KR102227030B1

KR102227030B1 - 국내에서 육성된 감귤 품종 구별을 위한 마이크로새틀라이트 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102227030B1
Application number: KR1020200032551A
Authority: KR
Inventors: 김호방; 우진규; 조건형
Original assignee: 주식회사 바이오메딕
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2021-03-12

Abstract

본 발명은 국내에서 육성된 감귤속(Citrus) 품종을 구별하기 위한 53개의 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 국내에서 육성된 감귤속 품종 구별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 국내에서 육성된 감귤속 품종의 구별 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 개발된 분자마커를 이용하면 국내 육성 감귤 품종의 조기 구별이 가능함으로써, 감귤 육종가의 권리를 보호하고 묘목의 품질 보증이 체계적으로 이루어질 수 있을 것으로 기대된다.

Description

국내에서 육성된 감귤 품종 구별을 위한 마이크로새틀라이트 분자마커 및 이의 용도{Microsatellite molecular markers for identifying Citrus varieties developed in Korea and uses thereof}

본 발명은 감귤의 9개 위염색체에 전체적으로 분포하는 53개의 마이크로새틀라이트 다형성에 기반한, 국내에서 육성된 감귤 품종 구별을 위한 마이크로새틀라이트(microsatellite) 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

감귤은 열대 및 아열대 지역에서 생산되는 주요 과수 작물이다. 감귤은 2017년 기준 전 세계적으로 7백 2십만 헥타르(ha)의 면적에서 1.46억 톤이 생산되었고, 스위트 오렌지 품종이 전 세계 감귤 생산량의 60% 이상을 차지한다(UNCTAD, 2017). 국내 감귤 생산량은 2017년 기준 2만 헥타르 이상의 면적에서 60만 톤이 생산되었으며, 총 생산액은 8억 3천만 달러에 달한다(www.krei.re.kr). 감귤은 비타민 C와 시트르산 뿐만 아니라 탄제레틴(tangeretin), 헤스페리딘(hesperidin)과 같은 감귤 고유의 플라보노이드를 비롯한 다양한 기능성 물질을 함유하여 사람들의 건강에 도움을 주는 중요 식품 소재이기도 하다. 감귤 생산의 경제적 가치에도 불구하고, 대부분의 감귤 품종은 체계적인 표적 육종 프로그램을 통해서가 아니라 자연교잡이나 눈 돌연변이체(bud sport mutant)로부터의 선발을 통해 이루어지고 있는 실정이다(Talon and Gmitter, (2008) Inter J Plant Genomics. article ID 528361). 감귤은 식물체의 크기, 긴 유년기(juvenility), 고도의 이형접합성(heterozygosity), 주심배 현상(nucellar embryony)과 같은 육종 장애 요인으로 인해 전통 교배육종을 통한 품종 개발이 가장 어려운 작물에 속한다.

마이크로새틀라이트(microsatellite)는 단순반복서열(simple sequence repeats, SSR)로도 불리며, 고도의 다형성, 공우성의 유전 양식, 세포 소기관을 비롯한 유전체 내에서의 광범위한 분포 등으로 인해 정보가 매우 풍부한 DNA 마커이다. 식물신품종보호연맹(UPOV)에서도 신품종임을 입증하기 위하여 마이크로새틀라이트와 같은 분자마커의 활용을 강력히 추천하고 있다(UPOV, www.upov.int). 마이크로새틀라이트는 유전 다양성과 집단 구조 연구, 유전 연관지도의 작성, 교잡배/주심배의 구분(Woo et al., (2019) Appl Biol Chem. 62:30), 품종/유전형 판별과 같은 다양한 분자유전학 분석에 널리 사용되고 있다.

국내에서는 1992년에 국립원예특작과학원 감귤연구소가 설립된 이래 체계적인 감귤 육종 프로그램이 운영되고 있다. 정부 연구기관, 육종 회사 및 개인 육종가들에 의해 현재까지 30개 이상의 품종이 눈 돌연변이, 주심배 변이, 교배 육종을 통해 육성되었다. 새로운 품종의 개발은 정부 연구기관과 육종 회사에서 운영 중인 감귤 육종 프로그램을 통해 가까운 시일 내에 급격히 증가할 것이다. 그러나 감귤 품종 구분을 통해 육종가의 권리를 보호하고, 묘목의 품질을 보장하기 위한 신뢰할 만한 기술은 아직 개발된 바가 없다.

한편, 한국공개특허 제2015-0101319호에는 '초위성체 마커를 이용한 감귤 품종식별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1784244호에는 '감귤 교잡배와 주심배 구별용 SSR 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 감귤의 9개 위염색체에 전체적으로 분포하는 53개의 SSR 다형성에 기반한 '국내에서 육성된 감귤 품종 구별을 위한 마이크로새틀라이트 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내에서 육성된 감귤 품종 구별을 위한 분자마커 개발을 위해, 감귤 품종 간에 비교 유전체 분석을 통해 감귤의 9개 위염색체에 전체적으로 분포하는 53개의 다형성 마이크로새틀라이트 마커를 확보하였으며, 상기 53개의 마커를 사용하여 국내에서 육성된 총 32점의 감귤 품종에 대해 유전형 분석을 수행한 결과, 동일한 모본으로부터 주심배 변이 또는 아조 변이에 의해 유래한 체세포 변이 품종들을 제외하고 국내에서 육성된 감귤 품종들의 대부분을 명확히 구분할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 53개의 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속(Citrus) 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SSR 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속 품종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 국내에서 육성된 감귤속 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속 품종의 구별 방법을 제공한다.

본 발명에서 개발된 마이크로새틀라이트 마커를 이용하면 국내 육성 감귤 품종의 조기 구별이 가능함으로써, 감귤 육종가의 권리를 보호하고 묘목의 품질 보증이 체계적으로 이루어질 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 감귤 표준유전체(Citrus clementina cv. Clemenules)의 9개 위염색체 상에서 본 발명의 53개 마이크로새틀라이트 유전좌위의 물리적 위치를 보여주는 지도이다. 밑줄 표시된 마커는 이전에 개발된 17개의 다형성 마이크로새틀라이트를 나타낸다. Pseudo-chr. = Pseudo-chromosome.
도 2는 53개 다형성 마이크로새틀라이트 마커를 사용하여 국내 육성 32개 감귤 품종들간의 유전적 거리를 토대로 작성된 계통도이다. 화살표 머리는 부지화(Citrus hybrid 'Shiranuhi')에서 유래한 변이 품종을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 53개의 SSR(simple sequence repeat) 프라이머 세트를 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속(Citrus) 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 상기 프라이머 세트는 구체적으로, 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 83 및 84의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 89 및 90의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 99 및 100의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 103 및 104의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 105 및 106의 SSR 프라이머 세트;를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 감귤속(Citrus)에 속하는 국내에서 육성된 감귤 품종에 대해 높은 다형성을 나타내는 마이크로새틀라이트 기반 SSR 프라이머 세트로, 상기 53개의 SSR 프라이머 세트를 모두 이용할 경우 국내에서 육성된 감귤속에 속하는 다양한 감귤 품종을 조기에 판별할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 국내에서 육성된 감귤속 품종은 이에 한정되지 않으나, 하례조생, 가온향, 가을향, 노을향, 레드산타, 빨주노초, 타라초극, 부봉, 미니향, 사라향, 삼다조생, 상도조생, 새별봉, 선킹, 설봉미, 신예감, 써니트, 윈터프린스, 인자조생, 제라몬, 탐나는봉, 탐나조생, 탐도1호, 탐도3호, 탐도리, 탐빛1호, 풍광네블오렌지, 하양조생, 미니몬, 한라몬, 제라진1호, 제라진2호, 제라진3호 또는 제라진4호일 수 있고(표 3 참고), 상기 품종 외에 눈 돌연변이, 주심배 변이 또는 교배 육종을 통해 육성될 감귤속 품종에 대해서도 본 발명에 따른 상기 53개의 SSR 프라이머 세트를 이용하면 조기에 정확한 품종 판별이 가능할 수 있다.

또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 1 내지 106의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 SSR 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속 품종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 SSR 프라이머 세트는 전술한 것과 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 상기 버퍼는 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 포함하는 완충용액을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한, 국내에서 육성된 감귤속 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속 품종의 구별 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 국내에서 육성된 감귤속 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료는 감귤 식물체의 종자, 잎, 줄기, 과실, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것일 수 있고, 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SSR 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), NED, VIC, PET 또는 ROX이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 6-FAM, NED, VIC, PET 또는 ROX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한 상기 표지 물질에는 Cy-5' 또는 Cy-3'가 포함될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물재료 및 게놈 DNA 분리

본 발명에 사용된 감귤 품종들에 대한 잎 시료는 제주특별자치도농업기술원과 국립원예특작과학원 감귤연구소에서 확보하였다. 채집한 잎 시료는 흐르는 물로 세척한 후 게놈 DNA (이하, gDNA) 추출시까지 -80℃에 보관하였다. gDNA는 Biomedic^® Plant gDNA Extraction Kit (Biomedic Co. Ltd., Bucheon, Korea)를 이용하여 추출하였고, 추출한 gDNA는 DeNovix DS-11+ Spectrophotometer (DeNovix, Wilmington, DE, USA)를 사용하여 정량하였다.

마이크로새틀라이트 후보 마커의 다형성 테스트

다형성 마이크로새틀라이트 후보 마커는 이전에 서술된 바와 같이(Woo et al., (2019) Appl Biol Chem. 62:30), 6개 감귤 그룹(레몬류, 만다린류, 사우어오렌지류, 시트론류, 오렌지류, 탄골류)에 속하는 11개 감귤 품종의 gDNA를 시료로 PCR을 수행하여 선발하였다. PCR 반응은 20 ng의 게놈 DNA, 5 ㎕의 2 x HS^TM Taq mix (Dongsheng Biotech, Guangzhou, China), 0.2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머, 0.2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머를 함유하는 10 ㎕의 반응부피에 ABI 2720 thermal cycler (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭을 위한 조건은 다음과 같다: 초기 열변성(1회)-94℃ 5분; DNA 증폭(총 30회 반복)-94℃ 30초, 55-58℃ 30초, 72℃ 1분; 최종 신장 반응(1회)-72℃ 10분. PCR 증폭산물은 증폭여부와 다형성 여부를 확인하기 위하여 2.5% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.

M13-tailed PCR에 의한 유전형 분석

선발된 다형성 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 유전형 분석은 M13-tailed PCR 방법을 사용하여 수행하였다(Schuelke M, (2000) Nat Biotechnol. 18(2):233-4.). PCR 반응은 20 ng gDNA, 5 ㎕ 2 x HS^TM Taq mix, 0.2 ㎕의 10 μM M13-tailed 정방향 프라이머, 1 ㎕의 10 uM reverse primer, 1 ㎕의 10 μM 6-FAM labeled M13 primer (5'-6-FAM-TGTAAAACGACGGCCAGT-3', 서열번호 107)을 함유하는 10 ㎕의 반응부피에 ABI 2720 thermal cycler (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 본 발명에 사용한 PCR 프라이머 세트는 표 1 및 표 2에 정리하였다. PCR 증폭을 위한 조건은 Schuelke M에 의해 이전에 서술된 방법에 따랐다. PCR 증폭산물에 대한 DNA 절편분석은 이전에 서술된 바에 따라 수행하였으며(Kim et al., (2012) Afr J Biotechnol. 11:7366-7374), 대립유전자의 크기는 GeneMapper 소프트웨어(ver. 4.0; Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.

데이터 분석

주요 대립 유전자 빈도, 대립유전자 수, 유전 다양성(이형접합도 예측치), 이형접합도 관찰치, 다형성 정보 함유치(PIC)와 같은 유전 매개 변수들을 PowerMarker 소프트웨어(v. 3.25) (Liu and Muse, (2005) Bioinformatics 21:2128-2129)를 사용하여 공유하는 대립 유전자 빈도를 계산함으로써 측정하였다. UPGMA dendrogram은 UPGMA 알고리즘과 함께 PowerMarker에 내재된 MEGA 소프트웨어(v. 7.0)를 사용하여 작성하였다.

실시예 1. 다형성 마이크로새틀라이트 마커의 개발

본 발명자는 이전에 감귤 유전자원에서 교잡배와 주심배 유래 실생을 구별하기 위하여 17개의 마이크로새틀라이트 마커를 개발한 바 있으나, 이전 연구에서는 마커의 수가 충분하지 않아서 사용된 모든 감귤 유전 자원들을 구별할 수 없었다(Woo et al., 2019).

스위트 오렌지(Citrus sinensis)에서 유전체 수준에서의 마이크로새틀라이트 마커가 보고된 바 있다(Biswas et al., 2014. PLoS ONE 9:e104182). 본 발명자는 추가적인 다형성 마이크로새틀라이트들을 선발하기 위하여 스위트 오렌지에서 유래한 마이크로새틀라이트 마커들을 6개 감귤 그룹(레몬, 만다린, 사우어 오렌지, 시트론, 오렌지, 탄골)에 속하는 11개의 감귤 품종(레몬 그룹 - 'Lisbon' 레몬(C. limon 'Lisbon lemon'); 만다린 그룹 - 클레멘타인 만다린(C. clementina), 궁천조생(C. unshiu 'Miyagawa Wase'), 흥진조생(C. unshiu 'Okitsu Wase'), 일남1호(C. unshiu 'Nichinan 1 gou'); 사우어오렌지 그룹 - 하귤(C. natsudaidai); 오렌지 그룹 - C. sinensis 'Sanggwinelli'; 시트론 그룹 - C. sphaerocarpa, 유자(C. junos); 탄골 그룹 - 부지화(C. hybrid 'Shiranuhi'), 청견(Citrus hybrid 'Kiyomi'))들에 적용하였다. 74개의 마이크로새틀라이트 후보들 중에서 상기 11개 감귤 품종 간에 적어도 2개 이상의 품종에서 다형성을 보이며, PCR 증폭 효율이 우수하고, 비특이적인 증폭이 없는 36개의 다형성 마커를 최종적으로 선발하였다.

본 발명에서 개발된 36개의 마이크로새틀라이트(표 1 및 표 2의 No. 18 내지 53에 해당하는 마커)를 포함하여 53개의 다형성 마이크로새틀라이트 마커들의 정보를 표 1 및 표 2에 정리하였다. 감귤 표준유전체(C. clementina cv. Clemenules; https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)의 9개 위염색체(pseudo-chromosome) 상에서 본 발명에 따른 53개 마이크로새틀라이트 유전좌위들의 물리적 위치는 BlastN 검색을 수행함으로써 결정하였다. 그 결과, 53개의 마이크로새틀라이트 마커들은 감귤의 9개 위염색체 상에 전반적으로 분포하고 있음을 확인할 수 있었다(도 1).

실시예 2. 마이크로새틀라이트 마커를 이용한 국내 육성 감귤 품종들의 구분

현재까지 국내에서는 정부 연구기관, 육종 회사 및 개인 육종가들에 의해 아조 변이, 주심배 변이, 전통 교배 육종을 통해 34개의 감귤 품종이 육성되었다(표 3).

이 중, 확보 가능한 32개의 국내 육성 감귤 품종들의 유전형 결정을 위해 53개 마이크로새틀라이트 마커를 적용하였다. 32개 품종의 유전형 분석 결과를 토대로 파악된 마이크로새틀라이트 유전 좌위의 유전적 특성을 표 4 및 표 5에 정리하였다. 전체 245개의 대립 유전자가 32개의 국내 육성 감귤 품종에서 검출되었는데, 유전 좌위당 2개(BMCi-SSR084)에서 11개(BMCi-SSR012)의 범위였으며, 평균 대립유전자 수는 5개였다. 주 대립유전자 빈도(Major Allele Frequency)는 0.22(BMCi-SSR012)에서 0.98(BM-CiSSR-245)의 범위였다. 평균 유전다양성 지수(이형접합도 예측치)는 0.53이었으며, 0.03(BM-CiSSR-245)에서 0.87(BMCi-SSR012)의 범위를 보였다. 다형성 정보 함유치(PIC)의 평균값은 0.47이었으며, 0.14(BM-CiSSR-224)에서 0.85(BMCi-SSR012)의 범위를 보였다. 평균 이형접합도 관찰치는 0.47이었으며, BM-CiSSR-245와 BM-CiSSR-270 유전좌위에서 가장 낮은 값(0.03)을 보였고, BM-CiSSR-262 유전좌위에서 가장 높은 값(1.00)를 보였다.

53개 다형성 마이크로새틀라이트 유전좌위에서 유래한 총 245개 대립유전자들을 활용하여 32개 국내 육성 감귤 품종들간의 유전적 유전관계를 분석하였다. 시료들간의 유전적 유사도 매트릭스를 토대로 UPGMA dendrogram을 작성하였다. 도 2는 마이크로새틀라이트를 이용한 유전형 분석 결과를 기반으로 수행한 군집 분석 결과이다. 계통도(dendrogram) 작성 결과, 분석에 사용된 국내 육성 감귤 품종 시료는 크게 레몬 그룹과 비-레몬의 그룹으로 구분되었다. 또한, 본 발명에서 개발된 마이크로새틀라이트 마커는 국내에서 육성된 대부분의 감귤 품종들을 분명하게 구별할 수 있었으나, 부지화(Citrus hybrid 'Shiranuhi')에서 유래한 주심배(nucellar embryo) 품종인 탐나는봉(TNB)과 새별봉(SBB), 그리고 부지화 유래 아조변이 품종인 써니트(SNE)는 서로 구별되지 않았다. 주심배는 배낭(embryo sac)을 둘러싸는 모체의 주심 조직에서 유래한 체세포 배로부터 발달한다. 감귤에서 주심배 발달에서 유래한 식물체는 모체와 동일한 유전적 조성을 갖는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 결과도 하나의 동일한 모본에서 유래한 체세포 변이체(주심배 실생 포함)들은 서로 동일하거나 거의 유사한 유전적 조성을 갖는다는 사실을 지지한다.

결론적으로, 본 발명자는 감귤의 9개 위염색체에 전체적으로 분포하는 53개의 다형성 마이크로새틀라이트 마커를 개발하였으며, 개발된 마커들을 국내에서 육성된 감귤 품종들의 구분에 적용한 결과, 대부분의 감귤 품종들이 명확히 구분되었으나, 동일한 모본으로부터 주심배 변이 또는 아조 변이에 의해 유래한 체세포 변이 품종들은 모든 유전좌위에서 동일한 유전형을 보인다는 것을 확인하였다.

<110> Biomedic Co.,LTD <120> Microsatellite molecular markers for identifying Citrus varieties developed in Korea and uses thereof <130> PN20046 <160> 107 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggctcagtt cttctctact c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcattaggct tctctcatac c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggtggcatac atacatacat aca 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcaacatctg gaactactca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcctgagttt ctttgttatg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cattccatcg tctcctattg t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 attagtgcgg gtaagatgaa 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaggatttgg tgtaggaagt aa 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cggacaagga gatgaagata g 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttctaacagc accaagcag 19 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgtatttatt tctgactacg acc 23 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atgcgtttgg tgtgtgtt 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 acctgagccc tttttggttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gccagatcaa ggctcaaatc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cagatcctat tgcagaggca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcccatttgt attgccattt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ccccctcttc tttcacacaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggtgagcagc catcttcttc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gaattgggag gacgaactga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgagccctag acagagatgg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gttttcagct ggattcgagg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cacgtgtcct cctggaactt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccgatacagc acaaagcaaa 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tggaaagaga gaagccaagc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cggtgtgtat tgggtacacg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gctttttcga aagcgtcaag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcaacgtgta ctgacgcttg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gctcgtatct gaagctcgcc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atgacctcaa acggtgagca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cttccacatc cgaaccgaca 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gctagggttc cagacttcca g 21 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gatttggccg atcgaaagcc 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 agcaacttaa ggtccttcac ga 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ttctctgctc tgctgtgcat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 caacagtacc tgatggtccg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttctgaaatc cagtcccctc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ccctcttcaa gaactgagcc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 caccagctgt ttgctgtttt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 acaacgcacc aagtcaatgt 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gttgcgtcat ccattttgtc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ccatgaccca ctttccctac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 attcgggtag gttgaaatcg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ggatgcttgg cctgatttat 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 attgtcaccg aagcaccata 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gccaggattg aagggtttta 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 tgtgaacaag ggcaacagat 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ataatggaag cgtcggattc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gcctaacggc cagagtttac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tatgtctact ggtcgcaggc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gttgtcccct tgataccacc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ggtcctttgg agaaggttga 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 catgaccaaa tgtcgggtta 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 aaccccttgt caagtgatcc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tcttcttcag ttggtgcctg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gtaaggggtt gtgaggcaat 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 caacaggttt cgaccatgac 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 attaaggctg gaaatgccac 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 attctgctga cgcttcaatg 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 tccatcagcc attccatcta 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 atctgaaccc tccaatcctg 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 actatgcggc tcgaactttt 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 tcaccttcac aaccgaacat 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 acatgccata ggaagcaaca 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 caccttctca tcaatcacgg 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 gctgctgctg ctagtttgtc 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aaagatggca atgggttagg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 ggtcctttgg agaaggttga 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 catgaccaaa tgtcgggtta 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 ccatccctgt aaattccacc 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 attggtcgtt tcctttcctg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 tttcccagga gcttaccaag 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 tgcgttccat ggtcagtatt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ccctagggaa atttgggaat 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gcactcgaga gttctcgtta ag 22 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 atctgtgttt ggtcgcatgt 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ggaagattac cggacttgga 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 gctcggttct tgcatactga 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 gtctgcaaac cctgttgatg 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 atgggcaaga acaggaaatc 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 ccataggatt tgcatgagga 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 aatttcctgc tccaaaccag 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 tccaacaact tgaacacggt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 taaaatccct cggaaacagg 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 ctttgcatgt tcaacgttcc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 ctctctgaac ctgacaccga 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 ttttctccac cctttcaacc 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 ggtaagcacc tgcaaactga 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 attatgcaat tcctcctggc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 tcatctgaac ggaccacaat 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 taactgcact tgcttccctg 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 cagtttcatc ccactgatgc 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 accaagcgtc cttaacaaca 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 aggggtgctg agcataaaat 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 ataccccgtc gtggaattag 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 cgtagccaaa actcccaaat 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 ccgaagatgg agggaactaa 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 tctgtggctc acttcactcc 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 gaagacgaca gatgctggaa 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 tgctgtaagt gcagtgcaaa 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 gggacgagca tcttccttta 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 cccccaaaat gctgagtagt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 aaagggagag agttggctga 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 ataggtcccc acaatggaaa 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 104 gggcataaat gaattgggtc 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 gcatcatacg ttcaagccac 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 tcttgtgctc tcctgtgacc 20 <210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 tgtaaaacga cggccagt 18

Claims

서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 35 및 36의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 37 및 38의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 39 및 40의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 41 및 42의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 43 및 44의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 45 및 46의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 47 및 48의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 49 및 50의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 51 및 52의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 53 및 54의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 55 및 56의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 57 및 58의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 59 및 60의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 61 및 62의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 65 및 66의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 67 및 68의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 69 및 70의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 75 및 76의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 77 및 78의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 79 및 80의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 81 및 82의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 83 및 84의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 85 및 86의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 87 및 88의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 89 및 90의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 91 및 92의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 95 및 96의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 97 및 98의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 99 및 100의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 101 및 102의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 103 및 104의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 105 및 106의 SSR 프라이머 세트;를 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속(Citrus) 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트.
제1항에 따른 SSR 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속(Citrus) 품종 구별용 키트.
제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
국내에서 육성된 감귤속(Citrus) 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 국내에서 육성된 감귤속 품종의 구별 방법.
제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.