KR20140106892A - Ssr 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SSR 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 식별 대상 마 식물체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계, 서열번호 1 내지 4의 SSR DNA 마커 중 하나 이상을 증폭하는 단계, 및 그 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 마 유전자원의 식별 방법을 개시한다. 본 발명의 마 유전자원 식별 방법에 따르면 모세관 전기영동 또는 겔 전기영동에 의해서 증폭 산물의 크기를 비교함으로써 하나 이상의 유전적 형질에서 차이를 나타내는 마 유전자원의 식별이 가능하다.

Description

SSR 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법{Method for Identifying Genetic Resources of Yam Using SSR Markers}

본 발명은 SSR 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법에 관한 것이다.

마는 다년성 초본으로 덩굴성이고 지하경(tuber)을 가지며 자웅이주 식물로 마과에 속한다. 우리나라에서는 중국 마(Dioscorea opposite)에 속하는 재배 품종인 단마, 장마가 주로 재배되고, 한약재(산약), 생식 또는 가공되어 건강기능성 식품으로 이용된다. 중국을 비롯한 우리나라에서 산약으로 이용되는 기원식물은 D. opposite와 D. japonica이다. D. japonica는 D. opposite의 아종(subspecies)으로 간주되기도 하였고, D. opposite는 D. batata로 명명된 적도 있었다. 그러나, D. batata라는 종명은 오늘날 거의 사용되지 않는다. 그 외에 물마 (D. alata)에 속하는 마들이 최근 국내에 도입되어 재배되고 있다.

이들 세 가지 종(D. opposite 와 D. japonica , D. alata)은 마 속 (Genus Dioscorea )을 구성하는 6개의 절(section) 중에 enanthiophyum에 속하며, 또한 식품으로 이용되는 대부분의 재배 종들이 이 절에 속한다. 이 절에 속하는 마는 일반적으로 한 개의 덩이줄기를 가지고, 줄기는 오른쪽 방향으로 감기며, 줄기에 날개가 있는 경우도 있으며, 잎 자루 겨드랑이에 주아(bulbils)가 달리는 등의 형태적 특징을 보인다. 그런데, 마의 가식 부위인 땅속 줄기의 형태는 기후와 토질에 지대한 영향을 받아서 그 모양이 달라지고, 그에 따라서 동일 품종이더라도 단마, 병마, 주먹마, 산약마, 산마, 참마, 자연마 등으로 지역에 따라 통용되는 명칭이 달라질 정도이다.

마는 형태적 가소성이 높아, 동일 품종도 재배 환경에 따라서 덩이줄기의 모양이 다양하게 나타나 다른 종류의 마를 식별하는 데 어려움이 가중되지만, 실제로는 마는 영양번식을 주로 하는 클론(clone) 식물에 가깝고, 교배 생식에 의한 다양성 창출은 다른 작물에 비해서는 제한적이라고 할 수 있다. 따라서, 지상부의 형태적 특성과 땅속 줄기의 육질이 비슷하고 모양이 크게 다르지 않으면, 동일 품종일 가능성도 상당히 높다고 할 수 있다. 그러나 토착품종을 재배하는 경우도 있고, 우량 종서를 자력으로 확보하는 경우도 있어서, 실제로 품종이 달라 부르는 이름이 다를 수도 있다. 더욱이 최근에는 국가간의 왕래가 활발해짐에 따라 다양한 종류의 마가 외국으로부터 도입되고 있다. 이러한 상황은 상품의 유통에도 혼란이 있을 수 있을 뿐만 아니라, 마 유전자원의 확보와 관리는 물론 새로운 품종의 육종에도 상당한 혼동을 초래할 수 있다. 그러므로 유전체 특성을 파악하여 품종 간의 차이를 확인할 필요가 있고, 더 나아가 유전자원 관리의 효율화와 신품종 개발을 위해 더 효율적이고 객관적이고 구별 수단이 필요하다.

일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정 방법과, 종 또는 품종 간 동위효소의 차이를 통한 검정 방법, 그리고 DNA에 기초한 분자 마커를 이용한 검정 방법으로 나뉜다.

이 중 분자 마커를 이용한 검정 방법은 작물의 유전·육종연구에서 유전적 다양성과 계통 유연 관계 분석 그리고 식물 유전자원의 보존과 관리 등에 유용한 정보를 제공하고 있으며(Smith et al., 1997. Theor. Appl. Genet. 95: 163-173), 표현형에 근거한 전통적인 식별 방법에 비해 재배 환경 및 작물의 생장 단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점을 가진다.

국제 신품종 보호 연맹(UPOV)은 품종 식별을 위하여 분자 마커의 활용을 고려 중에 있으며, 특히 품종 간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(simple sequence repeat or microsatellite), SNP(single nucleotide polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 등을 이용하는 것을 제안하고 있다.

분자 마커 중 SSR을 이용한 분석법은 품종 식별과 유전자원 관리에 널리 이용되고 있는데, 그 이유는 유전체 상에 SSR 변이가 널리 존재하며, 개체 식별에 이용될 수 있을 만큼 변이가 풍부할 뿐만 아니라, 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 그 변이를 신속하고 용이하게 검출할 수 있기 때문이다.

본 발명도 SSR 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 목적은 마 유전자원의 식별 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 마 유전자원의 식별 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 미국국립생물정보센터(NCBI)의 dbEST에 있는 물마(D, alata)의 4만 여개의 EST 서열 중에서 반복 서열의 길이, 반복 서열의 반복 횟수 등을 고려하여 분자 표지로서 적합한 것으로 추정되는 총 4개의 SSR 마커를 선발하여 이에 대한 프라이머를 설계·제작한 후, 그 프라이머를 이용하여 농업유전자정보센터(www.genebank.go.kr) 또는 경북농업기술원생물자원연구소(bio.gba.go.kr)에서 하나 이상의 형질에서 차이를 보여 서로 다른 유전자원으로 분류·관리할 필요가 있는 총 12개체의 마 식물체를 대상으로 상기 4개의 SSR를 증폭시켰을 때 PIC(polymorphism information content, 다형성 정보 함량, Anderson et al. (1993) Genome 36:181) 값이 0.811 내지 0.894 범위의 값을 보이고 UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean; Michener and Sokal 1957) 방법을 이용하여 계통수를 작성하였을 때 12개체의 마 식물체가 각각 달리 분류됨으로써 상기 선발된 총 4개의 SSR 마커가 마 유전자원의 식별을 위한 분자 표지로서 적합함을 확인하였다. 상기에서 PIC 값은 유연 관계의 분석에서 분자 표지가 갖고 있는 정보력을 말해주는 값으로서, 0 내지 1 범위의 값을 가지며, 1에 가까울수록 분자 표지로서의 유용성이 우수함을 의미한다.

본 발명은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 마 유전자원의 식별 방법은 (a) 식별 대상 마 식물체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계, (b) 서열번호 1 내지 4의 SSR DNA 마커 중 하나 이상을 증폭하는 단계, 및 (c) 그 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 "마 유전자원(genetic resource)"은 마 속(Dioscorea sp .) 식물체에 속하나 하나 이상의 유전적 형질에서 차이를 나타냄으로써 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류되고 있는 마 식물체 이외에, 아직 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류되고 있지 않지만 추후 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류될 가능성을 배제할 수 없어 별도의 생물 자원으로 관리되고 있는 마 식물체를 포함하는 의미이다. 여기서 유전적 형질은 형태적 특성 등의 하나 이상의 형질이 유전자 서열 차이에 기원하는 특성을 말한다.

또 본 명세서에서 "SSR DNA"는 2 내지 6 bp 정도의 염기서열이 반복되는 DNA

으로 게놈 내에 골고루 분포하고 매우 높은 다형성을 나타내는 비암호화 DNA 서열(non-coding DNA sequence)을 의미한다. SSR DNA는 특정 좌위에서 반복 단위의 반복수에 따라 개체간의 다양성이 인정되는데, 반복수에 있어서 유전자원 사이의 다형이 있는 경우에 인접 영역에서 설계한 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)과 같은 유전자증폭 반응을 행하면, 증폭반응 산물 길이에 다형이 관찰되고, DNA 다형을 검출하는 것이 가능해진다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 분리하는 단계는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 예컨대 에탄올 분리법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 이들을 혼합한 방법 등을 이용할 수 있으며, 또 예컨대 문헌「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2007], 문헌[Doyle et al, Phytochem Bull 19: 11-15, 1987], 문헌[Want et al, Nucleic Acids Res 21: 4153-4154, 1993], 문헌[Lodhi et al., Plant Mol Biol Rep 12(1):6-13, 1994] 등에 개시된 방법을 이용·응용하여 수행할 수 있다. 통상은 생명공학회사에 제작·유통되는 DNA 추출용 키트를 이용하게 될 것이다. 그러한 DNA 추출용 키트로서는 예컨대 아래의 실시예에서 사용된 EZway Genomic DNA Kit(Macherey-Nagel, Germany), Epicenter Technology 사(WI), XTRANA 사(CO), Cepheid 사(CA), Qiagen 사(NL), Promega 사 또는 Beckman Coulter 사(US)가 판매하는 키트 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 SSR 마커 증폭 단계의 수행을 위해서는 먼저 프라이머를 제작할 필요가 있다.

프라이머(primer)는 주형 DNA에 특이적으로 결합하여 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 이러한 프라이머는 DNA 뿐만 아니라 RNA일 수 있으며, 또한 이들 프라이머는 여러 형태의 뉴클레오티드의 유사체가 배합된 것일 수도 있다. 뉴클레오티드의 유사체의 예로는 데옥시이노신 뉴클레오티드, 데옥시우라실 뉴클레오티드, 7-데아자구아닌과 같이 변형된 염기를 갖는 뉴클레오티드 유사체, 리보스 유사체를 갖는 뉴클레오티드 유사체 등을 들 수 있다.

프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성하며, 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 문헌 [Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)] 및 문헌 [Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)] 등을 참조할 수 있다.

상기 프라이머의 길이는 주형 DNA와 특이적으로 결합하여 안정한 상보적인 결합을 형성하고 DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 한 특별한 제한이 없다. 프라이머의 길이는 온도, 버퍼의 염 농도 등 증폭 조건을 고려하여 결정될 것이다. 통상은 10 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가지도록 설계·제작될 것이나, 프라이머의 길이가 너무 짧거나 너무 길 경우에 주형 DNA와 비특이적 결합이 형성될 수 있으므로 15 내지 25 뉴클레오티드의 길이를 가지도록 설계되는 것이 바람직하다.

또 상기 프라이머의 서열은 주형 DNA와 완전히 상보적일 필요는 없으나 주형 DNA와 특이적 결합을 형성하여 원하는 증폭 산물을 얻기 위해서는 80% 서열 상보성을 가지도록 설계·제작되는 것이 바람직하며 특히 90% 이상의 서열 상보성을 가지도록 설계·제작되는 것이 바람직하다.

또 프라이머의 서열 설계의 기초가 되는 서열번호 1 내지 4의 SSR 마커는 그 서열이 각각 NCBI(미국국립생물정보센터) accession no HO852957, NCBI accession no HO827867, NCBI accession no HO857921 및 NCBI accession no HO823389와 동일하기 때문에 이들 서열을 참조할 수도 있다.

가장 바람직하게는 서열번호 1의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머, 서열번호 2의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 4의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머가 바람직하다.

또 본 발명의 상기 (b) 단계에서 전술한 바의 프라이머 서열을 이용한 DNA 서열의 증폭은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 통상은 생명공학회사에서 제작·유통되는 키트를 이용하게 될 것인데, 이러한 DNA의 증폭용 키트는 일반적인 PCR 방법뿐만 아니라, NASBA(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법, 중합효소 리가아제 체인 반응법, Gap-LCR(Gap-filling Ligase Chain Reaction)법, 리페어 체인 반응법과, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응법, RCA(rolling circle amplification) 등의 등온증폭(isothermal amplification) 방법 등을 이용한 키트일 수 있다(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560, 1989; Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16, 1991; WO 90/01069; EP 439,182; Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173, 1989; U.S. Pat. No. 5,130,238).

또 본 발명의 상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출 단계는 증폭된 SSR 마커의 증폭 산물의 크기를 분석함으로써 마 유전자원을 식별하는데 유용한 정보를 제공하기 위한 단계이다. 특히 SSR 마커의 반복 서열의 수에 따라 달라지는 증폭 산물의 크기를 분석하여 다양한 유전자형을 분류·결정하고 분류·결정된 유전자형에 기초하여 어떤 마 식물체가 기존 보고된 마 종 또는 마 품종과 동일한지, 아니면 새로운 유전자원인지를 식별할 수 있다.

이러한 검출 단계는 모세관 전기영동, 겔 전기영동(아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동) 등을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI 사의 DNA analyzer를 이용할 수 있다.

또한 겔 전기영동을 수행할 수도 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 및 아크릴아미드 겔 전기영동 중 적절한 것을 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명은 다른 측면에 있어서 마 유전자원의 식별 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 마 유전자원의 식별 키트는 서열번호 1의 SSR 마커의 증폭용 프라이머, 서열번호 2의 SSR 마커의 증폭용 프라이머, 서열번호 3의 SSR 마커의 증폭용 프라이머 및 서열번호 4의 SSR 마커의 증폭용 프라이머 중 하나 이상의 프라이머를 포함함을 특징으로 한다.

상기 서열번호 1의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머이며, 상기 서열번호 3의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머이며, 상기 서열번호 4의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머인 것이 바람직하다.

본 발명의 키트는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및/또는 완충(buffer)용액을 포함하는 DNA 서열을 증폭하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 게놈 DNA 분리 수단을 추가로 포함할 수 있으며, 그러한 분리 수단은 예컨대 앞서 설명한 DNA 추출용 시약·키트일 수 있다.

또 본 발명 키트는 사용 방법을 교시한 설명서를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 설명서는 종이 형태나 CD, 디스크, DVD 등 컴퓨터 판독 가능한 형태일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 마 유전자원의 식별 방법 및 마 유전자원의 식별 키트를 제공할 수 있다.

발명의 방법 및 키트는 마 속(Dioscorea sp .) 식물체에 속하나 하나 이상의 유전적 형질에서 차이를 나타냄으로써 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류되고 있는 마 식물체의 식별·분류와 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류되고 있지 않지만 추후 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류될 가능성을 배제할 수 없어 별도의 생물 자원으로 관리되고 있는 마 식물체의 식별·분류에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시료로서 사용된 총 12개의 마 유전자원에 대해서 4개의 SSR 마커의 증폭 결과를 이용하여 UPGMA 방법으로 작성한 계통수이다.
도 2는 시료로서 사용된 총 12개의 마 유전자원에 대해서 4개의 SSR 마커 증폭 산물의 아가로스 젤 전기영동 결과 및 QIAxcel 전기영동 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 식별 대상 마 식물체

실험은 농업유전자정보센터(www.genebank.go.kr) 또는 경북농업기술원생물자원연구소(bio.gba.go.kr가 보유하고 있는 마 식물체 자원 중 하나 이상의 유전적 형질에서 차이가 있어 서로 다른 품종 또는 종으로 분류·동정되거나 분류·동정할 필요가 있는 아래 [표 1]의 총 12개의 마 식물체를 사용하였다.

<실시예 2> DNA 추출 및 정성·정량

상기 12개의 식물체를 2012년 경북농업기술원생물자원연구소의 포장에서 재배하고, 그 어린 잎으로부터 EZway Genomic DNA kit (Komabiotech.com)를 사용하여 핵 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 5ul를 1kb DNA ladder(Quiagen, USA)와 함께 0.8% agarose gel에 로딩하여 전기영동하고, 염색한 후, 사진을 찍어, DNA ladder와 비교하여, 그 양과 질을 판단하였다. 추가적으로, 260nm와 280nm에서 DNA 시료의 흡광도를 측정하여, 시료의 순도가 적정(A₂₆₀/A₂₈₀ 값이 0.8 이상)하고, 농도가 10ug/ul 이상 되는 것을 실험에 사용하였다.

<실시예 3> 프라이머 디자인

NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 dbEST에 있는 마 식물 종의 하나인 물마(D. alata)의 EST 서열 정보 44,134만개를 다운로드 하였다(Genebank accession no HO809681부터 HO864016 까지의 EST 서열임). 국내에서 주로 재배되고 한약의 원료로 쓰이는 마(산약마)는 D. opposita 인데, 이 종의 유전체에 대해 알려진 정보는 매우 빈약하다. 그래서 유전체 정보가 비교적 많이 확보되어 있는 물마 (D. alata)의 EST에 관한 공개 정보를 이용하였다.

상기 다운로드한 EST 서열에 대해 프로그램Tandem Repeats Finder (http://tandem.bu.edu/trf/trf404.win.download.html)이용하여 표지화에 적합한 것으로 추정되는 즉, 반복영역의 반복단위가 서로 다르고 연속된 염기 3bp 이상이고 반복횟수 5회 이상이거나 총 반복서열의 길이가 15bp 이상으로 구성된 총 4개의 SSR 좌위를 선발하였다.

반복 단위가 3개 이상의 염기로 구성되어 있는 SSR 좌위를 선발한 이유는 PCR에서 일반적으로 중합효소가 DNA말단에 염기 A를 비특이적으로 추가하는 특성을 감안할 때, 증폭단편들의 크기 차이를 구별하는 데 유리하고, 해상도가 다소 떨어진 아가로스 전기영동 법 등으로도 분석 가능할 수 있음을 고려한 것이다.

상기 선발된 총 4개의 SSR 좌위에 대해 프로그램 Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 프라이머를 디자인하였다.

선발된 SSR 좌위와 그 각각에 대해 디자인된 프라이머 서열을 아래의 [표 2]에 정리하였다.

<실시예 4> 중합효소연쇄반응에 의한 반복서열 증폭

중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 20ng(2ul) 이상의 핵 DNA, 10pmole의 합성된 올리고 프라이머 쌍(각 쌍의 프라이머 중 하나는 형광 표지된 프라이머임), 그리고 PCR Kit 제조사(Quiagen, USA)의 매뉴얼에 따라서 조성된 반응액 20ul과 Tprofessional cycler(Biometra, Germany)를 이용하여 실시하였다. PCR 프로그램은 94℃에서 2분 1회, 그리고 94℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 30초를 35회 반복, 72℃에서 3분으로 설정하였다.

<실시예 5> PCR 산물의 분리 및 DNA 다형성 분석

각 쌍의 프라이머 중 하나를 형광 표식된 프라이머 형태로 합성하여, PCR 산물을 만들고, 정제한 다음, 해상도가 1bp인 ABI3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, USA)을 이용한 모세관 전기영동으로 증폭 단편들을 분리하고, GeneMapper(Applied Biosystems, USA)로 단편의 크기 값을 산출하였다(아래의 [표 1] 참조).

분리된 DNA 단편들의 크기 값 즉, 산출된 이형 단편(alleles)의 크기(bp) 데이터로 각각의 SSR 좌위에 대한 이형유전자의 수를 산출하였으며, 분자 마커의 식별력을 판단하기 위해서 널리 이용되고 있는 다형성 정보 함량(polymorphism information content, PIC, Anderson et al. (1993) Genome 36:181)은 프로그램 PowerMarker v3.25 (Liu K, Muse SV. PowerMarker : integrated analysis environment for genetic marker data . Bioinformatics 2005 ; 21 : 2128 - 2129, http://statgen.ncsu.edu/powermarker/)이용하여 아래의 식에 따라 산출하였다.

상기 식에서 p_i 는 i번째 이형 단편의 빈도(frequency)이다. 어떤 마커 좌위의 PIC 값이 0.5이상이면 그 좌위의 유전적 다형성이 높은 것으로 본다(Anderson et al. (1993) Genome 36:181).

그리고 상기 프로그램의 계산식 UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean; Michener and Sokal 1957)를 이용하여 개별 유전자형 간의 관계 값을 산출하고, TreeView v1.6.6 (Page 1996)을 이용하여 가시화하였다.

증폭 단편의 크기, 이형유전자의 수 및 PIC를 아래의 [표 3]에 정리하여 나타내었으며, 상기 4개의 SSR 마커로 산출된 총 12개의 유전자형 간의 관계를 [도 1]에 정리하여 나타내었다.

상기 [표 3]의 결과는 본 발명의 4개의 SSR 마커 모두 0.811 내지 0.894의 PIC 값을 나타내었다. 이는 이들 마커를 단독으로 또는 조합하여 사용할 경우 마 유전자원의 식별이 가능할 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

실제 [도 1]에서 확인되듯이, 4개의 SSR 마커의 증폭 결과를 이용하여 UPGMA 방법으로 상대적인 유전적 거리를 이용하여 계통수를 작성하였을 때 시료로서 사용된 총 12개의 마 유전자원이 각각 달리 분류됨으로써 서로 간에 구분이 가능하였다. 또한 시료로 사용된 상기 [표 1]의 시료 중 괴경이 가늘고 긴 방추 모양으로 식물체의 형태로서는 그 차이를 구별하기가 어려운 유전자원들(일련번호 8~11의 시료)도 용이하게 구분될 수 있었다.

상기 결과들은 상기 [표 1]의 12개체의 마 식물체가 각각 달리 분류됨으로써 상기 선발된 총 4개의 SSR 마커가 마 유전자원의 식별을 위한 분자 표지로서 적합함을 보여주는 것이라 할 수 있다.

<실시예 6> 아가로스 젤에 의한 재현상 분석

상기 <실시예 5>의 모세관 전기영동을 이용한 ABI3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, USA)는 해상도가 1bp로 높지만 이를 이용할 경우 분석에 고비용이 소요되므로, 더 용이하고 저렴한 방법인 아가로스 젤 (3% 또는 4%) 전기영동과 그리고 HAD-GT12 SYSTEM (eGENE, USA)와 QIAxcel DNA High Resolution Kit (Quiagen, USA)를 이용하여, DNA 절편의 양과 이형 DNA절편의 다양성을 분석할 수 있는지 여부도 함께 검정하였다.

결과를 [도 2]에 나타내었다. [도 2]를 참조하여 보면, 증폭된 DNA단편들간에 크기 차이가 충분히 커서(4 base pairs 이상), QIAxcel은 물론 일반적이고 비용이 저렴한 아가로스 젤 전기영동으로도 마의 종류를 용이하게 식별할 수 있음을 알 수 있다.

구체적으로 [도 2]에서 DA208-64 마커의 경우 시료 1~6까지는 Qxcel과 agarose gel에서 외관상 명확히 구분됨을 알 수 있다. 나머지 시료의 경우 마커 하나로 외관상 구분이 어렵지만 다른 마커들과 조합하여 판단할 경우 외관상 구분이 가능하다.

또한, 육안으로 구별이 복잡하거나 어려운 경우는 HAD-GT12 SYSTEM의 운용 소프트웨어인 BIOCALCULATER로 증폭 단편의 농도와 크기 값을 엑셀 시트 형대로 전환하여, 그 값을 유전자형 분석에 활용할 수 있다. 참고로 도 2에서 [표 1]의 시료 중 시료 11개에 대해서만 분석한 이유는 QIAxcel DNA High Resolution Kit 의 채널 수가 12개로 제한되어 있기 때문이다.

<110> SM Industry Academic Cooperation Foundation <120> Transgenic Mouse Useful for Researching the Function of Ephrin-A5 Gene and the Method For Preparing the Same <130> PP11-000-SMIACF <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5531 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atccatatcc tctcttacct caggaaagtt gtcaggaaat tatgcatccg tttccctcac 60 acttgaggta gagactcttc cctctgtgtg tttattatag ggcactttgt agaattttca 120 gattataaga atgattatgc tttgacacat agagtatggt ttagaattca tttcattttt 180 aaaaaatatt atattggtcc atgcacttgg agagatgatt gttacagtca agccaattag 240 catgcccaat ctcttcagta cacaataaaa ttttcttcct tccttccttc cttccttcct 300 tccttccttc cttccttcct tcctctctct ctctctctct ctctctttct ctctctctct 360 cccttccttc cttccttttt tttttttttt tttgagatgg ggtttctctg tggctgtctg 420 actgtctaga attcactctg tagactaggc tgggctcaaa ctcagagatc cacctgcctc 480 tgcttcccaa gtactgtgct taaaggcatg taccaccata cccagcatgt tttacatatt 540 ctttttgttt ttttttaatg ttaaaaagaa aataattcca tttattttat tttattttta 600 ttagatattt tcttcattgc atttcaaatg ctatcccctt tcctagtttc ctctccaaaa 660 atcccctatt cacttccctc ttcccctctt gccctgctcc ccaaccttcc cactcccgct 720 tcctggccct ggcatttccc tacattgggg catagaatct tcccaagacc aagggcctct 780 cctcccatta atggccgact aggtcctcct ctgctacata agcagctaga gacatatgtt 840 ttctttgatt ggtggttaac tgttgtcctc atcatgccta ttagatcttc aggtttattt 900 catattatat cactatatct tgtgtcctgt gacttcactt gttaacatca gatactaagt 960 cccaggattt atttagattc tattttctcc tctcctagaa aaggagctag actctagtca 1020 ccctggtttt ataatttgct aattaagaag acagagctaa ccaggattag tcatctcggg 1080 tttgtaaata gagctaaaat ttccttcgtt ttttttcttt ttcagctgct tagtttggtt 1140 gatatttgca aagatggatt gataatggca aagtgggtcc cacaagaaat tcatggtcag 1200 tgtactgagt ttccagatag tactggatcc tccatattta tctggagaaa acagtaatgg 1260 gttaaatctg ttggtcaggg tttagaatgg gcttttgtgg tgggtgtggt tttttgtttt 1320 tagaaaatca ggattgcctc tctaaaatgt cttacgctga gacaggtggg tgagcttctc 1380 taatgacttg aagggtatgg aataccaatg agatttaaaa ttttacctgc caagttcttt 1440 gaagtctgat cagacaaaga tatttatttg gtctggtatc ttaggataaa tttggtgatg 1500 gcatccaaac cccattgaat gcagtgcaga cagattggtt aaaatagctt ggaaagccct 1560 gatgtggaca aataaagagg ggatagacag acatttggga gggttattaa cgcatccaca 1620 gtgagtgcca ctttggggac ttttaagcat atcatgaagt acaaatttaa ttcagtcgtc 1680 tgggaacact ttggataaaa ttcagatgac ctatttagtg ctatgcaggt tcacggtaga 1740 tatgtccatc tgcagctcct tgttccaagg ttttcacaca atagatattg tctacattgt 1800 ttcttaaatc aattcagctt atgtctgaat acttgctcat cacagtttta tgtaaccgac 1860 attccccctc cccttcttca gaagaccaca atcatttaac atttgtgggg gatatacgat 1920 tggttaactc ttgcttgggc atgtgctgtg tgtcaggtac tcactgaaca atgtttctgg 1980 atggcgtcct aaatagttac tcatgaaagg aagaagtata ctgttgtgtt tacgtggaga 2040 cttctttgaa taacattgcc ttttctctag tgggtcttcc acgtctgcag cctatgtact 2100 agttggagta atctcttgag aggaagtaaa atgttcccac tgtgtgttgc ctctaaatgt 2160 ttttctttct cctaagtatt aaatggtcac agcttccacc cacccaccct ccgaaggtta 2220 ctagacgaga ggaagtagca aggctgtgtt tggggcatct gagcaaggtg actgtctcta 2280 atggggaatg acaaggatgg gtttaagaag tgacccctct attgtctcca ggacaaaacc 2340 cttccgcttg catctttcag cctgtatcac tgcttctaaa ggatccttga gcaaactgct 2400 gcatttttat taatcagctt aacttaatgg gatgaaaaga cctttgaaaa gagagcagaa 2460 ggggagccgg actgaaagtt gctcgaattc ttttccacga gaaccatttt tcttttccta 2520 ccctgatttt ctagggaaga tatttggtga tttccaggtg cttcatccgg gtagtctttc 2580 tagtttttac acacttttag agcctccctc tagccttgtg ctgcctgcag ctataaagaa 2640 gaattaatag gagttgaagg gagaaacagt ttctgaaagg aggcggaaag cttaagctga 2700 taaagctcga ctctgtcctt cttgatgggg gctgtgtttg gataactcac ccttgtctaa 2760 attcttctct tcccccatcc ttcctgcccc agtgcacctc ccctccccca cacccagcct 2820 tcttcataaa cggtagcagc tggagatctt tcagtggtat tcagggatta cgtcccttag 2880 gggttttaat aagccctgat gcctgcatca ctgcaaaggc acttctgagg acaatggcac 2940 tggggggtgg gggagtgatc atgggccctt tgaggaccca gatgataggc tgagacagca 3000 ccctgggatg cattctggaa ggcagaatgc tgaagaagga gtctacaggc tccaaagatg 3060 aaccagaagg actgtcagct tagaggtgaa ttcctgtgca gcctggatag agggcttcct 3120 gctgcctctt aacatgtggt tcattctcac ttaaaatggc tgggatgacc agttagaatt 3180 gccaccacca tggtcacatg accctatacc tacctgtacc cctgtgatga ggataccccc 3240 tgcattgctg cagggtgttg gttggcctct tttgttggtc tagggagtat tttataaggg 3300 tgcaattctg ttggctgctg ctctgtgtgt gttgtagact gtgtgggtta aaaggagtgt 3360 gacatttttt actctttttt ttaaaattta tttctgttgg aaatttaaag tgacaaaaat 3420 gtgatttaga aagagaaaaa tggtaaccat gtgaaacaat gtataaaaga gttgtcttac 3480 atggaaaaaa ataggaaatg ggaacagaca tttaaattct attaaattga actatttatt 3540 aatccacttg ggtcagtgtc atgtcagtcc atgtaaagca tgcagggcgc gcgatttgca 3600 tttatcctaa gctgaaataa gtcattttgg ctgttggtgt ttgtttcatc attgcttaca 3660 gataacttta acttttgaaa ttgttaaata tgtaaatact ttaaaattcc tccaatggac 3720 acagacattt ttaaagatgg taatcatata tatgtatata tatgtgtgtg tgtgtgtgtg 3780 tgtgtgtgtg tatacttcag aaaataaact tacaacaaac ttttgaaaag aatatcctag 3840 gagtagtttg atattaccta gtagtttgtc ccaatgtgtt taaaaagttt agttttggga 3900 ttcaggaaaa ctacctgaag accacattgt gtgtgtgggt ggggggggga gggtatctta 3960 agaatctttt agataaggtt ttgtttcttt gttttccctc agatgaaaat atacaagatg 4020 gccttttagc accacagagg gcccgtgtgt gcctcccaca tgaaattctt ggtttaaaat 4080 attcctgaaa ggattcctgg gaaagccggt gggaggagga gctttccttc gctaccaggg 4140 ccactgctct catcctattt ttatcttatg ggtttgcaaa tgcggctttt ctttctcttt 4200 ccataaggtc tgcttcgtgc ccttcaggaa agccatgttt cagagattct tttaactgcc 4260 cagttagaca ctgtttctcc tgcctgtgat agtctgtaga taccatgtgc ccttcacaga 4320 gggaatcctt gtgttcagag ttcacagacc attccacctc ttttgtcagg gggaataaaa 4380 gaaagcacac tatgatgtat aacatgataa tttcatgcag gtattaaatg tgaaggggtt 4440 aaatcaatct aaaggaagca ctatattctt gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 4500 agggttgata agacctaaaa tttatactcc gcagtctttg agggtacagt acagtgttaa 4560 gtgtaggttc aatgatgtgt gtgcatcctt gaaacatatt cccctgttta gttgaagttt 4620 tatgttctta acccatatgg gtaaattatc ccactggtag atttctggac acatgaccta 4680 agattgatta tgattttctt aattgctgag tgacggtggt cgaaggtgct ttcgaaatac 4740 catctgcctt gtctctgaca cagcctgtgg ttcctagaca gtgtccttct ctggcggtag 4800 ttagcaggaa gcagtagtga gggccatgtg aggttcatcg tcgtcggaca gagcttgggc 4860 tcagtgtgga gctgcagagt caggaagcag ctgttctttg tctgggtgga cagtcattga 4920 tttttaaata cttgggcctc ctgatggcat agaaacccat ttgtgcctct ttagattaag 4980 gttaattttt gtggtggttt gtgcagatac atgaacagat gctgtgcact taactgcggc 5040 atttagactt actctttata cttaaaaatg aaatttagtt aaaaatcaaa tgcatcatta 5100 ggtcataaaa agaaaagggg cgtccttaaa caggatacat cgcatcaaat ggaaccttag 5160 tccttgccct ggaaaacctg ggcgttgagg ctttagacgt ggaatgttgg taattggctg 5220 tgcacacatt ctgccacgct aataggtaat atgtccctga agcgccaata atttgagaac 5280 aaagatgttt attcattttc tcaacatagt gaaaatgtgt tttcaaaaca tatttgaatt 5340 ttcacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaga cacacacaca 5400 cacacagagt atattagcat ataactcaaa tgtgccactc gttcccagac agtccctggg 5460 gagaaggcac ccagagtatg ggaaggctgt gattgaccca gtgcagagta gcactctcat 5520 ctgtctctcg g 5531 <210> 2 <211> 439 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 ggcccggcgg gccggtgtat gtctccccgc agccgcggcg ctcaactccc cgtgactgtg 60 cagcgcgcgc cgccgcctgc cccgacccgc gctgccgccg cccggccccg cacgcacctc 120 cctctcccgg ggtgaccggc ttgcagccgc cgcccgagac acagctccgc acccctaccc 180 ccgccctcgc cgccgccacc gcacacacgc acgcgtctct ccgtcttgtg attcttctcc 240 cctcccgagc ccttcagtgg gggtgcgagt ttgtcccccc gccccagcca ctgcctcctt 300 cttctctctc tcctcttcct cttcctcccg cgctcgccgc gcgcctctcg ccccttcatc 360 gtatttattc ctatttattt ggcgtccgct ctcttcgtct gcccctctcc ctccctcccc 420 ctggatcccc gatctctcc 439 <210> 3 <211> 612 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gtctactgga acagcagcaa ccccaggtaa ggtggccggg gcgggggcgc caaaagctcg 60 ggctccgcgg gcctgggccg ggagcagggg acacggcggc cgggagcggc gcgcaccagc 120 cgcaggcagc gcgcgccctc ggagcctgcg tcgccagacg ccgctggccg cccggcgccg 180 gcgggaagcg ctcgctccgc gccgctcttt gttaagccag ggcggcaggg ccggcggctg 240 ctagcaatcc ccagggctgc gcggagccgc tgcctccgac cgggtgcggg gaagacacgg 300 gaatgggcgg gagccccgga cccgggccat cgcttcccag tcggggagat tggcccgcac 360 ctccggatcc cggcttagag cttgggtgct ggtagcctcg ggtgcgtact gccaagaggt 420 cctccctgga gcctgggggg cgcggggctg aggccgggat cctgatagat agcatcaaag 480 ttttcttttt tttttaattt taaaattttt acttaaacat aatgccttct tttacctcct 540 tgcgcgcata gagagagcgc gtaccggtta gagggaagca aaggggggtt ggagggatgg 600 gtgagtggaa ag 612 <210> 4 <211> 1305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fused DNA sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1302) <400> 4 atg ttg cac gtg gag atg ttg acg ctg ctc ttt ctg gtg ctc tgg atg 48 Met Leu His Val Glu Met Leu Thr Leu Leu Phe Leu Val Leu Trp Met 1 5 10 15 tgt gtg ttc agc cag gac ccg ggc tcc aaa gtc gtc gcc gac cgc tac 96 Cys Val Phe Ser Gln Asp Pro Gly Ser Lys Val Val Ala Asp Arg Tyr 20 25 30 gcc gtc tac tgg aac agc agc aac ccc aga ttc cag agg ggt gac tac 144 Ala Val Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Pro Arg Phe Gln Arg Gly Asp Tyr 35 40 45 cac att gat gtc tgt atc aat gac tac ctg gat gtt ttc tgc cct cac 192 His Ile Asp Val Cys Ile Asn Asp Tyr Leu Asp Val Phe Cys Pro His 50 55 60 tat gag gac tct gtc cca gaa gac aag act gag cgc tac gtc ctg tac 240 Tyr Glu Asp Ser Val Pro Glu Asp Lys Thr Glu Arg Tyr Val Leu Tyr 65 70 75 80 atg gtg aat ttt gat ggg tac agt gcc tgc gac cac acg tcc aaa ggg 288 Met Val Asn Phe Asp Gly Tyr Ser Ala Cys Asp His Thr Ser Lys Gly 85 90 95 ttc aag aga tgg gaa tgt aac cgg cct cac tcc cca aac gga ccg ctg 336 Phe Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro His Ser Pro Asn Gly Pro Leu 100 105 110 aag ttc tcg gaa aaa ttc cag ctc ttc act ccc ttt tct tta gga ttt 384 Lys Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe 115 120 125 gaa ttc agg cca ggc cga gag tat ttc tac atc tcc tct gca atc cca 432 Glu Phe Arg Pro Gly Arg Glu Tyr Phe Tyr Ile Ser Ser Ala Ile Pro 130 135 140 gac aac gga aga agg tcc tgt cta aag ctc aaa gtc ttt gtg aga cca 480 Asp Asn Gly Arg Arg Ser Cys Leu Lys Leu Lys Val Phe Val Arg Pro 145 150 155 160 aca aat agc tgt atg aaa act ata ggt gtt cat gat cgt gtt ttc gat 528 Thr Asn Ser Cys Met Lys Thr Ile Gly Val His Asp Arg Val Phe Asp 165 170 175 gtt aac gac aaa gta gaa aat tca tta gaa cca gca gat gac acc gta 576 Val Asn Asp Lys Val Glu Asn Ser Leu Glu Pro Ala Asp Asp Thr Val 180 185 190 cat gag tca gcc gag cca tcc cgc ggt gag aac ccc aaa tct tgt gac 624 His Glu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Gly Glu Asn Pro Lys Ser Cys Asp 195 200 205 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga 672 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 210 215 220 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 720 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 225 230 235 240 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 768 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 245 250 255 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 816 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 260 265 270 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 864 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 912 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 290 295 300 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag 960 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 305 310 315 320 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1008 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 325 330 335 acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg 1056 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 340 345 350 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1104 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 355 360 365 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1152 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 370 375 380 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1200 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 385 390 395 400 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1248 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 405 410 415 gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1296 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 420 425 430 ggt aaa tga 1305 Gly Lys <210> 5 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 5 Met Leu His Val Glu Met Leu Thr Leu Leu Phe Leu Val Leu Trp Met 1 5 10 15 Cys Val Phe Ser Gln Asp Pro Gly Ser Lys Val Val Ala Asp Arg Tyr 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Pro Arg Phe Gln Arg Gly Asp Tyr 35 40 45 His Ile Asp Val Cys Ile Asn Asp Tyr Leu Asp Val Phe Cys Pro His 50 55 60 Tyr Glu Asp Ser Val Pro Glu Asp Lys Thr Glu Arg Tyr Val Leu Tyr 65 70 75 80 Met Val Asn Phe Asp Gly Tyr Ser Ala Cys Asp His Thr Ser Lys Gly 85 90 95 Phe Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro His Ser Pro Asn Gly Pro Leu 100 105 110 Lys Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe 115 120 125 Glu Phe Arg Pro Gly Arg Glu Tyr Phe Tyr Ile Ser Ser Ala Ile Pro 130 135 140 Asp Asn Gly Arg Arg Ser Cys Leu Lys Leu Lys Val Phe Val Arg Pro 145 150 155 160 Thr Asn Ser Cys Met Lys Thr Ile Gly Val His Asp Arg Val Phe Asp 165 170 175 Val Asn Asp Lys Val Glu Asn Ser Leu Glu Pro Ala Asp Asp Thr Val 180 185 190 His Glu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Gly Glu Asn Pro Lys Ser Cys Asp 195 200 205 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 210 215 220 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 225 230 235 240 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 245 250 255 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 260 265 270 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 290 295 300 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 305 310 315 320 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 325 330 335 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 340 345 350 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 355 360 365 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 370 375 380 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 385 390 395 400 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 405 410 415 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 420 425 430 Gly Lys <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcccggcgg gccggtgtat gtctccccgc ag 32 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagctcggag agatcgggga tccag 25 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcggccgctg ctctttctgg tgctctgg 28 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgcatcttt ccactcaccc atccct 26 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggccaagtcg gccggtgtat gtctccccgc agccgc 36 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gagctcggag agatcgggga tccag 25 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcggccgcta gcactctcat ctgtctctcg g 31 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atgcatggca cttgtggtca cagaaatag 29 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ttagctagct aaagcactga aaagtagacc caag 34 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcggccgcat ttacttcagt gtgaagccac tgt 33 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 actagtgttt taaggctgca gtaatcactg t 31 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcggccgctc tgaaaattct acaaagtgcc cta 33 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctagcatcc atatcctctc ttacctcagg a 31 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcggccgccc gagagacaga tgagagtgct act 33 <210> 20 <211> 434 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fused protein <400> 20 Met Leu His Val Glu Met Leu Thr Leu Leu Phe Leu Val Leu Trp Met 1 5 10 15 Cys Val Phe Ser Gln Asp Pro Gly Ser Lys Val Val Ala Asp Arg Tyr 20 25 30 Ala Val Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Pro Arg Phe Gln Arg Gly Asp Tyr 35 40 45 His Ile Asp Val Cys Ile Asn Asp Tyr Leu Asp Val Phe Cys Pro His 50 55 60 Tyr Glu Asp Ser Val Pro Glu Asp Lys Thr Glu Arg Tyr Val Leu Tyr 65 70 75 80 Met Val Asn Phe Asp Gly Tyr Ser Ala Cys Asp His Thr Ser Lys Gly 85 90 95 Phe Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro His Ser Pro Asn Gly Pro Leu 100 105 110 Lys Phe Ser Glu Lys Phe Gln Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe 115 120 125 Glu Phe Arg Pro Gly Arg Glu Tyr Phe Tyr Ile Ser Ser Ala Ile Pro 130 135 140 Asp Asn Gly Arg Arg Ser Cys Leu Lys Leu Lys Val Phe Val Arg Pro 145 150 155 160 Thr Asn Ser Cys Met Lys Thr Ile Gly Val His Asp Arg Val Phe Asp 165 170 175 Val Asn Asp Lys Val Glu Asn Ser Leu Glu Pro Ala Asp Asp Thr Val 180 185 190 His Glu Ser Ala Glu Pro Ser Arg Gly Glu Asn Pro Lys Ser Cys Asp 195 200 205 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 210 215 220 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 225 230 235 240 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 245 250 255 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 260 265 270 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 275 280 285 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 290 295 300 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 305 310 315 320 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 325 330 335 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 340 345 350 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 355 360 365 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 370 375 380 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 385 390 395 400 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 405 410 415 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 420 425 430 Gly Lys

Claims (7)

1. (a) 식별 대상 마 식물체로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계, (b) 서열번호 1 내지 4의 SSR DNA 마커 중 하나 이상을 증폭하는 단계, 및 (c) 그 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 마 유전자원의 식별 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 마 유전자원은 마 속(Dioscorea sp .) 식물체에 속하나 하나 이상의 유전적 형질에서 차이를 나타냄으로써 서로 다른 종 또는 서로 다른 품종으로 분류되고 있거나 분류될 필요가 있는 마 식물체인 것을 특징으로 하는 마 유전자원의 식별 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 SSR 마커의 증폭 단계의 수행을 위한 프라이머는 서열번호 1의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머이고,
   서열번호 2의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머이며,
   서열번호 3의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머이며,
   서열번호 4의 SSR 마커에 대해서는 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 마 유전자원의 식별 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출 단계는 모세관 전기영동 또는 겔 전기영동을 수행함에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 마 유전자원의 식별 방법.
   
5. 서열번호 1의 SSR 마커의 증폭용 프라이머, 서열번호 2의 SSR 마커의 증폭용 프라이머, 서열번호 3의 SSR 마커의 증폭용 프라이머 및 서열번호 4의 SSR 마커의 증폭용 프라이머 중 하나 이상의 프라이머를 포함하는 마 유전자원의 식별 키트.
   
6. 제5항에 있어서,
   서열번호 1의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머이고,
   서열번호 2의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머이며,
   서열번호 3의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머이며,
   서열번호 4의 SSR 마커의 증폭용 프라이머는 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머인 것을 특징으로 하는 마 유전자원의 식별 키트.
   
7. 제5항에 있어서,
   상기 마 유전자원의 식별 키트는 DNA 서열을 증폭하기 위한 수단, 게놈 DNA 분리 수단 및 키트의 사용 방법을 교시한 설명서 중 하나 이상을 추가로 포함함을 특징을 하는 마 유전자원의 식별 키트.

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