tgtgttcgca gaatctctcg 20 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gtgccaactc aggtaatctc caat 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 aaggctagtg gctatagtgg aggg 24 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gatgcaataa aggttgccgt 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 atgtgctgtg cctgcctc 18 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgtttaagtg ttggcagaaa gcaa 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tctccctccc ctgtacatga atta 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcgtacagaa cagagcagtt acga 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 actgaagctg cctgccttct attt 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 agatttgact gcaagaaaag gctg 24 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gtccctcgtc ctgcaagatt c 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<220> <223> primer <400> 53 atgggactat gcatggtatt ttgg 24 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tacaccatac gtcaccaggt tcac 24 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 atgggcacat gaaaaagaga catt 24 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 cccatgagaa gagtgaagac aaca 24 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 cgtgatcgac atggaccact t 21 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 caccatcaca ttcacacgca tag 23 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 atcagattcc gaagggtcca taat 24 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gtagtgaaat gaatcgtgag agcg 24 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 taaagctatg atggcacttg caga 24 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 596 gctggagcta gctgtagtgt agca 24 <210> 597 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 597 aaacaattgt catcttcttc tgcg 24 <210> 598 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 598 gtcagaccga cgcactcact aa 22 <210> 599 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 599 tgacagggag cacagaaaca atag 24 <210> 600 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 600 ggtcttctcc ccctcattct ctt 23

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 121 및 122의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 123 및 124의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 125 및 126의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 127 및 128의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 129 및 130의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 131 및 132의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 133 및 134의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 135 및 136의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 137 및 138의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 181 및 182의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 183 및 184의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 185 및 186의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 187 및 188의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 189 및 190의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 191 및 192의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 241 및 242의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 243 및 244의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 245 및 246의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 247 및 248의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 249 및 250의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 251 및 252의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 301 및 302의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 303 및 304의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 305 및 306의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 307 및 308의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 361 및 362의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 363 및 364의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 365 및 366의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 367 및 368의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 369 및 370의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 371 및 372의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 373 및 374의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 375 및 376의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 377 및 378의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 379 및 380의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 421 및 422의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 423 및 424의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 425 및 426의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 481 및 482의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 483 및 484의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 485 및 486의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 541 및 542의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 543 및 544의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 545 및 546의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 547 및 548의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 549 및 550의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 551 및 552의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 SSR 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 청춘찰옥수수 품종을 구분하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 옥수수에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 청춘찰옥수수 품종을 구분하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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