KR102284051B1 - 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백미꽃 속(Cynanchum genus) 식물의 종 구별용 조성물, 이를 포함하는 백미꽃 속 식물 구별용 키트, 및 이를 이용한 백미꽃 속 식물의 종 구별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프로브를 포함한 조성물을 이용하면, 1회의 멀티플렉스 Real time-PCR을 통해 별도의 PCR 증폭산물의 측정단계 없이도 백미꽃 속 식물의 구체적인 종을 간단하고 신속, 정확하게 판별할 수 있으므로, 품종 간 혼용을 방지하는 데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물{Composition for distinguishing a plant of genus Cynanchum}

본 발명은 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 백미꽃 속 식물의 종 구별용 프로브를 포함하는, 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 백미꽃 속 식물의 종 구별용 키트, 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법에 관한 것이다.

백수오는 한국, 일본 및 중국에서 사용되는 가장 중요한 약용식물 중 하나로, 대한민국약전외한약(생약)규격집에 등재된 품목으로, 은조롱(Cynanchum wilfordii Hemsley)의 건조된 뿌리부분에 속하는 것으로 규정하고 있다.

삼지구엽초(Epimedii Herb)는 노화의 진행을 늦추는 것과 같은 혈관질병, 당뇨병, 허혈에 의한 질병과 관련된 다양한 노인병에 널리 사용되어 왔다.

백미꽃 속 (Cynanchum genus)의 식물인 백수오와 이엽우피소, 절관우피소는 외형적으로 유사하여 육안으로 감별하기가 힘들다. 대부분의 약초는 원래의 형태학적 특징을 볼 수 없는 파우더 또는 조각으로 유통 및 판매됨에 따라 각 식물을 정확히 구분하는 것이 실질적으로 쉽지 않다. 따라서, 백미꽃 속 (Cynanchum genus)의 식물인 백수오와 이엽우피소 절관우피소는 혼용될 문제가 있으며 백수오 임을 명확히 확인하여 동일한 속의 식물 간에 혼용되는 문제를 방지할 수 있는 기술 개발이 필요한 상황이다.

이와 관련하여 비교적으로 DNA 기반 분석은 연령이나 환경 조건에 의한 영향이 적어, DNA fingerprinting에 대한 신뢰 가능한 분석 방법으로 널리 사용되고 있다.

현재까지 random amplified polymorphic DNA (RAPD) (Cui et al, 2003 and Shim et al, 2003 and Shaw et al, 1995), sequence characterized-amplified region (SCAR) (Choi et al, 2008 and Wang et al, 2001)방법 등이 사용되고 있으나, 여전히 신속하고 정확한 종간 분별 방법의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과, 엽록체 DNA (cpDNA) psbA-trnH 유전자 간 영역(intergenic spacer region)을 분석하여 백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum) 및 절관우피소(C. boudieri)의 특이적 SNP를 이용한 프로브를 제작하여 세 종의 식물을 정확하게 구별 및 동정할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 서열번호 3 내지 5의 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하는, 백미꽃 속(Cynanchum genus)식물의 종 구별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 백미꽃 속 식물의 종 구별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 백미꽃 속 식물의 개체로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 PCR증폭산물을 수득 및 분석하여 백미꽃 속 식물의 종을 판별하는 단계를 포함하는, 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 서열을 가지는, 백미꽃 속 식물의 종 구별용 프로브를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명자들은 서로 다른 종의 백미꽃 속 식물로부터 얻어진 DNA 시료 중에서 엽록체 DNA (cpDNA) 광계시스템 단백질 D1 (psbA)유전자 및 tRNA-His(trnH) 유전자부위의 백미꽃 속 식물의 SNP부위를 모두 포함하도록 유니버셜 프라이머를 제작하였고, 이러한 SNP부위를 이용하여 각 식물의 특이적 프로브를 제작 및 멀티플렉스 Real time-PCR를 수행한 결과, 백미꽃 속의 각 종에 특이적인 DNA 마커를 한번의 PCR 수행으로 효과적으로 검출하여 이를 구분할 수 있음을 확인하였다. 특히, 유사한 품종으로 인식되는 백수오와 이엽우피소 및 절관우피소 중 백수오를 정확하고 신속하게 분별할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 3 내지 5의 프로브 중 어느 하나 이상을 포함하는, 백미꽃 속 (Cynanchum genus)식물의 종 구별용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 '백미꽃 속(Cynanchum genus)'이란 박주가리과(Asclepiadaceae)에 속하는 식물로, 백수오는 (Cynanchum wilfordii 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 및 절관우피소(Cynanchum boudieri)로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 본 발명의 프로브를 이용하여 구별할 수 있는 백미꽃 속 식물은 제한 없이 포함된다.

본 발명의 용어 "프로브"란, DNA 또는 RNA의 특정 염기서열에 상보적인 절편을 의미하는 것으로, 본 발명의 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 DNA 절편을 의미한다.

서열번호 3은 백수오에 특이적인 염기서열을 가지며, 서열번호 4는 이엽우피소에 특이적 염기서열, 서열번호 5는 절관우피소에 특이적 염기서열을 가진다.

상기 프로브는 백미꽃 속 식물의 종을 구별하기 위한 것으로, 백미꽃 속 식물의 엽록체 DNA의 psbA-trnH 영역의 유전자 사이의 비 암호화 된 DNA 영역의 다형성 마커 또는 DNA 마커에 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 종간의 특이적인 위치에 결합하는 것일 수 있다.

상기 프로브는 백미꽃 속 식물의 DNA 마커에 상보적 서열을 포함함으로 인해 종 특이적인 염기서열을 포함할 수 있다(표 1 및 도 1참조). 상기 종특이적 염기서열을 포함함으로 인해 백미꽃 속 식물인 백수오, 이엽우피소, 절관우피소를 특이적으로 검출 및 동정할 수 있다.

상기 프로브를 이용하여 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭 산물에 서열번호 3 내지 5의 프로브가 결합될 수 있고 해당 프로브에 결합된 표지를 검출함으로 인해 백수오, 이엽우피소, 절관우피소를 각각 구별할 수 있다.

상기 프로브는 형광물질, 방사성물질 또는 인광물질로 표지된 것일 수 있다.

상기 본 발명의 프로브는 방사선 원소, 형광으로 표지된 염기를 포함할 수 있으며, 또는 형광물질, 방사성물질, 또는 인광 물질이 화학적으로 결합된 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 프로브는 양끝에 리포터(reporter)와 소광제(quencher)라는 형광물질이 붙어 있는 구조를 가질 수 있다. 이때, 리포터와 소광제가 근접하여 존재하면 형광을 서로 상쇄하여 리포터의 형광이 감지되지 않으나, 증폭이 진행됨에 따라 리포터가 소광제로부터 떨어지면 리포터의 형광이 감지되는 것이다. 따라서 형광의 강도는 PCR 증폭 사이클이 증가함에 따라 점점 증가하게 된다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 리포터는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, JOE, TAMRA, RoX, CY5 또는 CY3를 사용하고, 상기 소광제는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabsyl을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 프로브는 PCR 수행 중 타겟 서열과의 혼성화 시간을 향상시키는 당업자에게 공지된 다른 분자를 포함할 수 있다. 일 구체예로, 핵산 결합 단백질 또는 소홈 접합제(minor groove binder)일 수 있으며, 바람직하게는 소홈접합제 일 수 있다.

상기 프로브는 백미꽃 속 식물의 종 특이적인 엽록체 DNA psbA-trnH 영역을 검출할 수 있다.

본 발명의 "psbA-trnH 영역 또는 부위"는 식물의 엽록체 DNA (cpDNA) 중 광계시스템 단백질 D1 (psbA)유전자 및 tRNA-His(trnH)유전자의 비 암호화(non-coding)부위로 단백질을 암호화하고 있지 않아서 빠르게 진화하여 염기 삽입/결실(indels)과 치환(substitutions)이 빈번하게 존재하는 위치일 수 있다.

본 발명의 목적상 종 특이적 SNP 위치가 포함되는 동시에, 범용적 프라이머에 의해 보존지역이 증폭될 수 있는 영역은 제한 없이 포함한다.

본 발명 용어 "DNA 마커"란, 백미꽃 속 식물의 종을 구별할 수 있는 각 백미꽃 속 식물의 DNA 상의 특이적 표지를 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 목적상 상기 DNA 마커는 백미꽃 속 식물의 엽록체 DNA의 psbA유전자 및 trnH 영역 다형성 마커일 수 있다.

용어 "단일 염기 다형성" 또는 "SNP"는 하나 이상의 변형 염기를 보유한 염기서열을 동반하는 임의의 위치를 의미한다. 단일 염기 다형성(SNP)은 제작된 기준 참조 DNA 서열과의 차이로서 일반적으로 정의되거나, 또는 일반 집단에서 추출한 개체의 부분 집단 사이에서 발견되는 차이로서 정의된다.

상기 프로브를 포함하는 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물은 엽록체 DNA psbA-trnH 영역을 검출 또는 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.

발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3'말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다.

본 발명의 "프라이머" 또는 "유니버셜 프라이머" 또는 "범용적 프라이머"는 백미꽃 속의 식물 종간에 공통된 엽록체 DNA psbA-trnH 영역을 검출 또는 증폭하기 위한 것으로 서열번호 1 및 2를 한 세트로 한다.

본 발명에서 상기 DNA 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 DNA 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이면 사용 가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 백미꽃 속 식물의 DNA마커를 포함하는 부위인 psbA-trnH 유전자 사이의 비 암호화 된 DNA 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍이다. 상기 프라이머 세트는 PCR을 통해 백미꽃 속 식물의 DNA마커를 포함하는 DNA영역을 증폭시킬 수 있다. 상기 프라이머를 통해 백수오 163bp, 이엽우피소 86bp, 절관우피소 149bp 크기의 증폭산물을 얻을 수 있으며 이는 백미꽃 속 식물의 종 특이적 부위인 DNA 마커 부분을 포함하고 있다(도 2 참조). 상기 증폭된 산물을 기반으로 백미꽃 속 식물의 종을 구별할 수 있다.

상기 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법은 상기 증폭 산물에 포함된 종 특이적 부위인 DNA 마커을 이용할 수 있다. 상기 DNA 마커를 포함하는 DNA 영역에 서열번호 3 내지 5의 프로브가 결합될 수 있고 해당 프로브에 결합된 표지를 검출함으로 인해 백수오, 이엽우피소, 절관우피소를 각각 구별할 수 있다.

또한, 상기 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법은 DNA 증폭산물의 크기를 판별하는 일반적인 방법에 의해 이루어 질 수 있다. 일 구체예로 전기영동을 통해 이루어 질 수 있으며, 구체적으로 163bp인 경우 백수오, 86bp인 경우 이엽우피소, 149bp인 경우에는 절관우피소로 구별이 가능하다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태는 상기 프로브 또는 프라이머 세트를 포함하는 백미꽃 속 식물 구별용 키트를 제공한다.

상기 프로브, 프라이머 세트, 백미꽃 속 식물에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

상기 키트는 이에 제한되지는 않으나, PCR 키트, DNA 분석용(예, DNA칩)키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 백미꽃 속 식물의 각 종에 특이적인 다형성 마커를 증폭하여 확인함으로써, 백미꽃 속 식물의 구체적인 종을 구별하는데 사용할 수 있다.

구체적인 일 예로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 멀티플렉스 Real time-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, 멀티플렉스 Real time-PCR 키트는, 상기 백미꽃 속 식물의 다형성 마커를 포함하는 DNA 절편을 증폭하기 위한 유니버셜 프라이머로, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 각 식물 종에 특이적인 다형성 마커를 검출하기 위한 서열번호 3 내지 5의 프로브 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 다양한 효소(Taq-폴리머라아제 등), DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 백미꽃 속 식물의 종 구별용 DNA 칩 키트일 수 있다. 본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 백미꽃 속 식물을 구별하는 방법은, 백미꽃속 식물의 개체로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 상기 서열번호 3 내지 5의 프로브 또는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 포함하는 조성물; 또는 키트를 이용하여 PCR증폭산물을 수득 및 수득한 증폭산물을 분석하여 백미꽃속 식물의 종을 구별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법은 백미꽃 속 식물 개체로부터 분리된 시료를 이용하여 엽록체 DNA (cpDNA) 중 광계시스템 단백질 D1 (psbA)유전자 및 tRNA-His(trnH)유전자를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료는 특별히 이에 제한되는 않으나, 일 예로, 분리된 조직 또는 분리된 세포가 될 수 있다.

상기 백미꽃속 식물의 종을 구별하는 방법은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 내지 5의 프로브를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 상기 PCR은 멀티플렉스 PCR 이거나, Real time-PCR, 멀티플렉스 Real time-PCR을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 Real time-PCR 또는 멀티플렉스 Real time-PCR 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 멀티플렉스 Real time-PCR 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 PCR 수행은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, PCR 수행으로 인해 PCR 증폭 및 증폭산물을 분석하여 종을 판별하는 단계는 일련의 하나의 단계 또는 별개의 단계로 이루어 질 수 있으나, 바람직하게는 PCR 수행으로 인해 증폭 및 증폭산물을 분석하여 종을 판별하는 단계는 동시에 한번의 PCR 수행에 의해 이루어 질 수 있다.

상기 PCR 수행시 주형으로 사용되는 DNA는 백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum) 및 절관우피소(C. boudieri)로부터 유래된 각각의 개별식물로부터 분리된 DNA가 될 수도 있고, 상기 백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum) 및 절관우피소(C. boudieri)로부터 유래된 2 이상의 백미꽃 속 식물을 포함하는 혼합물질로부터 분리된 DNA가 될 수도 있다.

상기 증폭산물의 분석은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, 증폭된 DNA 단편에 종 특이적으로 결합되는 프로브를 검출하여 목적하는 DNA 마커가 검출되었는지 확인할 수 있다.

구체적인 방법으로 프로브에 결합된 방사성측정, 형광 측정 또는 인광측정을 통해 수행되는 것일 수 있다.

예를 들어, 증폭된 DNA 단편에 종 특이적으로 결합되는 프로브로 백수오(C. wilfordii) FAM 5'-CTAAAATTAGATTCTAAAATATTCTAAATATTC-3' BHQ1, 이엽우피소(C. auriculatum)ROX 5'- AATTTAAAAATTCAATACATTCAATTT -3' BHQ2 및 절관우피소(C. boudieri)JOE 5'- ATAAAATATTATATTCTAAAATATTCTAAACA-3' BHQ1를 제작하여, PCR 산물의 스펙트럼을 관측하여 FAM(~520nm)영역에서 관측되는 경우 백수오, JOE(~550nm)영역에서 관측되는 경우 절관우피소, ROX(~610nm)영역에서 관측되는 경우에는 이엽우피소가 포함된 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 프로브를 포함한 조성물을 이용하면, 1회의 멀티플렉스 Real time-PCR을 통해 별도의 PCR 증폭산물의 측정단계 없이도 백미꽃 속 식물의 구체적인 종을 간단하고 신속, 정확하게 판별할 수 있으므로, 품종 간 혼용을 방지하는 데 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 멀티플렉스 Real time-PCR에 사용된 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 각 식물에 특이적으로 결합하는 서열번호 3 내지 5의 프로브에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용한 PCR 산물의 겔 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 멀티플렉스 Real time-PCR을 이용하여 백수오, 이엽우피소, 절관우피소을 검출한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 재료 및 실험방법

1-1. 유전 물질 준비

백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum) 및 절관우피소(C. boudieri)의 DNA는 국립 식품 의약품 안전청에 의해 수집되었다.

백수오 샘플은 국내 시장과 옥천생약자원센터에서 수집되었다.

1-2. DNA 추출 및 PCR 증폭

식물 잎은 액체 질소로 동결시키고 미세 분말로 분쇄하였다. 게놈 DNA는 Genomic DNA 추출키트인 G-spin TM(iNtRON, Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 분리 추출하였다.

추출된 게놈 DNA에서 psbA-trnH 비암호화 영역을 증폭하기 위해 프라이머 세트 psbA3F (5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3') 및 trnHf_05 (5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3')를 사용하였다.

0.5μM의 각 프라이머, 20ng의 주형 DNA 및 10μl의 2X PCR 프리믹스 (Genotech, South Korea)로 이루어진 20μl 반응물로 PCR 증폭 하였다.

반응 프로필은 94℃에서 4분간의 예비변성(pre-denaturation); 이어서 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 35사이클; 72℃에서 5분간 최종 신장단계(final extension)를 거쳤다. 상기 PCR 생성물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기 영동으로 분리하였고 UV광 노출하에서 에티듐 브로마이드(EtBr)로 염색하여 검출 하였다.

1-3. 시퀀싱 및 DNA 서열 분석

PCR 산물은 시판중인 정제 키트 (GENEALL PCR SV, General Bio System)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 정제 하였다. 정제된 생성물은 Genotech, Inc.을 이용하여 서열을 분석하였다. 비암호화된 psbA-trnH 영역의 DNA 서열을 SeqMan 소프트웨어를 사용하여 정렬하고 BioEdit 프로그램 (Hall 1999)으로 편집하였다. 다중 서열 정렬은 ClustalW2 프로그램 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)을 사용하여 수행하였다.

1-4. 실시간 PCR(Real-time PCR)을 이용한 백미꽃 속 식물의 감별

상기 염기서열 데이터를 분석하여 백수오( C. wilfordii) , 이엽우피소(C. auriculatum )및 절관우피소(C. boudieri)의 DNA 서열을 동시 증폭할 수 있는 유니버셜 프라이머를 제작하였다. 또한, 상기 프라이머에 의해 제조되는 DNA 절편에 결합될 수 있는 각 식물의 특정영역을 기반으로 하는 프로브를 제작하였다.

또한, 해당 프로브는 각 식물의 특정 염기서열 영역인 올리고뉴클레오티드와 FAM, RoX 및 Applied Biosystems 7500에서 선택된 JOE 염료 표지 된 minor groove 결합제를 바인딩하여 제작하였다. 상기 프로브를 통해, 단일 PCR 반응에 의해 3개의 프로브를 동시에 주입하여 백미꽃 속 식물의 감별을 위해 멀티플렉스 Real time-PCR 을 준비하였다.

상기 PCR의 반응 혼합물은 각 프라이머 0.5μM, 각 probe 0.1μM, 주형 DNA 5μl 및 2X PowerAmpTM Real-time PCR Master MixⅡ(KogeneBiotech, 한국) 10 μl로 구성된 20μl 반응액에서 Real-time PCR 증폭을 수행하였다.

PCR 사이클링은 50℃에서 UDG 시스템 활성화 2 분; 이어서 95 ℃에서 10분의 1번의 예비변성(pre-denaturation); 이어서 95℃에서 15초, 53 ℃에서 1분으로 40 사이클로 Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR 장비 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.

실시예 2: 실험 결과 및 해석

2-1. psb A- trn H 영역의 시퀀싱을 통한 SNP 검출 및 각 식물별 유전자 마커

백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum) 및 절관우피소(C. boudieri)의 엽록체 DNA(cpDNA) 안의 Photosystem protein D1 (psbA) 유전자와 tRNA-His (trnH) 유전자의 염기 서열을 분석 하였다. 염기서열 데이터를 사용하여 백수오(C. wilfordii), 이엽우피소(C. auriculatum) 및 절관우피소(C. boudieri)의 단일뉴클레오티드다형성(SNP)을 확인할 수 있었고, 이 위치는 도 1에 표시하였다.

상기 세 식물의 SNP위치를 모두 포함할 수 있도록 유니버셜 프라이머를 설계하였고 이는 서열번호 1 및 2를 가지는 것으로 표 1에 표시하였다.

각 식물의 SNP위치를 포함하도록 백수오(C. wilfordii) FAM 5'-CTAAAATTAGATTCTAAAATATTCTAAATATTC-3' BHQ1, 이엽우피소(C. auriculatum)(ROX 5'- AATTTAAAAATTCAATACATTCAATTT -3' BHQ2) 및 절관우피소(C. boudieri)(JOE 5'- ATAAAATATTATATTCTAAAATATTCTAAACA-3' BHQ1) 특이적 프로브를 제작하였고, 각 식물의 특이적 프로브의 서열은 표 1의 서열번호 3 내지 5와 같다.

서열번호	Specificity	Nucleotide sequences (5'→3')	Location
서열번호 1	Universal forward primer	5'- GAAAGCAAATTCTAAATAAAATT-3'	191-213
서열번호 2	Universal reverse primer	5'- GAATATTTCAATTTAAAATTGCT-3'	321-343
서열번호 3	C. wilfordii	5'-CTAAAATTAGATTCTAAAATATTCTAAATATTC-3'	281-314
서열번호 4	C. auriculatum	5'- AATTTAAAAATTCAATACATTCAATTT -3'	215-250
서열번호 5	C. boudieri	5'- ATAAAATATTATATTCTAAAATATTCTAAACA-3'	266-300

2-2. 멀티플렉스 Real time-PCR 이용한 백미꽃 속 식물의 감별

백미꽃속 식물의 종을 감별하기 위하여 상기 표 1의 서열을 가지는 유니버셜 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 조성물을 넣고 멀티플렉스 Real time-PCR을 수행하였다. PCR 사이클링 조건은 표 2와 같은 조건에서 수행하였다.

Temp. (℃)	Time	Cycle
50	2 min	1
95	10 min	1
95	15 sec	40
53	1 min

멀티플렉스 Real time-PCR의 결과는 도 2 및 도 3에 도시하였다. 상기 결과로 볼 수 있듯이 백수오( C. wilfordii) , 이엽우피소(C. auriculatum )및 절관우피소(C. boudieri) 세 종류의 식물에 해당되는 각 피크를 한번의 PCR 수행으로 얻을 수 있었다(도 3).

또한, 백수오를 사용하여 실시간 PCR을 이용하여 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트인 유니버셜 프라이머로 psbA-trnH 영역의 특정 영역의 DNA단편을 증폭함을 확인하였다(도 2).

상기 결과로 볼 때, 각 식물의 특이적 프로브를 사용하여 멀티플렉스 Real time-PCR을 통해 한번의 PCR조작으로 3종의 식물을 감별할 수 있어 간편하고 정확하게 백미꽃속 식물의 종을 검출하는 방법임을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Composition for distinguishing a plant of genus Cynanchum <130> KPA181422-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaaagcaaat tctaaataaa att 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaatatttca atttaaaatt gct 23 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 ctaaaattag attctaaaat attctaaata ttc 33 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 aatttaaaaa ttcaatacat tcaattt 27 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 ataaaatatt atattctaaa atattctaaa ca 32

Claims (13)

1. 서열번호 3 내지 5의 프로브(probe); 및 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 포함하는, 멀티플렉스 실시간(Real time)-PCR용 백미꽃 속(Cynanchum genus) 식물의 종 구별용 조성물로,
   상기 백미꽃 속 식물은 백수오(Cynanchum wilfordii), 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 및 절관우피소(Cynanchum boudieri)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이고,
   상기 종 구별용 조성물은 DNA의 증폭과 동시에 식물의 종을 판별할 수 있는 것인, 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 백미꽃 속 식물의 종간에 특이적인 엽록체 DNA psbA-trnH 영역을 검출할 수 있는 것인, 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물.
   
3. 삭제
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5. 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질, 방사성물질 또는 인광물질로 표지 된 것인, 백미꽃 속 식물의 종 구별용 조성물.
   
6. 제 1항, 제 2항 및 제 5항 중 어느 하나의 조성물을 포함하는, 백미꽃 속 식물의 종 구별용 키트.
   
7. 백미꽃 속 식물의 개체로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 제 1항 의 조성물 또는 제6항의 키트를 이용하여 PCR 증폭산물을 수득 및 분석하여 백미꽃 속 식물의 종을 판별하는 단계를 포함하는, 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법으로,
   상기 백미꽃 속 식물은 백수오(Cynanchum wilfordii), 이엽우피소(Cynanchum auriculatum) 및 절관우피소(Cynanchum boudieri)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이고,
   상기 PCR은 멀티플렉스 실시간(Real time)-PCR인 것이며,
   상기 PCR은 단일 PCR에서 3개의 프로브를 이용하여 DNA의 증폭과 동시에 식물의 종을 판별할 수 있는 것인, 방법.
   
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12. 제 7항에 있어서, 상기 증폭산물의 분석은 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 백미꽃 속 식물의 종을 구별하는 방법.
    
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