KR102393484B1 - 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102393484B1
KR102393484B1 KR1020200142787A KR20200142787A KR102393484B1 KR 102393484 B1 KR102393484 B1 KR 102393484B1 KR 1020200142787 A KR1020200142787 A KR 1020200142787A KR 20200142787 A KR20200142787 A KR 20200142787A KR 102393484 B1 KR102393484 B1 KR 102393484B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
nos
primer
resources
primer sets
Prior art date
Application number
KR1020200142787A
Other languages
English (en)
Inventor
양태진
박영상
조호준
박지영
김진태
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020200142787A priority Critical patent/KR102393484B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102393484B1 publication Critical patent/KR102393484B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 다양한 지역에서 수집된 식방풍 자원을 저비용 및 고효율로 판별할 수 있으므로, 우수한 형질을 가진 식방풍 자원 또는 계통의 보호 및 순도 유지에 이용하거나 새로운 식방풍 품종을 개발 및 육성하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker based on nuclear genome sequence for discriminating genotype of Peucedanum japonicum resources and uses thereof}
본 발명은 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
방풍은 한방에서 감기, 두통, 발열, 관절통 등의 치료에 쓰이는 생약 중 하나로, [대한민국약전 제10개정(2012)]에서는 산형과(미나리과, Umbelliferae) 다년생 식물인 Saposhnikovia divaricata (Turcz) Schischkin의 뿌리 및 뿌리줄기를 방풍의 기원식물로 정의하고 있다. 한국, 중국, 일본 등에서는 방풍의 대용으로 다른 식물들이 이용되고 있는데, 우리나라의 경우 원방풍, 진방풍, 해방풍, 식방풍, 산방풍 등의 다양한 식물들이 방풍과 혼용·유통되고 있다.
특히 한방에서 중요성이 높아 기원정립이 필요한 식물은 방풍, 해방풍, 식방풍으로, 해방풍은 갯방풍(Glehnia littoralis)의 뿌리 부분을 의미하고 식방풍은 갯기름나물(Peucedanum japonicum)의 뿌리 부분을 의미한다. 갯방풍과 갯기름나물은 방풍과 같은 산형과 식물에 속하지만 서로 속과 종이 다른 식물로, 기원이 다르기 때문에 각 식물체에 포함되어 있는 유용성분의 종류 및 함량과 효능에 차이가 있을 수 있다. 더욱이 갯기름나물(식방풍)은 품종이 다양하지 않고 대부분 야생에서 자생하는 개체들이 많고 타가수정(cross fertilization)하는 특성이 있어 다양한 자생 지역에서 수집된 각 유전자원별로 특성이 매우 상이할 수 있다.
약용식물의 판별방법으로는 크게 (1) 형태적 판별, (2) 이화학적 판별, (3) DNA 분자마커를 이용한 판별 등으로 나눌 수 있다. 식물의 형태적 판별은 근연속실생식물의 종간 구분이 어려우며, 질적형질보다는 양적형질인 경우도 많아 재배 환경에 따른 변이가 일어날 수도 있을 뿐만 아니라, 타식에 의한 혼연종 발생이 빈번하여 식물 종간 형태적 구분이 어렵다. 특히 약용식물은 약용부위에 따라 박피, 절편, 건조 등 다양한 방법으로 가공 유통되므로 전문가가 아니면 구분이 어려운 실정이다. 이화학적 성분분석에 의한 판별의 경우 분석을 위한 시간과 노력이 많이 들며, 약용식물의 재배환경 및 생육조건에 따라 약리적 성분에 변화가 올 수 있어 판별에 한계가 있다. DNA 분석에 의한 분자생물학적 식물판별기술은 위와 같은 문제점을 해결하기 위한 도구로서 인정받고 있는데, DNA 유전체는 환경의 변화에 따른 변화가 없으며, 가공 유통되어 식물 원재료를 쉽게 판별할 수 없는 한약재의 판별에도 유용하게 이용될 수 있다.
분자마커란 중합효소연쇄반응(Polymorphism Chain Reaction) 기술을 사용하여 다형성을 검출하는 방법으로 기본적으로 간단하고 신속하며 재배환경이나 식물의 발육단계, 연구자의 주관성 등 여러 환경적 요인으로부터 결과에 영향을 받지 않는다. 식물의 경우는 핵, 미토콘드리아, 엽록체 게놈 등 3개의 게놈을 가지고 있다. 식물의 유전정보의 대다수는 핵 게놈에 존재하지만 게놈의 크기가 크고, 많은 인트론(intron)과 엑손(exon)으로 구성되어 있어, 특정 유전자의 염기 서열을 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 분석하여 식물종의 보존이나 식별에 이용하는데는 제한적이며, 핵 리보솜 DNA(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)의 ITS(internal transcribed spacer) 부위, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)의 특정 인트론 부위 등이 이용된다.
한편, 한국등록특허 제1807623호에 '방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1573981호에 '원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 구별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 울릉도 에서 자생하는 식방풍의 핵 게놈 발현 유전자 서열을 해독한 후 한택식물원에서 수집된 식방풍과 제주도에서 자생하는 식방풍의 핵 게놈 DNA 서열을 비교하여 각 자원 간에 SNP(single nucleotide polymorphism) 변이를 보이는 염기서열에 기반한 분자마커를 개발하였다. 또한 본 발명의 분자마커가 식방풍 자원의 유전자형 분석을 통해 다양한 지역에서 자생하거나 수집된 식방풍 자원을 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 16의 올리고뉴클레오티로 이루어진 8개의 프라이머 세트를 포함하는 식방풍(Peucedanum japonicum) 자원의 유전자형 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 17, 18 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 식방풍 자원의 유전자형 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 식방풍 자원의 유전자형 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 식방풍 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 식방풍 자원의 유전자형을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 분자마커는 국내의 다양한 지역에서 수집된 식방풍 자원의 유전자형을 판별하여 식방풍 자원을 효율적으로 판별할 수 있으므로, 우수한 형질을 가진 식방풍 자원의 보호 및 순도 유지에 활용하거나 새로운 식방풍 품종의 개발 및 육성에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 저감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 식방풍 자원의 핵 게놈 DNA 서열에서 SNP 변이의 발굴 및 상기 SNP 변이에 기반한 분자마커를 개발하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 PJ_Nuc1, PJ_Nuc4 또는 PJ_Nuc7 프라이머 세트를 이용하여 다양한 식방풍 자원의 유전자형을 판별한 HRM(high resolution melting) 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 PJ_Nuc10, PJ_Nuc14 또는 PJ_Nuc16 프라이머 세트를 이용하여 울릉도 자생 식방풍 및 한택식물원 식방풍 자원의 유전자형을 판별한 HRM 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 PJ_Nuc6 또는 PJ_Nuc9 프라이머 세트를 이용하여 울릉도 자생 식방풍 및 한택식물원 식방풍 자원의 유전자형을 판별한 HRM 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 PJ_Nuc6 또는 PJ_Nuc9 프라이머 세트를 이용하여 다양한 식방풍 자원의 유전자형을 판별한 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 PJ_Nuc_TIR 프라이머 세트를 이용하여 다양한 식방풍 자원의 유전자형을 판별한 KASP(kompetitive allele specific PCR) 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 식방풍(Peucedanum japonicum) 자원의 유전자형 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 16의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 16의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 8개의 프라이머 세트는 울릉도, 한택식물원(경기 용인시) 및 제주도에서 수집된 식방풍 자원의 핵 게놈 상에 위치하는 SNP 변이를 확인할 수 있는 프라이머 세트로, 상기 14개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 각 마커별 결과들을 조합하여 식방풍 자원의 유전자형을 판별할 수 있고, 각 자원의 유전자형을 조합하면 다양한 지역에서 자생하거나 수집된 식방풍 자원들을 효율적으로 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 16의 프라이머 세트는 HRM 분석을 위해 사용될 수 있으며, 이 중에서 서열번호 5 및 6과 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 HRM(high resolution melting) 분석뿐만 아니라 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 분석을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 식방풍 자원은 식방풍의 다양한 자생 지역, 종자회사 또는 식물원 등에서 수집된 것으로, 식방풍은 품종이 다양하지 않고 대부분 야생에서 자생하는 개체들이 많고 타가수정(cross fertilization)하는 특성이 있으므로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 식방풍 유전자원을 자생 지역별로 구별하거나 식방풍 유전자원의 유전적 기원을 밝히는데 사용할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 프라이머 세트를 울릉도, 한택식물원 및 제주도 이외에 다른 여러 지역에서 자생 또는 수집된 식방풍 자원에 적용했을 때 울릉도, 한택식물원 및 제주도 식방풍 자원의 유전자형과 다르면 식방풍 자원의 자생 지역 또는 유전적 기원이 상이한 것으로 판단할 수 있고, 울릉도, 한택식물원 및 제주도 식방풍 자원의 유전자형과 유사 또는 동일하면 자생 지역은 다를 수 있지만 유전적 기원이 동일한 것으로 판단할 수 있다. 또한, 울릉도, 한택식물원 및 제주도뿐만 아니라 다른 자생 지역에서 수집된 식방풍 자원의 유전자형을 조합하여 출처가 불분명한 식방풍 자원에 대한 유전적 기원 분석도 가능하다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 17, 18 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 식방풍 자원의 유전자형 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 17, 18 및 19의 프라이머는 울릉도, 한택식물원 및 제주도에서 자생 또는 수집된 식방풍 자원의 핵 게놈 서열 간의 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기 타입을 검출하기 위한 KASP용 프라이머 세트이다.
본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR(polymerase chain reaction) 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.
본 발명의 상기 서열번호 17, 18 및 19의 프라이머는 연속되는 서열번호 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루며, 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 상기 2개의 정방향 프라이머의 5' 말단에 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP 염기가 결합되어 있다(표 2).
본 발명의 상기 서열번호 17, 18 및 19의 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 17, 18 및 19의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 형광물질 FAM이 부착된 정방향 프라이머이고, 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 HEX가 부착된 정방향 프라이머이며, 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명의 서열번호 17, 18 및 19로 표시된 1개의 프라이머 세트는 정방향 프라이머에 부착된 형광 물질의 종류를 통해 SNP 염기를 확인하여 다양한 지역에서 자생 또는 수집된 식방풍 자원의 유전자형을 판별할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 식방풍 자원의 유전자형 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트 및 식방풍 자원은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 프라이머 세트 중 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트와 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 SNP 변이 검출을 위한 CAPS 분석에 사용 가능하므로, 서열번호 5 및 6, 또는 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 포함하는 키트에는 제한효소 HaeⅢ 또는 XhoI를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 포함하는 키트에는 제한효소 HaeⅢ를 추가로 포함할 수 있고, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 포함하는 키트에는 제한효소 XhoI를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
식방풍 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 식방풍 자원의 유전자형을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트 및 식방풍 자원은 전술한 바와 같다.
본 발명의 방법은 식방풍 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 식방풍 시료는 이에 한정되지 않으나, 식방풍(갯기름나물) 식물체의 잎, 뿌리, 뿌리 줄기, 꽃, 열매 혹은 이들이 건조된 형태로 가공된 산물일 수 있다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식방풍 유전자원을 판별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 HRM(high resolution melting) 분석, 형광 측정, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다. 또한, 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트 중에서 서열번호 1 내지 16의 프라이머 세트는 HRM(high resolution melt) 분석을 위한 것으로,
식방풍 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 16의 프라이머 세트를 이용하여 품종별 특이 부위를 각각 증폭하는 단계; 및 상기 각 증폭된 산물을 HRM(high resolution melt) 분석을 통해 식방풍 자원의 유전자형을 판별할 수 있다.
또한, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 CAPS 분석을 위한 것으로,
식방풍 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및 상기 분리된 절단 산물의 패턴(pattern)을 각 식방풍 자원별로 비교 분석하는 단계;를 통해 식방풍 자원의 유전자형을 판별할 수 있다. 바람직하게는 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 이용할 경우에는 제한효소 HaeⅢ를 사용할 수 있고, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 이용할 경우에는 제한효소 XhoI을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 서열번호 17, 18 및 19의 프라이머 세트는 KASP 분석을 위한 것으로,
식방풍 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17, 18 및 19의 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 통해 식방풍 자원의 유전자형을 판별할 수 있다. 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계는 정방향 프라이머의 5' 말단에 부착되어 있는 형광물질 FAM 또는 HEX의 검출에 따라 유전자형을 판별할 수 있다. HEX가 검출되면 A 유전자형으로, FAM이 검출되면 B 유전자형으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식방풍 자원의 유전자형 판별을 통해 식방풍 자원을 판별할 수 있고, 식방풍 자원의 판별은 본 발명에 따른 각 분자마커를 이용한 결과들을 조합하여 유전자형을 결정함으로써 이루어질 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 식방풍 유전자원의 전사체 서열 생산
울릉도 자생 식방풍 자원의 전사체 서열을 생산하기 위해 RNA 분리 과정을 통해 total RNA를 확보하였다. 구체적으로 PacBio(Pacific Biosciences) 사의 RSII platform의 Isoseq method를 이용하여 full length non-chimeric cDNA 리드를 생산하였으며, 군집화(clustering)와 분류(classification) 과정을 통해 HQ(High Quality) 전사체 서열을 획득하였다. 또한 추가적인 필터링을 통해 PCR chimera와 중복서열을 제거하여 78,069개의 HQ nr transcript(High Quality non-redundant) 전사체 서열을 확보하였다(표 1).
울릉도 자생 식방풍의 전사체 서열
HQ nr transcript sequence statistics
Number of sequences 78,069 reads
Shortest sequence 249 bp
Longest sequence 6,499 bp
Sequence average length 2,611 bp
AT content 60.1%
GC content 39.9%
Total sequence length 203,907,746 bp
실시예 2. 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 SNP 마커 개발
상기 울릉도 유래 식방풍의 전사체 서열에서 변이지역을 탐색하기 위해서 울릉도 식방풍의 전사체 서열과 한택식물원에서 수집된 식방풍 개체 및 제주도에서 자생하는 식방풍 개체의 핵 게놈 DNA 서열을 비교 분석하였다. 구체적으로 한택식물원에서 수집된 개체는 Illumina platform의 Hiseq method를 통해 서열을 생산하였으며, 제주도에서 수집된 개체는 Illumina platform의 Miseq method를 통해 생산된 서열을 사용하였다.
Hiseq를 통해 생산된 한택식물원 개체와 MIseq으로 생산된 제주도 개체의 DNA 서열은 울릉도 개체의 전사체 서열과 각각 비교하여 전사체 서열과의 변이지역을 탐색하고, 전사체 서열 내에서 한택식물원과 제주도 식방풍 자원과 유사한 유전자 서열이 없는 변이지역만을 선발한 후 변이지역이 실제로 유전자로 번역될 가능성이 높은 지역만을 선발하였다(도 1).
구체적으로, 우선 울릉도 자생 식방풍 개체의 HQ nr 전사체 서열을 확보한 후 한택식물원과 제주도에서 각각 수집한 개체에서 생산된 DNA 서열들을 전사체 서열에 맵핑하여 raw variant를 확보하였고, 이를 GATK(Genome Analysis Tool Kit ver 3.8)의 variant calling에서 널리 사용되는 variant 필터링 값(Quality 30이상, Quality Depth 2이상, Fisher Strand 60이하, Mapping Quality 40이상, Depth 5이상)을 사용하여 필터링 과정을 진행하였다. 상기 확인된 SNP 변이 중 양쪽 100 bp에서 다른 SNP 변이가 존재하지 않는 영역 중 2가지의 동형접합 유전자형(AA, BB)을 가지는 영역만을 선발하였다. 이렇게 선발된 SNP 변이의 양쪽 150 bp 서열을 추출하고, 추출된 서열 간의 비교를 통해 유사 서열이 없는 경우만을 선발하였다. 또한 SNP 변이를 가지고 있는 전사체 서열들은 web 기반의 NCBI NR Blast(BlastN & BlastX), NCBI ORF Finder 및 NCBI CD search를 수행하여 유전자 지역으로 예측되면서 완전한 ORF와 보존된 도메인(conserved domain)을 가지는 전사체 서열을 선별하였다. 이를 통해 유전자로 번역될 가능성이 높은 전사체 서열에 존재하는 SNP 변이만을 선발하였다. 이후 clc assembly cell(ver.4.6beta, CLC inc, Denmark)에 내장된 clc mapper tool을 통해 SNP 변이들을 clc_viewer로 확인한 후 상기 SNP 변이를 기반으로 프라이머 세트를 제작하였다(표 2). PJ_Nuc_TIR 프라이머 세트의 FAM Allele은 울릉도 자생 개체의 유전자형을, HEX Allele은 제주도 개체의 유전자형을 의미한다.
Figure 112020115688353-pat00001
실시예 3. 본 발명의 SNP 마커를 이용한 식방풍 자원의 유전자형 판별
3-1. HRM 분석
상기 표 2의 SNP 기반 프라이머 세트 중에서 'PJ_Nuc1, PJ_Nuc4, PJ_Nuc6, PJ_Nuc7, PJ_Nuc9, PJ_Nuc10, PJ_Nuc14 또는 PJ_Nuc16'을 이용하여 다양한 식방풍 자원을 대상으로 HRM 분석을 수행하였다. PCR 반응액은 각 식방풍 자원의 게놈 DNA 2 ㎕(20 ng), 10 μM의 프라이머 2 ㎕, Inclone 사의 10X rxn buffer 2 ㎕, dNTP mixture (10mM/㎕) 0.4 ㎕, Taq mixture 0.2 ㎕, Invtrogen 사의 SYTO9(cat.no: S34854) 99:1 희석액 1㎕, 증류수 12.4 ㎕을 혼합하여 총 20 ㎕이 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분 동안 유지시킨 다음 45 사이클(95℃ 20초, 59℃ 20초)로 반복한 후 융해곡선(melt curve) 분석 단계에서 95℃ 60초, 40℃ 60초, 60℃ 5초간 유지한 후 95℃까지 0.02℃/s의 ramp rate로 형광(fluorescence)를 측정하였다.
PJ_Nuc1, PJ_Nuc4 및 PJ_Nuc7 프라이머 세트를 울릉도 식방풍 3개체(울릉1, 4 및 7), 한택식물원 2개체(한택4 및 5), 제주도, 마라도, 외도, 연도 및 세계종묘의 총 10개체에 적용한 결과, 울릉1 및 울릉7 개체를 제외하고 각 개체의 유전자형을 판별할 수 있음을 확인하였다(도 2).
또한, PJ_Nuc14 프라이머 세트를 울릉도 3개체(울릉1, 4 및 7) 한택식물원 1개체(한택4)의 총 4개체에 적용한 결과 각 개체들의 유전자형을 판별하여 4개체를 2가지 타입으로 구분하였고, PJ_Nuc10 및 PJ_Nuc16 프라이머 세트를 울릉도 개체(울릉4)와 한택식물원 개체(한택4)의 총 2개체에 적용한 결과 두 개체를 구별할 수 있음을 확인하였다(도 3). 또한, PJ_Nuc6 및 PJ_Nuc9 프라이머 세트는 한택식물원 개체(한택4)와 울릉도 개체(울릉4) 구별이 가능함을 확인하였다(도 4). 상기 HRM 분석 결과에서 A 유전자형은 울릉4 개체의 유전자형을 의미하고, B 유전자형은 한택4 개체의 유전자형을 의미한다. 따라서, 상기 프라이머 세트를 조합하여 다양한 식방풍 자원의 유전자형을 판별하면 자생하거나 수집된 지역에 따른 식방풍 자원을 판별할 수 있거나, 유전적 기원의 판별이 가능하다.
3-2. CAPS 분석
상기 표 2의 SNP 기반 프라이머 세트 중에서 'PJ_Nuc6 및 PJ_Nuc9'를 이용하여 다양한 식방풍 자원을 대상으로 CAPS 분석을 수행하였다. 각 식방풍 유전자원의 게놈 DNA 2 ㎕(20 ng), 10 μM의 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 μM의 역방향 프라이머 1 ㎕), Inclone 사의 10X rxn buffer 2.5 ㎕, dNTP mixture (10mM/㎕) 0.5 ㎕, Enhancer 5 ㎕, Taq mixture 0.2 ㎕, 증류수 12.8 ㎕을 혼합하여 총 25 ㎕의 PCR 반응 혼합물을 만들었다. PCR 과정은 전변성 94℃ 10분; 변성(denaturation) 94℃ 20초, 결합(annealing) 59℃ 20초, 신장(extension) 72℃ 20초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 7분의 조건으로 수행하였다.
상기 PCR이 끝난 후 상기 PCR 산물을 제외한 나머지 불순물을 제거한 후, 상기 정제한 PCR 산물 5 ㎕, 제한효소 HaeIII(PJ_Nuc6) 또는 XhoI(PJ_Nuc9) 0.2 ㎕, New England Biolabs에서 제공하는 각 효소에 사용되는 버퍼(1X CutSmart® Buffer) 1.5 ㎕ 및 증류수 8.3 ㎕를 혼합하여 총 15 ㎕의 반응물을 제조한 다음 37 ℃에서 210분 동안 반응시켰다.
상기 제한효소에 의해 절단된 단편의 다형성을 확인하기 위해 3% 아가로스 겔에 전기영동한 결과, PJ_Nuc6 및 PJ_Nuc9 프라이머 세트 모두 한택4 및 울릉4 개체를 구별할 수 있음을 확인하였고(도 5A), PJ_Nuc6 및 PJ_Nuc9 프라이머 세트를 서울대학교 농업생명과학대학 수원캠퍼스에서 육성중인 식방풍 16개체와 수집자원 2개체에 적용한 결과, 이들의 유전자형을 식별하여 총 20개체의 식방풍을 8개 그룹으로 구분되는 것을 알 수 있었다(도 5B). 또한 상기 CAPS 분석 결과에서 A 유전자형은 PCR 부산물이 제한효소에 의해 절단되지 않는 유전자형을 의미하고, B 유전자형은 PCR 부산물이 제한효소에 의해 절단되는 유전자형을 의미한다.
3-3. KASP 분석
본 발명의 KASP 프라이머 세트 'PJ_Nuc_TIR'은 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있고, 정방향 프라이머의 5' 말단에는 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고, 3' 말단에는 SNP와 같은 염기서열의 차이가 구분되도록 디자인하였다. 그리고 역방향 프라이머는 상기 2개의 정방향 프라이머와 작동하여 PCR 반응이 진행될 수 있도록 디자인하였다. PCR을 수행하면 2개의 정방향 프라이머의 5' 말단이 각기 다른 형광물질이 붙은 채로 증폭되므로, 형광물질의 파장 차이에 따라 식방풍 유전자원의 유전자형을 분석할 수 있다. 유전자형이 동형접합체(homozygous)라면 두 개의 형광(FAM 또는 HEX) 중 한 개의 형광만 검출된 것으로, HEX가 검출되면 'A', FAM이 검출되면 'B' 유전자형으로 표시하였다.
KASP 실험을 위해 LGC Biosearch Technology 사에 의뢰하여 제작된 Master mix 및 Assay Mix를 사용하였고, PJ_Nuc_TIR 프라이머 세트를 이용하여 KASP(kompetitive allele specific PCR) 분석을 수행하여 식방풍 유전자원의 유전자형을 분석하였다. KASP 반응을 위해 각 식방풍 유전자원의 게놈 DNA 2 ㎕(20 ng), KASP Master mix 5 ㎕(LGC Biosearch Technology), KASP Assey mix 0.07 ㎕(LGC Biosearch Technology) 및 증류수 2.93 ㎕를 혼합하여 총 10 ㎕의 반응 혼합물을 만들었으며, KASP 반응 조건은 하기 표 3과 같다. 결과물은 Roshu사의 LC480 기기를 통해서 확인하였다.
KASP 조건
단계 온도(℃) 시간(초) 반복 횟수
Hot-start activation 94 900 1
Touchdown 94 20 10
61 60
PCR 94 20 29
55 60
Plate Read 37 60 1
PJ_Nuc_TIR 프라이머 세트를 다양한 자생 지역, 약초원, 식물원 등에서 수집한 식방풍 55개체와 서울대학교 농업생명과학대학 수원캠퍼스에서 육성중인 계통 94계통의 총 149개체에 적용한 결과, 유전자형이 3가지 타입으로 판별되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Molecular marker based on nuclear genome sequence for discriminating genotype of Peucedanum japonicum resources and uses thereof <130> PN20313 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 catatcactg acaccaactc tctca 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cagtggacat ctgcagagag aaa 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aagcgtgtag cagagaatcg t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 actccatctc ttacggcact g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cccccacccc taaaatccaa a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggccagtctg tttccacctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ccgctttgcg atttctctgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgagttggcg agctacgatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgcgagccga tcatttcaag 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcatgtcacc ggattctgca t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaagggcaat gtttgggagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccctcaagcg aacaacagga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aggcaaacga gccaccaata 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctttgtcct tcccaaaagg g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 accaagccca gctcaagttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccttgttcgg gttcgacagt 20 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 caatctttgc atactaatga aaccgag 27 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ccaatctttg catactaatg aaaccgaa 28 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gttctttcac tagtgaaatc ccataaagat 30

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 식방풍(Peucedanum japonicum) 자원의 유전자형 판별용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 17, 18 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 식방풍(Peucedanum japonicum) 자원의 유전자형 판별용 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 식방풍(Peucedanum japonicum) 자원의 유전자형 판별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 식방풍 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 식방풍(Peucedanum japonicum) 자원의 유전자형을 판별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, HRM 분석, 형광 측정, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
KR1020200142787A 2020-10-30 2020-10-30 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도 KR102393484B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200142787A KR102393484B1 (ko) 2020-10-30 2020-10-30 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200142787A KR102393484B1 (ko) 2020-10-30 2020-10-30 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102393484B1 true KR102393484B1 (ko) 2022-05-04

Family

ID=81584343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200142787A KR102393484B1 (ko) 2020-10-30 2020-10-30 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102393484B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150024581A (ko) * 2013-08-27 2015-03-09 주식회사 케이티앤지 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 구별 방법
KR20170068093A (ko) * 2015-12-09 2017-06-19 서울대학교산학협력단 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150024581A (ko) * 2013-08-27 2015-03-09 주식회사 케이티앤지 원방풍, 해방풍 및 식방풍을 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 원방풍, 해방풍 및 식방풍 구별 방법
KR20170068093A (ko) * 2015-12-09 2017-06-19 서울대학교산학협력단 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2020 KSBS international conference on Plant Digital Breeding, 8월, 2020년, PI-0056, p.488.* *
KOREAN J. INTL. AGRI., 25(4), P. 395~405 (2013) [DOI.ORG/10.12719/KSIA.2013.25.4.395] *
NCBI REFERENCE SEQUENCE: XM_017374033.1 *
NCBI REFERENCE SEQUENCE: XM_023149353.1 *
NCBI REFERENCE SEQUENCE: XR_689883.3 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101912192B1 (ko) 도라지 품종 판별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
CA2803940A1 (en) Application of a pcr sequencing method, based on dna barcoding technique and dna incomplete shearing strategy, in hla genotyping
KR102121570B1 (ko) 인삼 품종 또는 자원의 판별 및 분류를 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101961653B1 (ko) 고구마 품종 판별용 ｓｎｐ 분자 마커 및 이의 용도
KR102287539B1 (ko) 물들메나무의 유전다양성 분석용 초위성체 마커 조성물 및 이를 이용하는 방법
KR102163233B1 (ko) 양송이 품종 새정, 새아, 설강 구별을 위한 ssr 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102393484B1 (ko) 식방풍 자원의 유전자형 판별을 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR101291609B1 (ko) 김 종 구분용 엽록체 ｃａｐｓ 마커
KR102335806B1 (ko) 대추 산조 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
CN104593510A (zh) 检测花生fad2基因snp等位变异的引物、探针及方法
KR102380784B1 (ko) 식방풍 유전자원 판별용 분자마커 및 이의 용도
CN110878372B (zh) 银缕梅微卫星标记组合及其引物和应用
KR102144673B1 (ko) 참외의 품종 구별 및 f1 종자 순도검정을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102135173B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 모감주나무의 개체 식별 방법
KR101864858B1 (ko) 중국당귀, 구당귀 및 일당귀 계통 판별용 조성물 및 이의 용도
KR20210099467A (ko) 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법
KR102429948B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 산겨릅나무의 개체 식별 방법
KR100991219B1 (ko) 인삼과 화기삼의 구별을 위한 마커, 상기 마커를 증폭하기위한 프라이머, 및 이들의 용도
KR102284051B1 (ko) 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물
KR102370010B1 (ko) 국내 대추 품종과 일본 대추 품종을 구별하기 위한 엽록체 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도
KR102418879B1 (ko) 인삼 종 및 유전자원의 유전자형 분류를 위한 미토콘드리아 유래 kasp 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102126809B1 (ko) 참당귀 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도
KR102309663B1 (ko) 인삼 품종 또는 자원의 대규모 유전형 판별 및 분류를 위한 플루이다임 기반 snp 칩 및 이의 용도
KR102412793B1 (ko) 국산 밀 품종 판별을 위한 snp 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102151225B1 (ko) 국내 재래종 도라지를 구별하기 위한 핵 게놈 서열 기반 분자마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant