KR101699518B1 - 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 금풍과 황숙의 판별 방법 및 집단 시료에서 금풍 또는 황숙의 원 품종 판별 방법에 관한 것으로, 본 발명의 판별 방법은 pooling된 집단 시료를 분석에 사용하여, 분석에 대한 노력, 시간, 비용을 단축시킬 수 있으며, 인삼 종자 산업의 발전 및 투명하고 신뢰할 수 있는 유통체계를 갖추는데 기여할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 일반적인 붉은색 열매와 달리 금색의 열매를 맺는 인삼 품종 금풍과, 동일한 금색 열매를 맺지만 유전형이 균일하지 않고 품질이 떨어지는 황숙 재래종을 효율적으로 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng)은 우리나라에서 500년 이상 재배하여 왔지만 대부분 형질이 혼재된 재래종 종자를 이용하여 재배하여왔다. 최근 순계분리를 통해 농업적 및 약리적 특성이 우수하고 유전형질이 분리되지 않는 우수한 품종이 개발되어 재배가 확대되고 있고, 우수 품종의 종자 가격은 재래종 종자가격에 비해 3배 이상 비싸게 유통되고 있지만 유통체계가 명확하지 않아 혼란이 초래되고 있다.
대부분의 인삼은 붉은색 열매를 맺는다. 하지만 우수 품종 중 '금풍'은 노란색의 열매를 맺어 다른 품종과 확연히 구별되지만 노란색 열매를 맺는 재래종 인삼인 '황숙'과는 외형적으로 구별하기가 어려워 황숙 종자가 금풍 종자로 둔갑하는 사례가 많이 발생하고 있으며, 종자를 잘못 사용한 사실은 6년간 공들여 재배를 마친 후에야 알게 되거나 끝까지 모르는 경우가 많아 농민들의 손해가 빈번하게 발생한다. 따라서 본 발명은 재래종 '황숙'과 우수한 인삼 품종인 '금풍'을 식별할 수 있는 DNA 마커를 개발하고, 이를 활용하여 신속하고 간편하게 두 품종을 식별하는 체계를 완성하였다.
한편, 한국등록특허 제1110046호에는 '고려인삼의 품종간 및 화기삼과의 구별을 위한 발현 유전자 유래 SSR 프라이머 세트 및 이들의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0991219호에는 '인삼과 화기삼의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기 위한 프라이머 및 이들의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인삼의 엽록체 게놈 완전 서열 해독에 기반하여 유전적 다형성이 보이는 지역을 발굴하였고 이 지역을 기반으로 개발한 분자 마커 3개를 이용하여, 황숙 재래종과 인삼 품종 금풍을 식별할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 그리고 제작된 3가지 프라이머 세트를 이용하여, 금풍과 황숙의 개별 개체 시료 검증 및 집단 시료 검증을 통해서 본 발명의 분자 마커들이 효과적으로 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종의 유전자형을 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종의 판별을 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한, 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한, 인삼 품종 금풍의 집단에서 황숙 재래종의 혼용 여부를 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 분자 마커는 인삼 우수 품종인 금풍과 황숙 재래종을 효과적으로 구별할 수 있는 마커로, 개별 개체들에 대한 단일 분자 마커의 판별 오류를 보완할 수 있고, 개별 개체들의 시료들을 모은 집단 시료를 분석에 사용하므로, 분석에 대한 노력, 시간, 비용을 단축시킬 수 있으며, 금풍과 황숙 재래종을 식별할 수 있어, 인삼 종자 유통 과정에 본 발명의 판별 방법을 적용하면 인삼 종자 산업의 발전 및 투명하고 신뢰할 수 있는 유통체계를 갖추는데 기여할 수 있을 것이다.
더불어 6년근 혹은 4년근 재배 후 생산된 인삼 뿌리 수확 후에도, 수확한 생산물이 금풍 품종인지 황숙 재래종인지를 쉽게 판별할 수 있어 인삼 수확 후 생산물의 유통체계 구축 뿐만 아니라 인삼산업의 가치를 제고하고 인삼 가공제품의 품질 향상 등에도 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 금풍(Gumpoong) 및 황숙(Hwangsook) 개별 샘플들에 대한 본 발명의 마커 검증 결과이다. A 및 D, pgcpd02 마커; B 및 E, pgcp_ccsA 마커; C 및 F, pgycf1 마커.
도 2는 금풍 및 황숙 집단 샘플을 이용한 본 발명의 마커 검증 결과이다. A, pgcpd02 마커; B, pgcp_ccsA 마커; C, pgycf1 마커; GU, 금풍 대조구; HS, 황숙 대조구; GU(p), 금풍 집단 pooled DNA; HS(p), 황숙 집단 pooled DNA.
도 2는 금풍 및 황숙 집단 샘플을 이용한 본 발명의 마커 검증 결과이다. A, pgcpd02 마커; B, pgcp_ccsA 마커; C, pgycf1 마커; GU, 금풍 대조구; HS, 황숙 대조구; GU(p), 금풍 집단 pooled DNA; HS(p), 황숙 집단 pooled DNA.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 구체적으로, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함한다. 분석 시료에 대해서 상기 3가지 프라이머 세트를 모두 이용한 분석 결과를 통해서 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종의 판별이 가능하다.
본 발명의 프라이머 세트는, 황숙 재래종과 우수 품종 금풍의 엽록체 게놈 완전 서열 해독에 기반하여 유전적 다형성이 보이는 지역을 발굴하고 개발한 dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 증폭할 수 있는 서열번호 1과 2, 및 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 그리고 InDel 마커를 증폭할 수 있는 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로, 서열번호 1, 3 및 5는 정방향 프라이머이고, 서열번호 2, 4 및 6은 역방향 프라이머이다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종의 판별을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 상기 개별 개체 판별 방법 뿐만 아니라 본 발명은,
황숙 혼용이 의심되는 인삼 품종 금풍의 집단 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인삼 품종 금풍의 집단에서 황숙 재래종의 혼용 여부를 판별하기 위한 방법을 제공한다.
즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하면, 금풍 품종과 황숙 재래종 개별 개체 시료의 판별 뿐만 아니라, 2개체 이상의 시료가 pooling 된 집단 시료에서도 금풍 또는 황숙의 원품종을 판별할 수 있다.
본 발명의 방법은 동일한 금색 열매를 맺는 금풍 또는 황숙으로 의심되는 인삼 시료 또는 황숙 혼용이 의심되는 인삼 품종 금풍의 집단 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 집단 시료는 2개 이상의 개별 개체들의 추출된 게놈 DNA를 합한 시료 또는 집단을 이루는 각 개체들의 조직들을 모아 한꺼번에 게놈 DNA를 추출한 시료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 대상 식물체 준비
인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 서울대학교 수원 농장에서 금풍 18개체(개체번호 1~18번), 황숙 20개체(개체번호 1~20번)를 각각 수집하였다. 또한, 충청북도 음성군에 있는 국립원예특작과학원 인삼특작부에서 금풍 14개체(개체번호 19~32번), 황숙 12개체(개체번호 21~32번) 샘플을 얻어, 그 샘플 식물체의 잎으로부터 modified CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법으로 DNA를 추출하였다. 이렇게 준비된 인삼 DNA는 Nanodrop 1000(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 이용하여 각 DNA의 질과 양을 확인하였다.
2. 분자 마커의 개발 및 PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석
이전 연구에서 인삼 12개 품종의 엽록체 유전체 서열을 비교하여 유전적 다형성을 보이는 지역 발굴과 분자 마커를 개발하였는데, 그 중 금풍 품종과 황숙 재래종이 차이를 보이는 마커 pgcpd02 및 pgycf1을 본 발명에 사용하였고, 추가로 rpoC2와 ccsA 유전자 지역의 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 지역에서 dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequences) 프라이머와 상보적인 프라이머를 제작하였다.
| 분자 마커명 | 서열정보(5'→3') (서열번호) | PCR 산물 크기 (금풍/황숙) |
제한효소 | |
| dCAPS | pgcpd02 | F: ATTTCGGGGACTCACAGAAGTAC (1) | 177/200 bp | ScaⅠ |
| R: AAAGCAATTTACGCGAAGGA (2) | ||||
| dCAPS | pgcp_ccsA | F: CAATAATCCAACTGTTGAATCACC (3) | 199/223 bp | SmaⅠ |
| R: GCTATGCAGCTCTTCTATGTGGA (4) | ||||
| InDel based | pgycf1 | F: GGTATTAGTCTGGATACGGCAAA (5) | 729/672 bp | |
| R: TCGAAAAGAAGGGTCACAAGA (6) | ||||
표 1의 3가지 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 반응에는 (주)비바젠(한국)의 taq 시약 및 PCR 버퍼 시약을 사용하였고, PCR 기기는 Veriti 96-Well Thermal Cycler(ThermoFisher Scientific, 미국)를 사용하였으며, PCR 수행 조건은 하기 표 2와 같다. PCR 반응을 통해 얻은 PCR 산물은 각각의 제한효소를 처리하고 37℃ 인큐베이터에서 4~5시간 반응시킨 후에 3% 농도의 아가로스 겔에서 확인하였으며, InDel 마커는 제한효소 처리없이 바로 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 확인하였다.
| PCR 반응물 | PCR 반응 조건 | ||
| 성분 | 용량 (㎕) | 단계 | 온도/반응시간 |
| 주형 DNA (10ng) | 2 | 초기 변성 | 94℃/ 5분 |
| 10X 버퍼 | 2.5 | 변성 | 94℃/ 20초 |
| dNTP (2.5mM) | 2 | 결합(annealing) | 54℃/ 20초 |
| 정방향 프라이머 (10pmole) | 1 | 신장 | 72℃/ 20초 |
| 역방향 프라이머 (10pmole) | 1 | 최종 신장 | 72℃/ 7분 |
| Taq 중합효소 (2units/㎕) | 1 | (변성/결합/신장 : 총 35 회 반복) | |
| 증류수 | 16 | ||
실시예 1. 인삼 품종 금풍 및 황숙 재래종 개별 시료에 대한 분자 마커 검증
서울대학교 수원 농장 및 국립원예특작과학원 인삼특작부에서 수집한 금풍 및 황숙 개별 개체들에 대해 상기 표 1의 프라이머 세트들을 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 모든 금풍 개체들의 시료들은 대조군으로 사용된 금풍(GU)과 같은 크기의 밴드를 보이는 것으로 확인되었다(도 1A ~ 1C). 그에 반해 황숙 개체들의 시료는, pgcpd02(도 1D) 및 pgcp_ccsA(도 1E) 마커를 사용한 PCR 결과에서 시료 번호 4번, 15~19번, 21~24번, 28번, 32번이 금풍 대조군과 같은 크기의 밴드를 보이는 것으로 확인되었고, pgycf1 마커는 시료 번호 4번, 8번 그리고 15~32번에서 금풍 대조군과 같은 크기의 밴드가 확인되었다(도 1F).
금풍 및 황숙 두 개의 집단에 대한 테스트 결과, 금풍은 품종으로 등록된 것이기 때문에 유전적으로 잘 고정이 되어 균일한 유전형을 갖고 있다는 것을 확인할 수 있었고, 황숙 재래종의 경우는 아직 많은 개체들이 섞여 있는 집단이기 때문에 여러 유전형이 나올 수 있어, 본 발명의 분자 마커들을 이용한 상기 실험 결과 황숙 집단에는 황숙 및 금풍의 유전형이 혼재되어 있음을 검증할 수 있었다. 또한, 같은 황숙이어도 집단별로 금풍의 유전형이 우점할 수 있기 때문에 상기 표 1의 프라이머 세트 모두를 이용하여 감별해야 정확한 식별이 가능함을 유추할 수 있었다.
실시예 2. 금풍 및 황숙 집단 시료의 분자마커 검증
상기 실시예 1의 결과를 통해, 금풍과 황숙의 1~2개체를 가지고 종을 구별할 경우 동일한 황숙 시료임에도 불구하고 금풍으로 착각하여 판단을 내릴 가능성이 있음을 유추할 수 있었고, 따라서 금풍과 황숙을 정확히 구별하기 위해서는 개체들을 집단수준에서 동시에 분석해야함을 알 수 있었다. 하지만 동일 집단에서 많은 수의 개체들을 수집하여 개별로 검증하게 된다면 시간과 노력이 많이 들게 되며, 검사 비용도 증가하게 된다. 따라서 본 발명자들은 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 명확하게 구별하는 것과 동시에 효율적으로 감별하는 방법을 개발코자, 금풍과 황숙 개체들을 각각 검증하지 않고, 집단 시료를 이용하여 감별하였다. 이를 위해, 실시예 1에서 사용된 32개체의 금풍 또는 황숙의 DNA를 모아서 실험을 진행하였다.
그 결과, 3가지 분자 마커 모두에서 집단으로 모은 금풍 시료는(GU(p)) 금풍 대조군과 동일한 크기의 밴드를 보여주었고, 집단으로 모은 황숙 시료는(HS(p)) 밴드의 밝기 강도는 다르지만 금풍 대조군의 밴드와 황숙 대조군의 밴드를 동시에 보여주었다(도 2).
즉, 황숙 집단의 경우, 상기와 같은 방법을 이용하여 본 발명의 프라이머 세트 3개에 대해 모두 분석한다면 금풍과 혼동되는 개체들이 포함되어도, 밴드 패턴을 비교하여 혼란 없이 정확하게 구별이 가능함을 의미하였다. 이러한 결과는 금풍에서 황숙이 혼용되어 사용되는 것을 방지하는 것이 가능하다는 것을 제시하였다. 본 실험에서는 금풍 또는 황숙 시료 각각의 DNA를 개별 검증을 위해 추출하였었기 때문에 그것을 모아 사용하였지만, 현장 검증에서는 DNA 추출 단계에서부터 잎 혹은 종자들을 모아 집단으로 DNA를 추출하고 분석한다면, 개별 개체 검증 분석 보다 노력, 시간, 비용을 단축시키는 것이 가능하다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Primer set for discrimination of a ginseng cultivar Gumpoong and
a landrace Hwangsook and uses thereof
<130> PN15443
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
atttcgggga ctcacagaag tac 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
aaagcaattt acgcgaagga 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
caataatcca actgttgaat cacc 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
gctatgcagc tcttctatgt gga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ggtattagtc tggatacggc aaa 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
tcgaaaagaa gggtcacaag a 21
Claims (7)
- 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종의 판별을 위한 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 방법. - 황숙 혼용이 의심되는 인삼 품종 금풍의 집단 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인삼 품종 금풍의 집단에서 황숙 재래종의 혼용 여부를 판별하기 위한 방법. - 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 증폭된 표적서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR20230149050A (ko) | 2022-04-19 | 2023-10-26 | 주식회사 한국인삼공사 | 인삼의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130075760A (ko) * | 2013-06-20 | 2013-07-05 | 대한민국(농촌진흥청장) | 실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 |
| KR101426466B1 (ko) * | 2013-04-12 | 2014-08-06 | 서울대학교산학협력단 | 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 |
-
2016
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101426466B1 (ko) * | 2013-04-12 | 2014-08-06 | 서울대학교산학협력단 | 고려인삼 엽록체 지놈 완전 해독기반 품종 및 종 간 구별 마커와 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 |
| KR20130075760A (ko) * | 2013-06-20 | 2013-07-05 | 대한민국(농촌진흥청장) | 실시간 ｐｃｒ 분석법에 의한 인삼 품종 판별용 프라이머 및 프로브 세트 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Current Biology. 2007, Volume 17, Issue 4, Pages 316-322. * |
| Hua Sun et al. Biol. Pharm. Bull. 33(2) 183-187 (2010) |
| J Ginseng Res 40 (2016) 395-399 (epub.2015.12.17) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20230149050A (ko) | 2022-04-19 | 2023-10-26 | 주식회사 한국인삼공사 | 인삼의 품종을 판별하기 위한 단일염기다형성을 갖는 유전자 마커 |
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