KR102215717B1 - 쑥 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

본 발명의 쑥 품종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 쑥 품종 판별용 키트 및 이를 이용한 쑥 품종 판별 방법에 관한 것으로, 쑥의 유전적인 식별을 통한 품질규격과 유통질서의 확립을 위한 체계적인 품종관리에 활용가능하다.

Description

쑥 품종 구별을 위한 SSR 마커 및 이의 용도{SSR markers for discriminating of foremost mugwort and use thereof}
본 발명은 쑥 품종 구분을 위한 프라이머 및 이를 이용한 쑥 품종 인식방법에 관한 것이다.
쑥은 국화과의 쑥(Artemisia)속에 속한 식물로 기후나 토양에 잘 적응하는 광역성 식물로 전 세계적으로 널리 분포하는데 지구 북반구에 약 200~300 여종이 있는 것으로 알려져 있다. 쑥 속 식물의 형태적인 특성에 관한 연구에 의하면, 쑥 수집종을 수집 지역에 따라서 북부, 중부, 남부로 나누었을 때 경장, 경태 및 엽폭은 남쪽 지방으로 내려갈수록 작아지는 경향이 있고, 엽장이 길면 엽폭도 넓었다. 수집된 종의 분지 수는 15~55개로 수집종간 차이가 컸다. 그러나 쑥 속 식물은 동일종에서도 생육단계 및 생육환경에 따라 매우 다르기 때문에 분류가 어려워 정확한 종의 동정법에 관한 연구가 필요하다.
일반적으로 쑥은 학명보다 편의상 지방 명으로 불리고 있으며, 민간요법에서 이용하기 위하여 쑥을 채취하고자 할 때는 정확한 동정이 어려워 여러 가지 쑥 속 식물을 혼합 사용하게 된다. 또한 쑥속 식물은 타가 수정을 하기 때문에 동일 속의 쑥이라 할지라도 생육단계 및 환경에 따라 매우 다르다. 현재 이들 쑥에 대해 계통학적 위치와 분류학적 특성을 이용한 동정이 제대로 이루어지지 못하고 있는바, 쑥의 유전적인 식별을 통한 품질규격과 유통질서의 확립을 위한 체계적인 품종관리 방법이 필요한 실정이다.
일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정 방법과, 종 또는 품종 간 동위효소의 차이를 통한 검정 방법, 그리고 DNA에 기초한 분자 마커를 이용한 검정 방법으로 나뉜다.
이 중 분자 마커를 이용한 검정 방법은 작물의 유전·육종연구에서 유전적 다양성과 계통 유연관계 분석 그리고 식물 유전자원의 보존과 관리 등에 유용한 정보를 제공하고 있으며, 표현형에 근거한 전통적인 식별 방법에 비해 재배 환경 및 작물의 생장 단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점을 가진다.
국제 신품종 보호 연맹(UPOV)은 품종 식별을 위하여 분자 마커의 활용을 고려 중에 있으며, 특히 품종 간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(simple sequence repeat or microsatellite), SNP(single nucleotide polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 등을 이용하는 것을 제안하고 있다.
분자 마커 중 SSR을 이용한 분석법은 품종 식별과 유전자원 관리에 널리 이용되고 있는데, 그 이유는 유전체 상에 SSR 변이가 널리 존재하며, 개체 식별에 이용될 수 있을 만큼 변이가 풍부할 뿐만 아니라, 연쇄중합반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 그 변이를 신속하고 용이하게 검출할 수 있기 때문이다.
대한민국 등록특허 제10-1493980호
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 서열번호5 및 6로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 쑥의 품종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 프라이머 세트를 포함하는 쑥 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 조성물을 포함하는, 쑥 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 (a) 분석하고자 하는 쑥 시료부터 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고 서열번호5 및 6로 표시되는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계 및 (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 쑥의 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명의 하나의 양태로, 서열번호5 및 6로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 쑥의 품종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 상기 쑥은 국화과의 쑥(Artemisia)속의 식물로, 구체적으로 사자발 쑥, 섬애 쑥, 싸주아리 쑥을 포함한다.
상기 “사자발 쑥”은 강화 자생약쑥 중 가장 품질이 우수한 약쑥으로 키가 70cm 내외로 자라며 줄기가 다소 굵고 곧게 자란다. 잎 모양은 사자발바닥 모양으로 단순하게 갈라져 있고 잎 끝이 뾰족하면서 약간 위로 오므라진 형태이다.
상기 “섬애 쑥”은 황해쑥(Artemisia argyi)의 변이종으로서 남해 지역에서 자생하는 약쑥(남해 약쑥)으로 알려져 있고, 초년기에는 잎의 형태가 국화 잎처럼 끝이 둥글고 넓은 편이며, 줄기가 가늘고 흰 솜털이 많은 형태로 전체 길이가 50 cm 내외로 자라는 특성이 있다. 섬애쑥은 삼각상 난형으로 중부 잎의 접힘이 심한 일반 쑥과 달리, 마름모형으로 평평한 상태를 유지한다.
상기 “싸주아리 쑥”은 강화에서 예부터 자생하고 있는 약쑥으로, 향이 높고 잎 뒷면이 희며, 잎 형태가 새의 날개 모형이면서 평평하고, 줄기가 부드럽고, 흰색을 띠고 있다.
본 발명에서 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에서 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 3종의 쑥 시료(섬애, 사자발, 싸주아리)에서 유전자를 분석하여, 상기 3종에서 쑥에서 다형성을 보일 것으로 예측되는 120개의 SSR loci를 발굴하였다. 이들의 프라이머 세트를 제조하여 증폭 효율, 반복유형, 다형성 여부를 종합적으로 고려하여 16개의 SSR 마커(SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-010, SJAR-SSR-016, SJAR-SSR-021, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-030, SJAR-SSR-032, SJAR-SSR-045, SJAR-SSR-077, SJAR-SSR-082, SJAR-SSR-084, SJAR-SSR-091, SJAR-SSR-098, SJAR-SSR-112, SJAR-SSR-114, SJAR-SSR-120)를 선별하고, 상기 16개의 SSR 마커를 이용하여 3종의 쑥 시료에서 유전자형을 분석한 결과, 이 중 SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098는 1개의 대립 유전자가 검출되었으며, SJAR-SSR-021의 경우 6개의 대립 유전자가 검출되었다. 주요 대립유전자 빈도(Major allele frequency, MAF)는 SJAR-SSR-021에서 0.17로 가장 낮게 나타났으며, SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, 및 SJAR-SSR-098에서 1.00로 가장 큰 값을 가짐을 확인하였다. 또한, 다형성 정보 함유량(PIC) 값을 분석한 결과, SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098에서는 PIC 값이 0 으로 나타났으며, 나머지 13종(SJAR-SSR-010, SJAR-SSR-016, SJAR-SSR-021, SJAR-SSR-030, SJAR-SSR-032, SJAR-SSR-045, SJAR-SSR-077, SJAR-SSR-082, SJAR-SSR-084, SJAR-SSR-091, SJAR-SSR-112, SJAR-SSR-114, SJAR-SSR-120)에서 PIC 값이 0.24 내지 0.81로 나타났으며, 이 중 SJAR-SSR-021의 PIC 값이 0.81로 가장 높게 나타났다.
또한, 도 2 내지 17에서 16종의 SSR 마커를 이용하여 유전자형 분석결과, 3개의 SSR 마커(SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098)의 경우, 각 품종에서 그래프의 형태 및 위치가 동일하여, 상기 3종의 쑥 시료(섬애, 사자발, 싸주아리)를 구분할 수 없었으나, 나머지 13개의 SSR 마커(SJAR-SSR-010, SJAR-SSR-016, SJAR-SSR-021, SJAR-SSR-030, SJAR-SSR-032, SJAR-SSR-045, SJAR-SSR-077, SJAR-SSR-082, SJAR-SSR-084, SJAR-SSR-091, SJAR-SSR-112, SJAR-SSR-114, SJAR-SSR-120)에서는 그래프의 위치 및 모양이 품종에 따라 상이하며, 상기 3종의 쑥의 품종을 구별할 수 있음을 확인하였다.
즉, PIC 값이 0으로 나타난 SSR 마커 3종(SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098)을 제외한 나머지 13개의 SSR 마커(SJAR-SSR-010, SJAR-SSR-016, SJAR-SSR-021, SJAR-SSR-030, SJAR-SSR-032, SJAR-SSR-045, SJAR-SSR-077, SJAR-SSR-082, SJAR-SSR-084, SJAR-SSR-091, SJAR-SSR-112, SJAR-SSR-114, SJAR-SSR-120)를 이용하여 사자발 쑥, 섬애 쑥, 및 싸주아리 쑥을 구분할 수 있음을 확인하였다. 또한, 다형성이 높은 SJAR-SSR-021이 상기 3종의 쑥의 품종을 동시에 구분하는데 효과적임을 확인하였다.
상기 SJAR-SSR-010은 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-016은 서열번호3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-021는 서열번호5 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-030은 서열번호7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-032은 서열번호9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-045는 서열번호11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-077은 서열번호13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-082는 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-084는 서열번호17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-091은 서열번호19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-112는 서열번호21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-114는 서열번호23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있으며, SJAR-SSR-120은 서열번호25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호5 및 6로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하며, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함할 수 있다.
상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명의 하나의 양태로, 상기 프라이머 세트를 포함하는 쑥의 품종 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 쑥의 품종 판별용 조성물은 서열번호5 및 6로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하며, 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는, 쑥 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에서 프라이머 세트, 쑥에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트에서, 상기 프라이머 세트 이외에 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 구체적으로 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로 (a) 분석하고자 하는 쑥 시료부터 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고 서열번호5 및 6로 표시되는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계 및 (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 쑥의 품종 판별 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 쑥 시료는 쑥의 종자, 뿌리, 잎, 줄기 또는 화기(꽃), 이삭을 포함하는 식물체의 조직에서 유래한 모든 기관 및 세포, 캘러스, 식물 조직의 선발, 배양 및 식물체의 재분화를 위해 형질전환된 조직을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 쑥 시료는 쑥속 식물에서 유래된 것으로, 구체적으로 사자발 쑥, 섬애 쑥, 싸주아리 쑥에서 유래된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 이들 건조물에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 (a) 단계의 DNA 추출은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호5 및 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 표적서열을 증폭 시키는 것이다.
본 발명에서 표적서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.
또한, 상기 (b) 단계는 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍을 더 이용할 수 있다.
상기 (c) 단계의 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5, Cy-3 또는 6-FAM을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다
본 발명의 쑥 품종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 쑥 품종 판별용 키트 및 이를 이용한 쑥 품종 판별 방법에 관한 것으로, 쑥의 유전적인 식별을 통한 품질규격과 유통질서의 확립을 위한 체계적인 품종관리에 활용가능 하다.
도 1은 16개의 다형성 SSR 마커를 사용하여 사자발 쑥(SJB), 섬애 쑥(SA) 및 싸주아리 쑥(SJAR)의 3개 쑥 시료간의 유전적 거리를 토대로 작성한 UPGMA dendrogram이다.
도 2 내지 17은 SSR 마커 16종을 이용한 품종별 유전자형(Genotyping) 분석한 결과이다. SA는 섬애 쑥, SJAR은 싸주아리 쑥, SJB는 사자발 쑥을 나타낸다. 구체적으로 도 2는 SJAR-SSR-02, 도 3은 SJAR-SSR-10, 도 4는 SJAR-SSR-16, 도 5는 SJAR-SSR-21, 도 6은 SJAR-SSR-24, 도 7은 SJAR-SSR-30, 도 8은 SJAR-SSR-32, 도 9는 SJAR-SSR-45, 도 10은 SJAR-SSR-77, 도 11은 SJAR-SSR-82, 도 12는 SJAR-SSR-84, 도 13은 SJAR-SSR-91, 도 14는 SJAR-SSR-98, 도 15는 SJAR-SSR-112, 도 16은 SJAR-SSR-114, 도 17은 SJAR-SSR-120 마커를 이용하여 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
<실시예1> 시료의 확보 및 genomic DNA 분리
섬애(SA), 사자발(SIB), 싸주아리(SJAR) 쑥 시료는 국립농업과학원으로부터 genomic DNA (이하 gDNA) 또는 잎 시료 상태로 제공받았다. gDNA의 분리는 Biomedicⓡ Plant gDNA Extraction Kit (Biomedic Co., Ltd., Korea; www.ibiomedic.co.kr)를 사용하여 제조회사의 지침에 따라 수행하였다. 추출한 gDNA의 DeNovix DS-11+ 분광광도계(Spectrophotometer) (DeNovix, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량 및 정성 분석하였다.
<실시예2> RNA-seq data로부터 contig assembly 및 MS 함유 contig 확보
3개 쑥 시료(섬애, 사자발, 싸주아리)에 대한 RNA-seq data는 Solexa QA package의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 이용하여 트리밍(trimming)을 수행하였다. DynamicTrim은 phred score에 따라 short read의 양쪽 끝의 bad quality base를 제거하였다(phred score≥20). LengthSort를 이용하여 위의 과정에서 너무 많이 잘린 reads를 제거하는(short read length≥25) 전처리 과정을 수행하였다. 전처리 과정에서 선발된 reads를 대상으로 Velvet과 Oases 프로그램의 프로토콜에 따라 de novo assembly를 수행하였다. 최적의 assembly를 위하여 최적의 k-mer를 찾고 k-mer 분포를 확인하였다. MISA 소프트웨어(http://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)를 이용하여 1 개체에 대해 최적의 assembled contigs로부터 MS를 유형별(2~6 repeats)로 추출하였다. MS 선발기준은 repeat이 최소 5회 이상 반복되는 것을 기준으로 하였다.
<실시예3> 다형성(Polymorphic) MS 후보 마커의 발굴 및 프라이머 디자인
Polymorphic MS 마커 후보의 발굴을 위하여 MS 함유 assembled contigs를 CLC Genomics Workbench (CLC Bio, Aarhus, Denmark)를 이용하여 multiple alignment를 수행하여 MS 다형성 여부를 in silico 상에서 파악하였다. 다형성 MS 영역의 증폭을 위한 프라이머는 Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 사용하여 디자인하였으며, 증폭크기는 120-400 bp, 어닐링 온도는 57 내지 60℃로 설정하였다. Hairpin, self dimer, hetero dimer 형성 여부 등은 IDT oligo analyzer (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)를 이용하여 분석하였다. 선정된 프라이머(primer)를 이용하여 PCR과 아가로스 겔 전기영동 분석 또는 ABI3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)를 이용한 fragment analysis를 통해 다형성 여부를 실험적으로 검정하였다.
<실시예4> 유전자형 분석(Genotyping)
PCR 반응은 5 ng 게놈 DNA, 5 ㎕의 2x HSTM Taq DNA 중합효소 혼합액(DongSheng Biotech., Guangzhou, China), 각 0.3 ㎕의 정방향과 역방향 프라이머(각 10 μM)를 포함하는 10 ㎕의 반응부피에 ABI 2720 Thermalcycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 정방향 프라이머의 5' 말단은 형광염료인 6-FAM (Applied Biosystems)으로 표지하여 증폭산물의 형광 표지가 이루어지도록 하였다.
PCR 증폭을 위한 조건은 다음과 같다:
초기 열변성(1회)-95℃ 5분;
DNA 증폭(총 35회 반복)-95℃ 30초, 56-57℃ 30초, 72℃ 30초;
최종 신장 반응(1회)-72℃ 30분.
PCR 증폭산물은 증폭여부를 확인하기 위하여 2% (w/v) 아가로스 겔에서 전기영동하였다. PCR 증폭 후, 1 ㎕의 PCR 증폭산물을 9 ㎕의 Hi-Di formamide 및 GeneScanTM500 LIZ　사이즈스탠다드(Applied Biosystems)와 혼합하였다. 혼합물은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 얼음에 방치하였다. DNA 절편은 50 cm 모세관이 장착된 ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) 상에서 모세관 전기영동을 통해 DNA 절편들을 분리하였다. 대립유전자의 크기는 GeneMapper 소프트웨어(버전 4.0; Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.
<실시예5> 데이터 분석
주요 대립유전자 빈도(MAF), 대립유전자 수(NA), 유전 다양성(GD), 다형성 정보 함유량(PIC)등을 포함한 유전적 매개변수는 PowerMarker 소프트웨어(version 3.25; Liu and Muse, 2005. Bioinformatics 21:2128-2129)를 이용하여 공유하는 대립유전자 빈도를 계산함으로써 측정하였다. UPGMA 계통수는 MEGA 소프트웨어(version 5.0)를 사용하여 작성하였다.
<결과>
<실험예1> 다형성 SSR 후보 마커의 발굴
In silico 상에서 섬애 쑥, 사자발 쑥, 싸주아리 쑥 간에 다형성을 보일 것으로 예측된 120개 SSR loci를 발굴하였다. 실시예3의 방법에 따라 합성된 프라이머 세트를 이용하여 PCR과 아가로스겔 전기영동을 통해 다형성 검정 예비 테스트를 수행하였으며, 최종 78개의 후보 마커를 선발하였다. 다형성 검정 예비 테스트를 통해 선발된 78개의 후보 마커들 중에서 증폭효율, 반복유형 등을 고려하여 44개의 후보 마커를 선발하였다. 선발된 후보 마커의 활용 가능성을 검정하기 위하여 정방향 프라이머에 대해 6-FAM 형광표지를 부착한 후 PCR을 수행하고, fragment analysis를 수행하였다. 개체당 대립 유전자 수(<2개/개체), 다형성 여부, 증폭 효율, 증폭의 명확성 등을 종합적으로 고려하여 16개의 SSR 유전좌위를 최종 선정하였다(표 1).
locus 명 프라이머 명 프라이머 서열 Ta
(℃) 		repeat type expected
size
(bp)
SJAR-SSR-02 FAM-SJAR-02_F CAATGGTGGTGGGTTGACGGTA 56 (GGT)5 257
SJAR-02_R CTCCAACCGACGCACTTTCATC 56
SJAR-SSR-10 FAM-SJAR-10_F TGGTGCTAGCTTCTTCATCA
(서열번호1)		 56 (CAT)5 203
SJAR-10_R CACCACAACTGCAACTGTACG
(서열번호2)		 56
SJAR-SSR-16 FAM-SJAR-16_F GTGGTTGGTGAGGTGAAAGAAT
(서열번호3)		 57 (ATT)9 254
SJAR-16_R CCTGGTATAATTTGGTTGGAGGG
(서열번호4)		 57
SJAR-SSR-21 FAM-SJAR-21_F CACATCCTCCTAACCTCATGG
(서열번호5)		 56 (GGT)5 294
SJAR-21_R CTTCAGCATCTGGTCATCATGC
(서열번호6)		 56
SJAR-SSR-24 FAM-SJAR-24_F GAACTAAAACCACCGATACGCAG 56 (CAT)5 210
SJAR-24_R GTTCGCCTTCTCAAGAGACTAAG 56
SJAR-SSR-30 FAM-SJAR-30_F GGATGGAGTGATGGTTGTTATGG
(서열번호7)		 56 (ATT)5 159
SJAR-30_R ACCAACCATACAACCCTAGTACC
(서열번호8)		 56
SJAR-SSR-32 FAM-SJAR-32_F CTCCTATGTTGATTCGCCAAGAG
(서열번호9)		 56 (TGA)5 184
SJAR-32_R GGAGACACTTTCCGTAAACAGATG
(서열번호10)		 56
SJAR-SSR-45 FAM-SJAR-45_F TCACCAGAATGTCCCACAAAAG
(서열번호11)		 56 (CAT)6 264
SJAR-45_R TGATATAGACCCGATGCATGCT
(서열번호12)		 56
SJAR-SSR-77 FAM-SJAR-77_F CTCCATGCGTTGAAGGTGGA
(서열번호13)		 56 (GGT)7 144
SJAR-77_R CACCTCAACCTCCTTCACGAAGT
(서열번호14)		 56
SJAR-SSR-82 FAM-SJAR-82_F GGAATCTTCCGAGCAGATGATG
(서열번호15)		 56 (TGAA)4 127
SJAR-82_R CTAACAACTCATTTCTAGGG
(서열번호16)		 56
SJAR-SSR-84 FAM-SJAR-84_F GTCCTATCACTCTTTAGTGGC
(서열번호17)		 56 (CAC)5 117
SJAR-84_R GGCTGAAGATGATGTTGATG
(서열번호18)		 56
SJAR-SSR-91 FAM-SJAR-91_F GGTGGGGTATCTATCACATT
(서열번호19)		 56 (GGA)5 185
SJAR-91_R TGGCCTGCCTAAACTCCAAC
(서열번호20)		 56
SJAR-SSR-98 FAM-SJAR-98_F CTCGGCATGAAGCTGAACATC 56 (TTG)5 148
SJAR-98_R GAAGAAAGGGAATGCAGTCGT 56
SJAR-SSR-112 FAM-SJAR-112_F CCAGGCATCATATCATTCTCGAC
(서열번호21)		 57 (ATC)5 171
SJAR-112_R TGATGAGCTTGATCATGGACC
(서열번호22)		 57
SJAR-SSR-114 FAM-SJAR-114_F CACAGTGGCGTATGGATAGAC
(서열번호23)		 56 (TTG)5 188
SJAR-114_R CCAAACACCACTGTATGTAGG
(서열번호24)		 56
SJAR-SSR-120 FAM-SJAR-120_F CTTAGCTCCATCTGATACTTGG
(서열번호25)		 56 (ATC)5 148
SJAR-120_R CATGTACCGAAGATGAACCTGTG
(서열번호26)		 56
F: 전방향 프라이머(Forward primer)/ R: 역방향 프라이머(Reverse primer)
<실험예2> 선정된 SSR 마커의 특성 분석
최종 선발된 16개의 SSR 마커를 3종류의 쑥 시료에 적용하여 fragment analysis를 수행하였다. GeneMapper를 이용하여 각 SSR 유전좌위에 대해 각 시료별 대립 유전자 크기를 분석하였다. 각 시료에 대해 분석된 대립 유전자 크기 정보를 바탕으로 PowerMarker를 이용하여 각 유전좌위의 유전적 특성을 분석하였다(도 2 내지 17, 표 2).
표 2는 16개의 SSR 유전좌위의 유전적 특성을 분석한 결과이다.
Figure 112019062974811-pat00001
상기 표 2에서 SS는 표본크기(sample size)이며, NOBS는 관측수(number of observations)이다. Availability은 1-OBS/n이며, 여기서 OBS는 관측수이고, n은 표본 추출된 개체 수이다. No는 유전자형 번호이며, MAF는, 주요 대립 유전자 빈도이며, NA는 대립유전자 수이며, GD는 유전자 다양성이다. 이형접합성(Heterozygosity)는 이형접합체 개체군의 단순한 비율이다. PIC는 다형성 정보 함유량(polymorphism information content)이다.
16개의 마커를 이용하여 3개의 시료(섬애 쑥, 싸주아리 쑥, 사자발 쑥)의 유전자형을 분석한 결과, 총 49개의 대립 유전자를 검출하였으며, 각 유전좌위당 최소 1개에서(SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098) 최대 6개의 대립 유전자를 검출하였다(SJAR-SSR-021). 주요 대립유전자 빈도(Major allele frequency, MAF)는 SJAR-SSR-021에서 0.17로 가장 낮게 나타났으며, SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, 및 SJAR-SSR-098에서 1.00로 가장 큰 값을 가짐을 확인하였다. 평균 PIC 값은 0.45였으며, SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098에서는 PIC 값이 0 으로 나타났으며, SJAR-SSR-021의 경우 PIC 값이 0.81로 가장 높게 나타났다.
즉, PIC 값이 0으로 나타난 SSR 마커 3종(SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098)을 제외한 나머지 13개의 SSR 마커(SJAR-SSR-010, SJAR-SSR-016, SJAR-SSR-021, SJAR-SSR-030, SJAR-SSR-032, SJAR-SSR-045, SJAR-SSR-077, SJAR-SSR-082, SJAR-SSR-084, SJAR-SSR-091, SJAR-SSR-112, SJAR-SSR-114, SJAR-SSR-120)를 이용하여 사자발 쑥, 섬애 쑥, 및 싸주아리 쑥을 구분할 수 있음을 확인하였다. 또한, 다형성이 높은 SJAR-SSR-021이 상기 3종의 쑥의 품종을 동시에 구분하는데 효과적임을 확인하였다.
또한, 도 2 내지 17에서 상기 16종의 SSR 마커를 이용하여 유전자형 분석결과, 3개의 SSR 마커(SJAR-SSR-002, SJAR-SSR-024, SJAR-SSR-098)의 경우, 각 품종에서 그래프의 형태 및 위치가 동일하여, 상기 3종의 쑥 시료(섬애, 사자발, 싸주아리)를 구분할 수 없었으나, 나머지 13개의 SSR 마커(SJAR-SSR-010, SJAR-SSR-016, SJAR-SSR-021, SJAR-SSR-030, SJAR-SSR-032, SJAR-SSR-045, SJAR-SSR-077, SJAR-SSR-082, SJAR-SSR-084, SJAR-SSR-091, SJAR-SSR-112, SJAR-SSR-114, SJAR-SSR-120)에서는 그래프의 위치 및 모양이 품종에 따라 상이하며, 상기 3종의 쑥의 품종을 구별할 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 16개의 SSR 마커를 이용하여 3개 쑥 시료에 대해 각 유전좌위별 공유하는 대립유전자 정보를 바탕으로 UPGMA dendrogram을 작성한 결과, 사자발 쑥(SIB)에 비해 섬애 쑥(SA)과 싸주아리 쑥(SJAR)이 유전적으로 가까움을 확인하였다(도 1).
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) Myongji University Industry and Academia Cooperation Foundation <120> SSR markers for discriminating of foremost mugwort and use thereof <130> DP20190140 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-10_Forward primer <400> 1 tggtgctagc ttcttcatca 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-10_Reverse primer <400> 2 caccacaact gcaactgtac g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-16_Forward primer <400> 3 gtggttggtg aggtgaaaga at 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-16_Reverse primer <400> 4 cctggtataa tttggttgga ggg 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-21_Forward primer <400> 5 cacatcctcc taacctcatg g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-21_Reverse primer <400> 6 cttcagcatc tggtcatcat gc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-30_Forward primer <400> 7 ggatggagtg atggttgtta tgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-30_Reverse primer <400> 8 accaaccata caaccctagt acc 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-32_Forward primer <400> 9 ctcctatgtt gattcgccaa gag 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-32_Reverse primer <400> 10 ggagacactt tccgtaaaca gatg 24 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-45_Forward primer <400> 11 tcaccagaat gtcccacaaa ag 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-45_Reverse primer <400> 12 tgatatagac ccgatgcatg ct 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-77_Forward primer <400> 13 ctccatgcgt tgaaggtgga 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-77_Reverse primer <400> 14 cacctcaacc tccttcacga agt 23 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-82_Forward primer <400> 15 ggaatcttcc gagcagatga tg 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-82_Reverse primer <400> 16 ctaacaactc atttctaggg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-84_Forward primer <400> 17 gtcctatcac tctttagtgg c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-84_Reverse primer <400> 18 ggctgaagat gatgttgatg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-91_Forward primer <400> 19 ggtggggtat ctatcacatt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-91_Reverse primer <400> 20 tggcctgcct aaactccaac 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-112_Forward primer <400> 21 ccaggcatca tatcattctc gac 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-112_Reverse primer <400> 22 tgatgagctt gatcatggac c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-114_Forward primer <400> 23 cacagtggcg tatggataga c 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-114_Reverse primer <400> 24 ccaaacacca ctgtatgtag g 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM-SJAR-120_Forward primer <400> 25 cttagctcca tctgatactt gg 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SJAR-120_Reverse primer <400> 26 catgtaccga agatgaacct gtg 23

Claims (8)

  1. 서열번호5 및 6로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사자발 쑥, 섬애 쑥 및 싸주아리 쑥로 이루어진 군에서 선택되는 한 종 이상의 쑥의 품종 판별용 SSR(Simple Sequence Repeat) 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에서,
    서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍을 더 포함하는,
    프라이머 세트.
  4. 제 1항에 프라이머 세트를 포함하는, 쑥의 품종 판별용 조성물.
  5. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 쑥 품종 판별용 키트.
  6. (a) 분석하고자 하는 쑥 시료부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고 서열번호5 및 6로 표시되는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 사자발 쑥, 섬애 쑥 및 싸주아리 쑥로 이루어진 군에서 선택되는 한 종 이상의 쑥의 품종 판별 방법.
  7. 제 6항에서,
    상기 (b) 단계에 서열번호1 및 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호3 및 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호7 및 8로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호9 및 10으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호11 및 12로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호13 및 14로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호15 및 16으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호17 및 18로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호19 및 20으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호21 및 22로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호23 및 24로 표시되는 프라이머 쌍, 또는 서열번호25 및 26으로 표시되는 프라이머 쌍을 더 이용하는 것을 특징으로 하는, 쑥의 품종 판별 방법.
  8. 제 6항에서,
    (c) 단계의 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인, 쑥의 품종 판별 방법.
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