KR102370010B1

KR102370010B1 - 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102370010B1
Application number: KR1020200146007A
Authority: KR
Inventors: 이이; 김문교; 이미선; 김주혁; 오하경; 이경희; 박희순; 신현만; 이문순
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-04
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2022-03-04

Abstract

본 발명은 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 국내 대추 품종과 일본산 대추 품종을 간단하고 신속하게 구별할 수 있으므로 국내 시장에서 유통되는 대추의 품종이 혼용되는 것을 효과적으로 방지하고 품질관리에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on chloroplast genome sequence for discriminating between Korean jujube varieties and Japanese jujube varieties and uses thereof}

본 발명은 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

대추(Zizyphus jujuba)는 갈매나무과(Rhamnaceae) 대추나무속(Zizyphus)에 속하는 식물로, 원산지는 중국이며, 중국, 한국 및 일본을 포함한 아시아, 유럽, 미국, 캐나다, 오스트레일리아 등 약 30여 개국에서 재배되는 작물이다. 핵과류(stone fruits)인 대추의 과육에는 특히 당질과 비타민 C, 아미노산류, 페놀류가 풍부하고 종자에는 올레산 등 불포화지방산이 포함되어 있으며, 항산화 또는 진정작용 등 약리효과가 우수하여 건과형태로 한방 재료나 음식 부재료로 다양하게 이용되고 있다. 키위에 비해 비타민 C가 약 4배, 당류가 사탕무보다 2배 정도 높다. 이러한 높은 이용 가치를 갖는 작물이기 때문에, 다양한 품종의 대추가 개발되었으나 정확한 품종 구분을 위한 방법은 아직 부족한 실정이다. 특히 대추는 주로 영양번식을 함으로써 몇몇 종들을 제외하고는 육안으로 품종을 구분하기 힘들고 유전적으로도 유사하여 이를 구별하기가 상당히 까다로운 작물이다. 하지만 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종 내 품종 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있으며, 이를 위하여 DNA 수준에서 유전자원의 다양성 연구를 가능하게 하는 분자마커들이 개발되고 있다. DNA 분석에 의한 분자 수준에서의 감별은 양적 수준과 더불어 다수의 특성을 파악할 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다.

차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 기술을 통해 분석한 DNA 정보를 비교하여 차이점을 찾아내고 이를 활용한 분자마커 개발은 대추 품종의 정확한 구별을 가능하게 한다. 유전체 정보에 근거한 여러 가지 형태의 분자마커 중 InDel(Insertion/Deletion) 마커는 PCR(polymerase chain reaction) 기술을 이용하여 다형성을 검출하는 방법으로 비교적 간단한 방법으로 신속한 결과를 얻을 수 있는 방법이다. InDel 마커는 염기서열에서 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 염기서열의 차이를 이용하는 것으로 종간뿐만 아니라 종내에서도 다양한 유전형으로 존재하여 품종 구분에 적합한 분자마커이다.

한편, 한국등록특허 제009712호에는 '대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1860232호에는 대추 품종 보은과 추석을 판별할 수 있는 'SSR 마커를 이용한 대추 품종의 감별방법'이 개시되어 있으나, InDel 다형성에 기반한 본 발명의 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 일본 대추 품종(충북농업기술원 자원번호: 317242)과 국내 대추 품종인 '보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출'의 엽록체 유전체 정보를 비교하여 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제작한 후 상기 제작된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 일본 대추 품종과 국내 주요 대추 품종을 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 국내 대추 품종과 일본 대추 품종의 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 국내 대추 품종과 일본 대추 품종의 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 정확하게 판별할 수 있으므로, 국내 과수 시장과 한약재 시장에서 유통되는 대추 품종을 명확하게 판별하여 국내 시장에서 유통되는 대추 품종의 원료 혼용 방지 및 원료 품질관리에 대한 지표로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 국내 주요 대추 품종(보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출)과 일본 대추(충북농업기술원 자원번호: 317242) 간 InDel 다형성에 기반하여 제작된 Zj-cp-InDel-19 프라이머 세트를 이용하여 국내 대추 품종과 일본 대추 자원들의 PCR 증폭산물을 겔 전기영동한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 국내 대추 품종과 일본 대추 품종의 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 국내 대추 품종은 '보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출' 품종을 의미하고, 상기 일본 대추 품종은 충북농업기술원에서 보유하고 있는 자원번호 317242를 의미한다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(19개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 따른 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 대추 엽록체 게놈의 petL과 petG의 유전자간 부위에 위치하는 InDel 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트로, 국내 대추 품종인 '보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출'과 비교하여 일본 대추(충북농업기술원 317242)의 엽록체 게놈 서열에서 23 bp 염기 결실에 의해 서로 다른 크기의 증폭산물이 확인되어, 국내 대추 품종으로부터 일본 대추 품종을 특이적으로 판별할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 국내 대추 품종과 일본 대추 품종의 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에 있어서, 상기 국내 대추 품종과 일본 대추 품종은 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 국내 대추 품종은 '보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출' 품종을 의미하고, 상기 일본 대추 품종은 충북농업기술원에서 보유하고 있는 자원번호 317242를 의미한다. 또한 상기 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 방법은 대추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 대추의 자원수집 및 게놈 DNA 추출

실험에 사용된 국내 대추 품종(보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출)과 일본 대추(자원번호: 317242)는 충청북도 농업기술원에서 제공받았으며, 각 자원의 어린 잎 시료를 채취한 후 NGS 분석용 DNA는 Qiagen DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 추출하였고, PCR용 대용량 DNA는 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법 이용하여 추출하였다.

2. 대추 품종 구별을 위한 엽록체 기반 InDel 마커 개발

상기 추출된 국내 대추 품종과 일본 대추의 게놈 DNA를 대상으로 NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 수행하여 대추 품종들의 DNA 염기서열 정보를 획득한 후, 상기 대추 품종들의 염기서열을 CLC Main Workbench 프로그램(version 8.0.1)을 이용하여 비교·분석하여 8개의 대추 품종의 엽록체 염기서열 간 삽입(Insertion) 또는 결실(Deletion)의 차이를 보이는 InDel 다형성 영역을 탐색하였고, 상기 InDel 다형성 영역을 증폭시기 위한 프라이머 세트를 제작하였다(표 1).

본 발명의 InDel 마커는 대추 엽록체 게놈의 petL과 petG의 유전자간 부위에서, 일본 대추의 엽록체 게놈 서열에서 23 bp 염기가 결실된 다형성 영역에 기반하여 제작된 것이다.

본 발명의 InDel 마커 기반 프라이머 세트 정보

프라이머 명칭	서열(5'→3') (서열번호)	유전자 위치
Zj-cp-InDel-19 F	AGCAGCTTTGACTATAACC (1)	petL~petG
Zj-cp-InDel-19 R	GAACGGAGAAAAGGAGAG (2)	petL~petG

3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 DNA 증폭

CTAB 방법을 사용하여 추출한 대추의 DNA를 각각 10 ng/㎕로 희석하여 DNA 2 ㎕(10 ng), 2 μM의 정방향 프라이머 2 ㎕, 2 μM의 역방향 프라이머 2 ㎕, Taq mixture 10 ㎕, 증류수 4 ㎕을 혼합하여 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 94℃ 3분; 변성(denaturation) 94℃ 30초, 결합(annealing) 51℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 1분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 5분의 조건으로 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.

실시예 1. InDel 분자마커를 이용한 대추 품종의 구별

국내 대추 품종과 일본 대추 간의 InDel 다형성에 기반하여 제작된 Zj-cp-InDel-19 프라이머 세트를 이용하여 대추 품종들의 DNA 시료를 주형으로 PCR을 수행한 후 아가로스 겔에 전기영동하여 Zj-cp-InDel-19 프라이머 세트의 다형성 패턴분석을 수행하였다.

그 결과, 일본 대추에서는 134 bp의 밴드가 확인되었고, 국내 대추 품종(보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출)에서는 157 bp의 밴드가 확인되어(도 1), 국내 대추 품종으로부터 일본 대추를 특이적으로 구별하는 것이 가능함을 확인하였다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker based on chloroplast genome sequence for discriminating between Korean jujube varieties and Japanese jujube varieties and uses thereof <130> PN20289 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agcagctttg actataacc 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaacggagaa aaggagag 18

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출의 국내 대추 품종과 충북농업기술원에서 보유하고 있는 자원번호 317242의 일본 대추 품종의 구별용 프라이머 세트.
삭제
제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출의 국내 대추 품종과 충북농업기술원에서 보유하고 있는 자원번호 317242의 일본 대추 품종의 구별용 키트.
제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
대추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 보은, 복조, 천상, 무등, 추석, 금성 및 월출의 국내 대추 품종과 충북농업기술원에서 보유하고 있는 자원번호 317242의 일본 대추 품종을 구별하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.