KR101807623B1 - 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 기원종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커 및 프라이머 세트는 저비용 및 고효율로 방풍, 식방풍 및 해방풍을 식별할 수 있고, 방풍 가공제품에서도 원재료의 판별이 가능하며, 방풍의 순도 유지나 품종 보호, 그리고 종자 분쟁의 해결 등에도 이용될 수 있다.

Description

방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도{Complete sequencing of chloroplast genome and nrDNA of Ledebouriella seseloides, Peucedanum japonicum and Glehnia littoralis-derived barcoding marker, DNA primer set for discrimination of origin and species and uses thereof}

본 발명은 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 방풍, 식방풍 및 해방풍의 종 구별을 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는, 방풍, 식방풍 및 해방풍을 구별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 방풍, 식방풍 및 해방풍의 구별 방법에 관한 것이다.

방풍(Ledebouriella seseloides, 동의어: Saposhnikovia divaricata)은 산형과(Umbelliferae, 동의어: Apiaceae)의 다년생 식물로, 풍을 막아주는 약재로 알려진 약용작물이다. 중국, 일본에서 약재로 쓰이는 방풍 역시 모두 같은 기원으로, 현재 국내에서는 원방풍(元防風)으로 통칭되고 있다.

원방풍(元防風)은 중풍치료 처방에 가장 많은 빈도로 사용되는 약재 중 하나로 이름도 여기에서 유래하였다. 원래 '원방풍'은 한국에 자생하지 않는 식물로 한국에서는 '갯기름나물'을 '식방풍'이라하여 '방풍'으로 사용하였고, 이름이 비슷한 '해방풍'을 '원방풍'이라고 부르며 혼용하고 있다. '방풍'은 「대한약전」 9개정에 'Saposhnikovia divaricata Schischkin (산형과 Umbelliferae)의 뿌리'로 규정되어 있고, 「일본약국방」에 '해방풍'으로 수재되어 있으며 「중국약전」에는 '북사삼'으로 수재된 약재로, 효능 및 주치(主治)가 '양음청폐(陽陰淸肺), 익위생진(益胃生津)하여 폐열의 건조한 기침 노수담혈(勞嗽痰血), 열병에 진상구갈(津傷口渴)에 쓰인다'고 하여 사삼과 비슷한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 효능을 지닌 방풍의 말린 뿌리와 외형적으로 매우 비슷한 유사종 해방풍(海防風, 이명: 갯방풍)과 식방풍(植防風, 이명: 갯기름나물)은 각각 Glehnia littoralis (산형과 Umbelliferae)의 뿌리 및 뿌리줄기 그리고 Peucedanum japonicum (산형과 Umbelliferae)의 뿌리이다.

한약재는 한국을 비롯하여 중국, 일본 등 한약 문화권 국가에서 오랫동안 사용되어 오고 있으며, 이러한 한약재는 지리적, 환경적, 역사적 차이 등 다양한 요인으로 인해 국가별로 기원에 대한 다양한 기준을 가지게 되었다. 또한 1990년대부터 중국을 비롯한 한약 문화권 국가로부터의 한약재 시장이 개방됨에 따라, 국내의 유사 한약재 혼용 유통이 우려할만한 수준에 이르고 있다. 원방풍의 경우 국내 재배가 전무하고 전량 중국으로부터 수입이 되고 있는 상황에서 기원이 명확하지 않은 유사 약재의 혼입이 특히 우려되고 있다. 또한, 건조 및 가공되어 유통되는 한약재의 특성상 원산지가 다른 한약재가 혼용 유통되는 사례가 발생하더라도 구분이 어렵기 때문에 유통된 방풍 약재들의 기원종(起源種) 감별 및 원산지 판별은 중요한 의미를 갖는다.

현재까지 사용되고 있는 한약재 기원종 감별법에는 형태학적 특징, 성분의 정성과 정량분석 및 DNA 수준에서의 차이점 비교 등이 있다. 형태학적 특징은 식물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있어 식물종 판별에 어려움이 있으며, 특히 약재의 경우 대부분 건조 및 가공하여 유통되므로 육안으로 식물종을 감별하기가 쉽지 않다. 또한 성분분석에 의한 약재 구분을 위해 미각센서, 핵자기 공명분광기(NMR spectrometer) 등이 이용되었으나, 이 방법은 생산지의 재배환경에 따라 약재의 성분이 영향을 받을 수 있다는 한계점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 등 DNA 단편의 다형성을 이용한 분자생물학적 식물종 판별이 시도되고 있다. 또한 최근에는, 한약재 판별에 있어서 CBOL Plant Working Group이 제안한 DNA 바코드를 이용한 분류법이 그 유용성을 인정받고 있다. 특히 게놈 상에 존재하는 핵 리보솜 DNA(Nuclear Ribosomal DNA, nrDNA)의 nrDNA-ITS(internal transcribed spacer) 부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라, 일반성, 단순성, 재현성 등의 이점으로 인해 계통분류나 종간 유전변이 탐색 등을 위해 널리 이용되는 염기서열로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈과 nrDNA 전체서열을 분석하고 염기서열을 비교하여, 방풍, 식방풍 및 해방풍을 효율적으로 식별할 수 있는 8개의 분자마커를 개발하였다.

한편, 한국공개특허 제2015-0024581호에는 '원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 구별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0673069호에는 '방풍의 종간 유전자 감별 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DAN 서열의 완전 해독 기반 기원종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 방풍(Ledebouriella seseloides)과 유사종인 식방풍(Peucedanum japonicum) 및 해방풍(Glehnia littoralis)에 대한 엽록체 게놈과 핵 리보솜 DNA(nrDNA) 전체서열을 분석하여 완성하였고, 완성된 염기서열의 서열정보를 비교하여 엽록체 게놈 서열로부터 7개의 InDel 마커를, nrDNA 서열로부터는 1개의 SNP 마커를 찾았다. 또한, 상기 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 DNA 시료들을 분석한 결과, 본 발명의 분자마커들이 방풍, 식방풍 및 해방풍을 명확하게 구분할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 방풍, 식방풍 및 해방풍의 종 구별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 방풍, 식방풍 및 해방풍을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 방풍, 식방풍 및 해방풍의 구별 방법을 제공한다.

본 발명의 분자마커들은 세포 내에서 카피수가 수백에서 수천개 존재하면서도 종 내 변이가 매우 드물게 존재하는 지역에서 발굴한 것으로 매우 안정적인 검증이 가능하며, 기존의 방법들보다 저비용 및 고효율로 방풍, 식방풍 및 해방풍을 식별할 수 있어 그 활용성이 높다. 또한, 방풍 가공제품에서도 원재료 판별이 가능하기 때문에 방풍 가공제품의 가치를 향상시킬 수 있고, 방풍의 순도 유지나 품종 보호, 그리고 종자 분쟁의 해결 등에도 이용될 수 있다.

도 1은 방풍, 식방풍 및 해방풍의 완성된 엽록체 게놈 지도이다. Ledebouriella seseloides, 방풍; Peucedanum japonicum, 식방풍; Glehnia littoralis, 해방풍.
도 2는 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 서열 비교 분석을 통한 종간 변이지역 발굴 결과이다. 화살표가 가리키는 곳이 본 발명에서 개발한 InDel 분자마커의 각 위치이다. Pj, 식방풍; Ls, 방풍; Gl, 해방풍.
도 3은 방풍, 식방풍 및 해방풍의 nrDNA 서열 비교 분석을 통한 종간 변이지역 발굴 결과로, 화살표가 가리키는 곳이 본 발명에서 개발한 SNP 분자마커의 위치이다. Pj, 식방풍; Ls, 방풍; Gl, 해방풍.
도 4는 본 발명의 분자마커 CNV01, CNV02 및 CNV03을 이용한 방풍, 식방풍 및 해방풍의 식별 결과이다. A, B 및 C는 다른 3개의 A, B, C 목표 서열에서 방풍, 식방풍 및 해방풍 게놈 간 차이가 반복서열의 반복수 차이로 나타나는 것을 모식화한 모식도이며, D는 각 분자마커에 대한 프라이머 세트(A, B 및 C의 빨간색 화살표)를 이용한 PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 로딩 사진이다. Ls, 방풍; Pj, 식방풍; Gl, 해방풍.
도 5는 본 발명의 분자마커 InDel01, InDel02, InDel03 및 InDel04를 이용한 방풍, 식방풍 및 해방풍의 식별 결과이다. Ls, 방풍; Pj, 식방풍; Gl, 해방풍.
도 6은 해방풍 45S nrDNA 서열로부터 유래한 분자마커 nrDNA01의 증폭을 위한 프라이머 위치를 나타낸 모식도(A)와 nrDNA01 분자마커를 이용한 방풍, 식방풍 및 해방풍의 식별 결과(B)이다. Gl_nrDNA specific F, 해방풍 45S nrDNA의 ITS1에 특이적인 정방향 프라이머; Gl_nrDNA control F, 세 가지 산형과 종의 5.8S rRNA에 기반한 대조구 정방향 프라이머; Gl_nrDNA control R, 세 가지 산형과 종의 5.8S rRNA에 기반한 대조구 역방향 프라이머; Ls, 방풍; Pj, 식방풍; Gl, 해방풍.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 방풍, 식방풍 및 해방풍의 종 구별을 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트는 방풍, 식방풍 및 해방풍의 종 구별을 위한 프라이머 세트이고, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트는 방풍 및 해방풍으로부터 식방풍을 구별하기 위한 프라이머 세트이고, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트는 방풍 및 식방풍으로부터 해방풍을 구별하기 위한 프라이머 세트이며, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 식방풍 및 해방풍으로부터 방풍을 구별하기 위한 프라이머 세트이다.

본 발명의 프라이머 세트는, 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 완전 서열 해독에 기반하여 개발한 7개의 InDel 마커를 증폭할 수 있는, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 방풍, 식방풍 및 해방풍의 nrDNA 염기서열 완전 해독에 기반하여 개발한 1개의 SNP 마커를 증폭할 수 있는 서열번호 15와 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 17은 역방향 프라이머이다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 17 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 17의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 방풍, 식방풍 및 해방풍을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,

방풍, 식방풍 및 해방풍 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 방풍, 식방풍 및 해방풍을 구별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 방풍, 식방풍 및 해방풍 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 실험 재료

방풍과 식방풍은 충청북도 음성군 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 채집하였으며, 해방풍은 경상북도 영덕군 영덕군청에서 채집하였다. 채집한 식물체의 잎은 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.

2. 염기서열 분석 방법

방풍, 식방풍 및 해방풍 식물체의 게놈 DNA를 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 추출하였다. 추출된 약 2㎍의 게놈 DNA는 서울대학교 농생명과학공동기기원(NICEM)에서 제조 업체가 제공하는 paired-end 표준 프로토콜에 따라 300bp 삽입 크기(insert size)의 게놈 라이브러리로 제작되었으며, 각 샘플은 다른 인덱스로 분리되어 태깅하였다. 시퀀싱은 일루미나사의 HiSeq-2000 장비에 pooled 라이브러리를 이용하여 하나의 레인의 양끝에서 101번 반복하여 진행하였다.

3. 엽록체 게놈과 핵 내 45S nrDNA 서열의 조립

차세대유전체분석기술(Next-generation sequencing, NGS)로 생산된 대량의 염기서열은 식물체 유전체 크기의 0.5~1X의 low coverage (엽록체 크기의 300~400X)에 해당하는 소량의 데이터를 이용하여 dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(출원번호 10-2013-0167982)을 통해 완성하였다. 조립 후 DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/) 프로그램과 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 엽록체 유전체의 유전자 부위를 결정하였다.

4. 중합효소연쇄반응(PCR)

PCR 반응은 총 볼륨을 25㎕로 하였고, 20ng의 주형 DNA, 각 10mM의 dNTPs, 각 10pmol의 프라이머, 1U의 Taq 중합효소(Inclone, 한국)를 사용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 DNA 변성을 수행하였고, DNA 증폭을 위해 94℃에서 45초, 54℃ 에서 45초, 72℃에서 45초를 총 35회 수행하였다. 마지막 신장 과정은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 증폭산물은 1.3% 아가로스 겔 전기영동에서 확인하였다.

실시예 1. 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 nrDNA 서열 분석

방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 내 45S nrDNA 서열은 NGS 방법을 이용하여 조립 및 완전분석하였다. 1.06~2.08Gbp의 원시데이터를 이용하여 초기 컨디그들을 생성하였고, 엽록체 게놈은 4~6개의 컨티그들을 조합하여 완성하였다. 완전해독된 엽록체 게놈의 크기는 방풍이 147,880bp, 식방풍이 164,653bp, 해방풍이 147,467bp였다(도 1). 핵 내 45S nrDNA는 1개의 컨티그를 이용하여 완성할 수 있었고, 핵 내 45S nrDNA의 크기는 방풍과 식방풍이 5,815bp, 해방풍이 5,812bp였다.

실시예 2. 염기서열 비교 분석을 통한 종간 변이지역 발굴

엽록체 게놈의 염기서열 비교 분석을 통한 종간 변이지역을 mVISTA (http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml) 프로그램을 통해 정렬한 후 시각화하였다. 엑손 지역은 푸른색으로, 유전자간 지역은 붉은색으로, tRNA와 rRNA는 하늘색으로 나타내었고, 종간 변이가 있는 부분은 흰색으로 나타내었다. 엽록체 게놈 서열의 종간 변이지역은 1,672개의 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism), 4개의 삽입-결실(InDel), 41개의 종열 반복(TR, tandem repeat)의 복제수변이(CNV, copy number variation)가 확인되었으며, 이 중 CNV 세 지역과 InDel 네 지역을 대상으로 종 구분 식별(barcoding) 마커를 개발하였다(도 2). 핵 내 45S nrDNA 서열의 종간 변이지역은 66개의 SNP를 확인하였으며, 이 중 ITS1(internal transcribed spacer 1) 지역의 SNP를 기반으로 식별 마커를 개발하였다(도 3).

엽록체 게놈과 핵 내 45S nrDNA의 염기서열 비교분석을 통하여 개발된 상기 식별 마커들을 확인하기 위한 프라이머 세트는 Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) 프로그램을 이용하여 디자인하였다. 프라이머 세트들은 모두 유전자간 영역에서 개발되었다.

방풍, 식방풍 및 해방풍 종간 구분용 식별마커 및 프라이머 세트

마커명	프라이머 서열정보 (5'→3') (서열번호)		위치	PCR 산물 크기 Ls/Pj/Gl (bp)
CNV01	F	GGTCAAATACCTAGCGACAA (1)	trnI-CAU ~ trnL-CAA	308/272/254
	R	TTATGCAAGGAGACATTGCT (2)
CNV02	F	CATCCATATCCCAATTCCAT (3)	trnN-GUU ~ ycf1	305/371/305
	R	GCTCGGAGAAGGAAGAGATA (4)
CNV03	F	CATTGAGTGCACCCTATACA (5)	psaC ~ ndhE	404/386/368
	R	TCGTAACAGAAAATCAACTCG (6)
InDel01	F	AACGAATCCTACGGTTTCTC (7)	trnS-GCU ~ trnR-UCU	266/289/269
	R	TGTCGAACAGGGATAATTTG (8)
InDel02	F	TCTCGCTTTTTAGTCAGTTTG (9)	ndhF ~ rpl32	380/379/416
	R	GCCTAATGAAAAGCCTAATGA (10)
InDel03	F	CAGGAGGATAGCAAGTTACAA (11)	rps12 ~ trnV-GAC	412/571/571
	R	CAACGCCACTATTCTTGAAC (12)
InDel04	F	CTATATGTATATACAATAACGAATCA (13)	trnE-UUC ~ trnT-GGU	652/198/633
	R	GTTCAAGAATAGTGGCGTTG (14)
nrDNA01	specific F	GTTAACAATTAGGGCGAGCA (15)	ITS1	na/na/291
	control F	GCATCGATGAAGAACGTAGC (16)	5.8S	78/78/78
	control R	GCGTTCAAAGACTCGATGGT (17)

(Ls, 방풍; Pj, 식방풍; Gl, 해방풍)

실시예 3. 분자마커를 이용한 방풍, 식방풍 및 해방풍의 종 구분

상기 프라이머 세트를 이용하여 본 발명의 분자마커를 검증하였다. 방풍, 식방풍 및 해방풍의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 분석을 수행한 결과, CNV01 마커는 trnI-CAU ~ trnL-CAA 유전자간 지역에서 18bp의 TR의 개수가 방풍이 6개, 식방풍이 4개, 해방풍이 3개인 차이에 의해 3종이 모두 구분 가능하였다(도 4A 및 4D). CNV02 마커는 trnN-GUU ~ ycf1 유전자간 지역에서 22bp의 TR이 방풍과 해방풍에서는 각 1개, 식방풍은 4개인 차이에 의해 식방풍의 구분이 가능하였다(도 4B 및 4D). CNV03 마커는 psaC ~ ndhE 유전자간 지역에서 18bp의 TR이 방풍은 2개, 식방풍과 해방풍은 각 1개가 존재했고, 동시에 18bp의 InDel이 방풍과 식방풍에 존재하여 3종이 모두 구분 가능하였다(도 4C 및 4D). InDel01 마커는 trnS-GCU ~ trnR-UCU 유전자간 지역에 존재하는 23bp의 InDel에 의해 식방풍이 구분 가능하였으며, InDel02 마커는 ndhF ~ rpl32 유전자간 지역에 존재하는 37bp의 InDel에 의해 해방풍이 구분 가능하였고, InDel03 마커는 rps12 ~ trnV-GAC 유전자간 지역에 존재하는 159bp의 InDel에 의해 방풍이 구분 가능하였으며, InDel04 마커는 trnE-UUC ~ trnT-GGU 유전자간 지역에 존재하는 454bp의 InDel에 의해 식방풍이 구분 가능하였다(도 5). 마지막으로 nrDNA01 마커는 방풍, 식방풍 및 해방풍 3종이 모두 증폭되도록 대조구 프라이머를 제작하고, 해방풍만 증폭이 되도록 ITS1 지역에서 프라이머를 제작하여, 해방풍만 구분이 가능했다(도 6).

상기의 결과를 통해, 본 발명의 CNV01과 CNV03 마커는 방풍, 식방풍 및 해방풍 3종을 동시에 구분할 수 있는 마커임을 확인할 수 있었고, CNV02, InDel01, InDel04 마커는 식방풍 구별 마커로, InDel02와 nrDNA01 마커는 해방풍 구별 마커 그리고 InDel03 마커는 방풍 구별 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION National Institute of Biological Resources <120> Complete sequencing of chloroplast genome and nrDNA of Ledebouriella seseloides, Peucedanum japonicum and Glehnia littoralis-derived barcoding marker, DNA primer set for discrimination of origin and species and uses thereof <130> PN15406 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggtcaaatac ctagcgacaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ttatgcaagg agacattgct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catccatatc ccaattccat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctcggagaa ggaagagata 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cattgagtgc accctataca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcgtaacaga aaatcaactc g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aacgaatcct acggtttctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgtcgaacag ggataatttg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tctcgctttt tagtcagttt g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcctaatgaa aagcctaatg a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 caggaggata gcaagttaca a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 caacgccact attcttgaac 20 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctatatgtat atacaataac gaatca 26 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gttcaagaat agtggcgttg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gttaacaatt agggcgagca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcatcgatga agaacgtagc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcgttcaaag actcgatggt 20

Claims (7)

1. 삭제
2. 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 방풍, 식방풍 및 해방풍의 종 구별을 위한 프라이머 세트.
3. 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 방풍 및 해방풍으로부터 식방풍을 구별하기 위한 프라이머 세트.
4. 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 방풍 및 식방풍으로부터 해방풍을 구별하기 위한 프라이머 세트.
5. 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 식방풍 및 해방풍으로부터 방풍을 구별하기 위한 프라이머 세트.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 방풍, 식방풍 또는 해방풍을 구별하기 위한 키트.
7. 방풍, 식방풍 및 해방풍 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 방풍, 식방풍 또는 해방풍을 구별하기 위한 방법.

Images