KR101954673B1

KR101954673B1 - 더덕 품종 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101954673B1
Application number: KR1020170140998A
Authority: KR
Inventors: 이이; 이재복; 길진수; 김호방; 김관수; 엄유리; 김세림
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-03-06

Abstract

본 발명은 더덕 품종을 판별하기 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 엽록체 서열 기반의 InDel 분자마커 및 상기 분자마커 증폭용 프라이머 세트는 더덕 품종을 간단하고 신속하게 판별할 수 있으므로, 더덕 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Description

더덕 품종 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating Codonopsis lanceolata cultivars and uses thereof}

본 발명은 더덕 품종 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 분자생물학의 급속한 발전으로 DNA 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질의 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등을 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 지문분석법(fingerprinting)에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법 등이 있다. 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism) 검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR 방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로, 상기 단순염기서열의 반복수는 품종 간 또는 개체 간에 다르기 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타날 수 있으나, 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않다는 단점이 있다.

이에 반해 InDel(insertion/deletion) 마커는 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 하는 장점을 유지하면서 고밀도 유전자지도 제작에는 충분하지 않는 SSR 마커의 단점을 보완하는 것으로, 특정 위치에 있는 DNA의 염기서열 분석을 통해 품종간 염기서열의 삽입 또는 결실을 기반으로 PCR 프라이머를 제작하는 방법이다.

식물의 경우는 핵, 미토콘드리아, 엽록체 게놈 등 3개의 게놈을 가지고 있다. 식물의 유전정보의 대다수는 핵 게놈에 존재하지만 게놈의 크기가 크고, 많은 인트론(intron)과 엑손(exon)으로 구성되어 있어, 특정 유전자의 염기 서열을 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 분석하여 식물종의 보존이나 식별에 이용하는데는 제한적이며, 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)의 ITS(internal transcribed spacer) 부위, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 특정 인트론 부위 등이 이용된다. 식물 미토콘드리아 게놈의 경우 보통 400kb∼4,000kb 크기로, 동물 미토콘드리아와는 달리 크기가 크고 구조적으로 매우 불안정하며 염기서열이 매우 보존적이기 때문에 속, 종 수준 또는 그 이하의 분류군의 계통관계나 식별에 이용하는 것은 거의 의미가 없다.

반면에 식물 엽록체는 기원(origin)이나 진화(evolution)와 같은 엽록체 자체 연구뿐만 아니라, 유전학적인 연구에서도 매우 중요시되어왔다. 엽록체 게놈의 크기는 160Kb 내외이고 구조적으로 안정하며, 염기서열의 변이가 큰 비암호화 영역(non coding region)은 고유종의 식별, 아종 및 변종의 식별, 유전적 변이의 비교 분석에도 유용성이 보고되고 있다. 엽록체 게놈에 존재하는 120여개의 유전자 중 84개의 유전자가 단백질로 전사되는데 유전자에 따라서 진화속도가 크게 다르다. 어떤 보존적인 유전자는 고등 분류군의 계통에만 이용될 수 있으나 빨리 진화하는 유전자의 염기서열은 근연속이나 속내의 뚜렷한 종간의 유연관계를 논의하는데도 이용될 수 있다. 따라서 한국 특산속 식물의 타당성, 식별, 보존 전략을 세우는데 엽록체 게놈의 염기서열은 광범위하게 활용이 가능하다.

더덕(Codonopsis lanceolata)은 도라지과(Companulaceae)에 속하는 다년생의 쌍자엽 식물로, 한국, 일본, 중국 및 러시아 극동지방 등 습기가 있는 초지, 숲 또는 계곡에 자생하는 식물이다. 더덕은 사삼 또는 백삼이라 불리며, 생약의 사삼은 건조된 뿌리를 칭한다. 건조된 뿌리에는 폴리아세틸렌(polyacetylene), 페닐프로파노이드(phenylpropanoid), 알칼로이드(alkaloid), 트리테르페노이드 (triterpenoid) 또는 다당류 등을 많이 함유하고 있으며, 특히 다량으로 함유되어 있는 사포닌(saponin)은 기침을 멎게 하고 가래를 억제하는 효과, 기관지염, 편도선염, 인후염 등 호흡기질환에 효능이 있다.

본 발명자들은 더덕의 엽록체 서열에 기반한 InDel 분자마커를 개발하였고, 상기 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머를 제작하여 국내에서 수집된 95개의 재배중인 더덕의 발생적 관계를 분석하였다.

한편, 한국등록특허 제1752658호에는 '더덕 품종 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0055613호에는 '인삼 시료의 더덕, 도라지 또는 이들의 혼합물의 혼입 여부를 판별하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 더덕 품종 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 수집한 95개 더덕(Codonopsis lanceolata) 자원 간의 엽록체 게놈 염기서열을 비교하여 petL ~ psbE , psbJ ~ petA , trnT - GGU ~ psbD , nbhF ~ rpl32 , psbK ~ psbI 및 trnV -GAC~rps12 유전자간 부위에서 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였고, 상기 InDel 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 수집한 더덕 자원을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 InDel 분자마커가 더덕 자원간의 유전적 다양성을 분석하여 더덕 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata) 품종 간의 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는 더덕 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 6개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 InDel 다형성 뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 더덕 품종 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 더덕 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 InDel 분자마커는 더덕의 엽록체 게놈에서 삽입 또는 결실에 의한 다형성을 나타내는 염기서열에 기반한 것으로, 본 발명의 InDel 분자 마커를 이용하면 더덕 품종의 효율적인 판별이 가능할 뿐만 아니라, 더덕 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 본 발명의 프라이머 세트 InDel Marker 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 이용하여 6개의 더덕 자원(표 3)을 구별한 DNA 단편 분석(fragment analyzer) 결과이다.
도 2는 본 발명의 InDel Marker 1(A), InDel Marker 2(B), InDel Marker 3(C), InDel Marker 4(D), InDel Marker 5(E) 및 InDel Marker 6(F)를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 95개의 더덕 자원(표 1)을 구별한 DNA 단편 분석 결과이다.
도 3은 95개 더덕 자원에 대한 계통수를 나타내는 그림이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata) 품종 간의 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 이루진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 뉴클레오티드를 포함하는 더덕 품종 구별용 InDel 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 서열번호 6은 각각 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 뉴클레오티드이다. InDel 다형성이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 혹은 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열을 말한다. 상기 다형성 뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 InDel 조성물에 있어서, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 표 4에 나타내었다.

또한, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 6개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 6개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 7 및 서열번호 8; 서열번호 9 및 서열번호 10; 서열번호 11 및 서열번호 12; 서열번호 13 및 서열번호 14; 서열번호 15 및 서열번호 16; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 상기 6개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 더덕의 품종을 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 서열번호 7, 9, 11, 13, 15 및 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 8, 10, 12, 14, 16 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열의 InDel 다형성 뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 더덕 품종 구별용 마이크로어레이를 제공한다.

바람직하게는, 상기 다형성 뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 더덕 품종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

더덕에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 더덕 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 더덕 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 더덕 품종을 구별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 단계의 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 더덕 자원의 수집 및 DNA 추출

95개 더덕 자원은 국내 종자회사 또는 농가에서 수집하였으며, 수집된 더덕 자원은 하기 표 1에 정리하였다. 게놈 DNA 추출을 위해 더덕을 액체 질소에 담궈 동결시킨 후 막자사발로 분쇄하였다. 상기 더덕의 분쇄물을 이용하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 TE 완충액에 용해시킨 후 보관하였다.

2. 중합효소연쇄반응(PCR)

상기 추출된 더덕의 DNA를 5 ng/㎕로 희석하고, DNA 2 ㎕과 각 프라이머 1 ㎕, Taq mixture 8 ㎕ 및 증류수 8 ㎕을 혼합하여 최종 20 ㎕가 되도록 PCR 반응 혼합물을 제조한 후 PCR을 수행하였고, PCR 조건은 하기 표 2과 같다. PCR 증폭산물은 2% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	94	5분
변성	94	30초
결합	54~58	30분
신장	72	1분
변성 단계로 돌아가 34회 추가 반복
최종 신장	72	10분
보관	4	∞

실시예 1. 더덕 간의 엽록체 염기서열 비교 분석을 통한 변이지역 분석

하기 표 3의 6개 더덕 자원을 이용하여 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing, NGS)으로, 엽록체 게놈 상에서 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 염기서열을 분석하였다.

InDel 마커 개발에 이용된 6개 더덕 자원 정보

번호	수납 번호	수집 장소
CLg 1	KCLS15006	철원군, 강원도
CLg 2	KCLR15009	천태산, 장흥군, 전라남도
CLg 3	KCLS15011	용인시, 강원도
CLg 4	KCLS15017	횡성군, 강원도
CLg 5	KCLR15030	청주시, 충청북도
CLg 6	KCLS15018	용인시, 경기도

그 결과, 더덕(KCLS15006) 엽록체 게놈의 petL ~ psbE 유전자간 부위에 존재하는 4 bp의 염기 결실; 더덕(KCLR15009)의 psbJ ~ petA 유전자간 부위에 존재하는 6 bp의 염기 결실; 더덕(KCLS15011)의 trnT-GGU~psbD 유전자간 부위에 존재하는 9 bp의 염기 결실; 더덕(KCLS15017)의 nbhF~rpl32 유전자간 부위에 존재하는 15 bp의 염기 삽입; 더덕(KCLR15030)의 psbK~psbI 유전자간 부위에 존재하는 5 bp의 염기 결실; 더덕(KCLS15018)의 trnV-GAC~rps12 유전자간 부위에 존재하는 18 bp의 염기 결실이 확인되었다. 상기 삽입 또는 결실의 염기서열 정보는 하기 표 4와 같다.

실시예 2. InDel 분자 마커를 이용한 더덕 품종 구별

상기 표 4의 서열번호 1 내지 서열번호 6의 InDel 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다(표 5).

더덕 품종 구별용 프라이머

프라이머 명칭	염기서열(5'→3')	Tm (℃)	위치
InDel 마커 1	F: CTACGACATCTACCCATT (서열번호 7)	52	petL~ psbE
	R: TCCTCTTTCCTCTAAAATCG (서열번호 8)
InDel 마커 2	F: AGGGGGAGTCAAGTCAAAGA (서열번호 9)	52	psbJ~petA
	R: CGAGAAGGTTCAATTGTCCG (서열번호 10)
InDel 마커 3	F: CGCAGAGGAAGGTTTATT (서열번호 11)	55	trnT-GGU~psbD
	R: GTCTTTTTCTCGCATCCA (서열번호 12)
InDel 마커 4	F: GCAATCGGCTTAATAACCCC (서열번호 13)	58	nbhF~rpl32
	R: TGCCGACTGTTTCAATTCGA (서열번호 14)
InDel 마커 5	F: CCATTCTGGCCCTTTTCCTT (서열번호 15)	57	psbK~psbI
	R: AGCATTCTGTTTTGACACCA (서열번호 16)
InDel 마커 6	F: TTATTTCGTACCCTTCGCT (서열번호 17)	56	trnV-GAC~rps12
	R: TTCTCGATCAATCCCCCT (서열번호 18)

상기 6개의 프라이머 세트를 이용하여 더덕 품종을 구별할 수 있는지 확인하기 위해, InDel 마커 개발에 이용된 6개의 더덕 자원과 국내 수집된 95개의 더덕 자원의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 분석을 수행하였으며, Fragment Analyze^TM Automated CE System(Advanced Analytical Technologies, 미국)을 이용하여 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 확인하였다.

그 결과, 본 발명의 6개 프라이머 세트는 6개의 더덕 자원에서 각각 다른 크기의 밴드를 나타냄으로써 6개의 더덕 자원이 정확하게 구별되는 것을 확인하였다(도 1). 또한, 6개 프라이머 세트는 95개체의 더덕 자원에서도 각각 다른 크기의 밴드가 나타나는 것을 확인하였다(도 2). 이를 통해, 더덕 엽록체 게놈 서열에서 InDel 다형성을 보이는 염기서열에 기반한 본 발명의 분자마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트는 각기 다른 기원 또는 품종의 더덕을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. InDel 분자 마커의 다형성 및 유전적 다양성 분석

PowerMarker software(version 3.25)를 이용하여 각각 InDel 마커들에 대한 PCR DNA 단편 분석(fragment analyzer) 결과를 표 6에 나타내었다.

우선, 각 마커별 주요 위치에서 증폭되는 대립 유전자 빈도수(major allele frequency, M _AF )는 6개의 마커에서 모두 0.5이상의 값을 가졌으며, 대립 유전자의 수(number of alleles, N _A )는 InDel Marker 1, 2, 4, 5 및 6에서는 2개, InDel marker 3에서는 3개였으며 평균 대립유전자수는 2.2개였다. 또한, 전체 더덕 자원에 대한 유전적 다양성(genetic diversity, G _D )은 0.401의 평균을 보였으며 최소값은 0.24(InDel Marker 3), 최대값은 0.50(InDel Marker 2, 4, 6)이었다. 전체 개체 중에서 이형접합을 보일 것으로 예상되는 개체의 비율인 예상 이형접합도(expected heterozygosity, H _E )의 평균은 0.011이었으며, InDel Marker 1과 5는 0.00; InDel Marker 2와 3은 0.01; 및 InDel Marker 4와 6은 0.02의 값을 나타내었다. 또한, 다형성 지수(polymorphic information content, PIC)는 다양성 정도를 반영하는 것으로, 0.5 이상의 수치를 보이면 충분한 다양성 정보를 제공하는 마커를 의미한다. PIC의 평균은 0.316 이었으며, InDel Marker 4가 0.38의 가장 높은 PIC값을 보였다. 6개의 마커가 0.5 이하의 수치를 보였다 하더라도 확보된 마커는 수집된 더덕 자원의 유전 다양성을 분석하기에 충분하다고 판단되었다.

실시예 4. 수집 더덕 자원들간의 유전적 연관관계 분석

수집된 더덕 자원의 유전적 거리를 분석하기 위해, InDel 마커를 활용한 DNA 단편 분석 결과를 토대로, MEGA software (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, version 5.05)를 사용하여 95개의 더덕 유전자원에 대한 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다(도 3).

그 결과, 유전자원들의 현저한 집단화 양상이 관찰되었고, 수집된 장소가 동일하더라도 먼 유전적 거리를 보이는 유전자원들이 일부 확인되었다. 강원도에서 수집된 KCLS15002-2 자원의 경우, 동일 수집 장소의 KCLS15020-4 자원과 비교했을 때 비교적 먼 유전적 거리를 보여주었으며, 제주도에서 수집된 KCLS15024-2와 더 가까운 유연관계를 보였다. 이의 결과는 수집 지역간에 밀접한 유전적 연관관계가 없음을 보여주는 것으로, 야생 더덕이 재배화 과정에서 전국적으로 퍼져나가 해당 지역에서 토착화된 것으로 사료되었다. 병 저항성 품종 또는 기능성 물질 함량이 높은 품종의 육종 또는 생산을 위해, 유전적 유연관계가 먼 유전자원을 수집하고 보존하는 것이 중요하다.

본 발명의 6개의 InDel 분자마커와 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 이용하여 다양한 더덕자원의 구별이 가능하였고 이들의 유전적 관계를 비교할 수 있었으므로, 본 발명의 마커는 더덕 품종 육성에 기반자료로 이용될 것으로 기대된다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discriminating Codonopsis lanceolata cultivars and uses thereof <130> PN17431 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 222 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 1 ctacgacatc tacccattct gtgcttgcaa tcaacagctt ttttgaggac ctatcaactt 60 aacttagcaa cgaataatga gaactgagtt gtgtaacttc tgtaacaatt gaaactcttt 120 ttgaatcatt aaggaataaa gttcgaaaag gatttctatt ttgatcattt cttttatttt 180 ggaattgtat cgaatcgatt ttcgatttta gaggaaagag ga 222 <210> 2 <211> 211 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 2 agggggagtc aagtcaaaga gtcttggtca caatctacat actataacta ggaatgtggt 60 acaaggaatt actgtcatct tatagaaaag ctttttagaa tttcattttt tattatagat 120 aatcaataaa aagagtttgg ttctttttac gaacttgctg tcgataaatc agcgagtcta 180 gaaattcatt tcggacaatt gaaccttctc g 211 <210> 3 <211> 249 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 3 cgcagaggaa ggtttattcc aagtcacaac ataagagctt tgttcactat ctttctttga 60 ttactttgat tacagatcaa gataaattta tctctttcta tcttctatta tatctataat 120 aagaataaga tttatatatt tagatgtata tcgattagat cgcggcttga tgtactaaat 180 atttccatat gcttgcatct gagattttgg ttccgacaat gatatggaga atggatgcga 240 gaaaaagac 249 <210> 4 <211> 245 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 4 gcaatcggct taataacccc acctttttna ttttagttag tttagttagt tgattccaac 60 tgagttttta taaggttgat tgttttctaa taatcacaaa tatttgtgat tattagaaaa 120 cgttagatat ctgaatctag atataaaaga aactttattg tatatttagt gagaaaggat 180 aaaatgatat atcttggaac ataacagatt aattacgaat ctcattcgaa ttgaaacagt 240 cggca 245 <210> 5 <211> 215 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 5 ccattctggc ccttttcctt ttccaatgaa aggccttaaa tatcttttct ttattacatt 60 ttttcttaga gtcccncacc aatatataat tatctaattg tggaaatttt ggggaattaa 120 agacgctttt ttttttttca aattaatttg aattttttcc aattattttc tatttctaga 180 aagcacttca tttcttggtg tcaaaacaga atgct 215 <210> 6 <211> 219 <212> DNA <213> Codonopsis lanceolata <400> 6 ttatttcgta cccttcgctc aatgagaaaa tgagtccaat ttgaaaggat caaacctatg 60 ggacttaagg aatgatataa aaaaaaagag ggaaaaatag tcattcatat atgaaatcaa 120 aatgaaggag aagaacccag attccaaatg aacaaattca aacttgaaaa ggatctttct 180 gattctcgaa gaatgagggg cagggggatt gatcgagaa 219 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctacgacatc tacccatt 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcctctttcc tctaaaatcg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agggggagtc aagtcaaaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgagaaggtt caattgtccg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cgcagaggaa ggtttatt 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtctttttct cgcatcca 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcaatcggct taataacccc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgccgactgt ttcaattcga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ccattctggc ccttttcctt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 agcattctgt tttgacacca 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ttatttcgta cccttcgct 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttctcgatca atccccct 18

Claims

더덕(Codonopsis lanceolata) 품종 간의 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 다형성 뉴클레오티드를 포함하는 더덕 품종 구별용 InDel 조성물.
서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 프라이머 세트.
삭제
제1항에 기재된 InDel의 다형성 뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 더덕 품종 구별용 마이크로어레이.
제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 더덕 품종 구별용 키트.
제5항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
더덕에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕 품종을 구별하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.