KR101864858B1

KR101864858B1 - 중국당귀, 구당귀 및 일당귀 계통 판별용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101864858B1
Application number: KR1020170029013A
Authority: KR
Inventors: 이신우; 김윤희; 신용욱; 이수진
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2018-06-07

Abstract

본 발명은 중국당귀(Angelica sinensis oliv. Diels), 구당귀(Levisticum officinale) 및 일당귀(Angelica acutiloba Kitag) 계통 판별용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기한 본 발명은 SNP 마커 및 ARMS-PCR 기술을 이용하여, 국내에서 재배되거나 중국, 일본 등의 국외에서 수입되어 한약재 유통시장 등에서 수집되는 수많은 종류의 시료들에 대하여 편리하고 신속 정확하게 중국당귀(Angelica sinensis oliv. Diels), 구당귀(Levisticum officinale) 및 일당귀(Angelica acutiloba Kitag) 계통을 판별할 수 있다.

Description

중국당귀, 구당귀 및 일당귀 계통 판별용 조성물 및 이의 용도{Composition for the differentiation of Angelica sinensis oliv. Diels, Levisticum officinale and Angelica acutiloba Kitag lines and use thereof}

본 발명은 중국당귀(Angelica sinensis oliv. Diels), 구당귀(Levisticum officinale) 및 일당귀(Angelica acutiloba Kitag) 계통 판별용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 SNP 마커 및 ARMS-PCR 기술을 이용하여, 국내에서 재배되거나 중국, 일본 등의 국외에서 수입되어 한약재 유통시장 등에서 수집되는 수많은 종류의 시료들에 대하여 편리하고 신속 정확하게 당귀종의 계통을 판별할 수 있는 당귀 계통 판별용 조성물 및 이를 이용한 당귀 계통 판별 방법에 관한 것이다.

한국에서 호칭되는 당귀(Danggui)는 중국에서도 동일한 이름으로 호칭된다. 그러나 그 종의 기원은 달라 중국당귀는 Angelica sinensis, 일당귀는 Angelica acutiloba를 기원식물로 하고 있다. 실제로는 종이 다르기 때문에 내포하고 있는 기능성 화합물 즉 지표성분도 서로 다르고 그러므로 약효도 다르다. 그러나 식물체의 형태학적 성상이 상호 구분이 어렵고, 특히 부분적인 가공에 의한 말린 절편 또는 분말가루로 유통되기 때문에 혼오용이 심각하다(Yu 등, 2004; Bang 등, 2002).

또한, 당귀의 시료점수가 많고 유통량 또한 해마다 증가하며, 가공방법 또한 다양해져 가는 유통시장에서 신속하게 국내 토종인 참당귀 및 세발당귀와 외국종을 구분유통이 가능하도록 하여 유통질서를 확립할 필요가 있다.

최근, 약용작물을 포함한 다양한 식물종의 분자생물학적 구분에 관한 연구는 NGS(next generation sequencing) 기술 등의 염기서열분석 기술의 발달과 함께 급속도로 발전하고 있다. 특히 바코드(barcode) 기술을 이용한 종의 판별에 관한 기술은 기존의 형태학적 특성이나 성상으로는 구분이 어렵고 애매하여 혼오용이 심각한 한약재에 대한 종의 기원 판별에 큰 발전을 가져오게 하였다.

그러나 바코드(barcode) 기술을 한약재 유통시장에서 실용화하기에는 아직까지 해결하여야 할 많은 문제점을 내포하고 있다. 그 중에서도 가장 큰 문제는바코딩(barcoding) 기술 즉 종간에 나타나는 단일염기다형성을 비교하기 위하여서 모든 시료에 대하여 염기서열 분석을 수행하여야 하기 때문에 인력과 비용, 시간 등이 많이 소요될 수 있다. 따라서 단일염기다형성을 근거로 대립유전자만 선별적으로 증폭을 시키는 Allele-specific (AS)-PCR 기술, 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 기술 등을 적용하여 비교적 간단한 실험과정으로 신속하면서도 신뢰도가 높은 새로운 기술들이 보고되고 있으나 아직도 실용화가 잘 이루어지고 있지 않다.

자연 상태에서 특정 종에만 내재하는 단일염기다형성을 사용한 Allele-specific (AS)-PCR의 실용화에도 다음과 같은 문제점이 있다. 첫째, 아주 유사한 종 사이에는 단일염기다형성이 많지 않아 종 특이판별용 프라이머의 제작이 어렵고 둘째, 하나 또는 두 개의 제한된 수의 단일염기다형성을 사용하여 종 특이 판별용 프라이머를 제작한 경우에 대립유전자간의 미스매칭(mismatching) 강도에 따라 목표로 하는 대립유전자 단편만 정확하게 증폭시키지 않고, 상대적으로 미스매칭(mismatching)된 상태의 대립유전자 단편도 동일하게 증폭을 시키기 때문에 실용화하기에는 부적합할 경우가 많다.

본 발명의 배경기술로 대한민국 공개특허 제10-2007-0001401호에는 당귀의 종간 유전자 감별 키트가 개시되어 있다.

본 발명에서는 이들 선행 연구결과들의 단점을 보완한 SNP 마커 및 ARMS-PCR 기술을 적용하여 ITS 영역의 단일염기다형성에 근거한 다양한 종류의 프라이머 세트를 제작하고 그 중에서 가장 우수한 중국당귀, 일당귀, 구당귀의 판별용 조성물을 개발하고자 하였다.

즉 단일염기다형성을 나타내는 염기를 정방향 또는 역방향 프라이머의 3′-말단에 위치하게 하고 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 다른 3가지의 염기로 임의로 변경시켜 또 다른 하나의 미스매칭(mismatching) 염기를 추가하여 PCR 반응 시 프라이머와 주형가닥의 어닐링(annealing)과 뉴클레오타이드 사슬의 연장반응에 정확도를 높이는 기술을 도입하여 가장 우수한 마커 조합을 선발하도록 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 단일염기다형성(SNP) 마커 및 이에 기초하여 제작된 프라이머 세트를 포함하는 중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 의한 중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통 판별용 조성물을 포함하는 중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신속하고 정확하게 중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통을 판별할 수 있는 중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 112번째 염기는 G 또는 C이고, 상기 112번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 642번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 642번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 중국당귀 계통 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 100번째 염기는 T 또는 C이고, 상기 100번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 536번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 536번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 중 1 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 구당귀 계통 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 당귀 계통 판별용 조성물을 포함하는, 당귀 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하며, 중국당귀 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하며, 구당귀 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 15 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 16 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 중 적어도 1 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 일당귀 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 기재된 조성물을 포함하는, 당귀 계통 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 112번째 염기가 C인 경우; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 642번째 염기가 T인 경우; 중 적어도 하나인 경우, 중국당귀 계통으로 판별하는 단계;를 포함하는, 당귀 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 100번째 염기가 C인 경우; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 536번째 염기가 T인 경우; 중 적어도 하나인 경우, 구당귀 계통으로 판별하는 단계;를 포함하는, 당귀 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하여 중국당귀 여부를 판별하는 단계를 포함하는, 당귀 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하여 구당귀 여부를 판별하는 단계를 포함하는, 당귀 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 15 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 16 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 중 적어도 1 이상의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및 전기영동의 결과를 분석하여 일당귀 여부를 판별하는 단계를 포함하는, 당귀 계통 판별 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 중국 및 일본 등에서 한약재 또는 건강기능식품으로 수입되는 중국당귀, 일당귀, 또는 구당귀에 대한 종의 기원을 정확하고 신속하게 판별할 수 있는 조성물을 제공하여, 국내 자생 당귀인 참당귀 또는 세발당귀와의 구분 유통을 가능하게 할 것이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 기존의 단일염기다형성의 차이를 근거로 제작한 판별의 정확도를 보완한 일당귀 판별용 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 제공할 수 있다. 따라서 유통시장 또는 재배현장에서 수집되는 수많은 시료에 대하여 개별적으로 염기서열분석을 수행하여 비교할 필요가 없고 비교적 간단하고 신속한 PCR 실험을 통하여 판별이 가능할 것이다. 나아가, 혼재된 당귀의 종의 정성은 물론 혼합비율까지도 분석이 가능할 것이며, 형광 염기 등을 사용한 자동분석시스템의 도입으로 보다 효율적이고 과학적인 당귀 종의 유통질서를 확립할 수 있다.

도 1은 참당귀(A. gigas), 세발당귀(A. gigas. Jiri), 일당귀(A. acutiloba), 중국당귀(A. sinensis), 구당귀(L. officinale)의 핵 내 ribosomal rDNA 단편의 염기서열 비교 분석 결과를 나타내는 도면이다. 일당귀(acutiloba), 구당귀(officinale) 및 중국당귀(sinensis)의 판별용 정방향 및 역방향 프라이머의 위치를 각각 표시하였다. ITS I, 5.8S rDNA, ITS II 영역을 각각 다른 색 상자로 표시하였다.
도 2는 중국당귀와 구당귀의 판별용 프라이머 세트를 사용한 PCR 결과를 나타내는 사진이다. 염기서열비교분석 결과 중국당귀 또는 구당귀에만 유일하게 단일염기다형성으로 확인된 염기를 정방향 및 역방향 프라이머의 3′-말단에 위치하도록 하여 디자인한 프라이머를 사용한 PCR 결과이다(표 2 및 표 3 참조). M, 분자 크기; 1, 세발당귀; 2, 참당귀; 3, 일당귀; 4, 중국당귀; 5, 구당귀.
도 3은 일당귀의 SNP 또는 ARMS-PCR용 프라이머 세트(표 4 참조)를 이용한 PCR 결과를 나타낸 사진이다. SNP용 프라이머 세트는 일당귀에 내재하는 단일염기다형성을 각각 정방향과 역방향의 3′-말단에 위치하도록 하여 제작한 프라이머, 그리고 (A), (T), (C)는 3′-말단에 인접한 세 번째 염기서열을 해당하는 염기로 변경하여 만든 ARMS-PCR용 프라이머 세트를 사용한 결과를 나타낸 사진이다. 1, 세발당귀; 2, 참당귀; 3, 일당귀; 4, 중국당귀; 5, 구당귀.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 의한 상기 SNP 마커를 포함하는 당귀 계통 판별용 조성물을 이용하여 중국당귀 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 1).

본 발명에 의한 상기 SNP 마커를 포함하는 당귀 계통 판별용 조성물을 이용하여 구당귀 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 1).

본 발명에 있어 상기 키트는 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 RT-PCR 키트, 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 당귀 계통 판별용 마이크로어레이 키트일 수 있다.

본 발명에 있어 마이크로어레이란 기판상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명에서는 상기 SNP를 확인한 후 상기 SNP에 이웃하고 있는 2, 또는 3번째의 염기를 변경하여 미스매치 프라이머(mismatch primer)를 제작하여 PCR 반응과정에서 특이성을 증대시킨 ARMS-PCR(amplification refractory mutation system-PCR) 기술을 적용하여 판별력의 정확도를 더욱 높였다(Han 등, Mol Biol Rep (2016) 43:323332). 상기 당귀 계통 판별용 조성물을 이용하여 일당귀 계통을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다(도 3).

본 발명에 있어서, 상기 대상 시료로부터 핵산을 분리하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA 및 RNA 분자도 포함하는 의미이다. 대상 시료로부터 DNA를 추출하는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 염기서열을 분석하는 단계는 특정서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelsteinet al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립유전자-특이적 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정할 수 있다.

서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 생성된 PCR 산물을 전기영동한 결과 중국당귀만 577bp의 밴드가 선명하게 생성되어 중국당귀라고 판별할 수 있으나, 참당귀, 세발당귀, 일당귀, 및 구당귀는 상기 밴드를 생성하지 않은 것으로 나타났다(도 2의 우측).

서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 생성된 PCR 산물을 전기영동한 결과 구당귀만 480bp의 단일밴드가 선명하게 생성되어 중국당귀라고 판별할 수 있으나, 참당귀, 세발당귀, 일당귀, 및 구당귀는 상기 밴드를 생성하지 않은 것으로 나타났다(도 2의 우측).

서열번호 15 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 16 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 17 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 생성된 PCR 산물을 전기영동한 결과 일당귀의 경우에만 단일 밴드가 생성되므로 일당귀 판별에 이용할 수 있다(도 3)

< 실시예 >

시료

하기 실험에서 사용한 당귀 종은 국내외에서 수집한 것으로 중국당귀는 중국에서 수입되는 건뿌리를 수집하였으며, 일당귀는 경남농업기술원 약용자원연구소, 그리고 구당귀로 호칭되고 있는 Levisticum officinale는 미국의 종자회사인 Horizon Herbs (Williams, OR, USA)에서 수집한 것 공시재료로 하였다. 또한, 외국에서 수입되는 이들에 대한 대조구로 세발당귀는 경남 산청군의 재배단지(산청군)그리고 참당귀는 경남농업기술원 약용자원연구소에서 수집하였다. 표 1은 수집 및 보관중인 당귀 계통 현황을 나타낸다.

수집종에 대한 게놈 DNA 분리

수집된 계통별로 일정량의 줄기, 뿌리, 잎 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll사의 Exgene^TM Plant SV 키트를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리과정에서의 분해 정도를 확인한 후 Micro-spectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 234nm, 260nm, 280nm에서 각각 흡광도를 측정하여 A₂₆₀/A₂₈₀ 값이 1.8-2.2 범위 그리고 A₂₃₄/A₂₆₀ 값이 0.5-0.8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염정도를 확인하여 순수한 DNA를 확보하였다.

실시예 1. 5종의 당귀에 대한 핵 내 ribosomal DNA( rDNA ) 단편의 염기서열 비교분석 통한 SNP 마커 개발

표 1에서 공시한 당귀 계통별 시료의 잎 또는 건뿌리 등으로부터 게놈 DNA를 분리한 후 핵 내에 존재하는 ribosomal DNA의 ITS(internal transcribed spacer)의 염기서열을 비교분석하기 위하여 기존에 알려진 프라이머 세트(Forward, 5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′(서열번호 7); Reverse,5′- GCCGTTACTAGGGGAATCCTTG-3′(서열번호 8))를 이용하여 rDNA 단편을 증폭한 후 염기서열분석을 하여 상호 비교분석한 결과를 도 2에 나타내었다.

약 800 bp에 해당하는 염기서열을 비교분석한 결과 중국당귀, 일당귀는 같은 속이지만 종이 다르므로 국내 토종으로 알려진 참당귀 및 세발당귀와는 ITS I 및 ITS II 영역에서 많은 염기의 치환과 결실 등에 의한 단일염기다형성을 보였다. 특히 속이 다른 구당귀와는 더 많은 차이를 나타내었다(도 1 참조). 도 1의 염기서열 비교분석결과 즉 112번째 염기가 중국당귀만 유일하게 C로 다른 4종의 G와는 차이를 나타내고, 642번째의 염기는 다른 4종이 C인 반면에 중국당귀만 T를 나타났다. 또한, 도 1을 참조하면 100번째 염기는 구당귀만 "C"로 다른 4종의 "T"와는 차이를 나타내고, 536번째의 염기는 구당귀만 "T"로 다른 4종이 "C"와 차이를 나타냈다.

실시예 2. 중국당귀의 핵 내 ITS 유전자를 이용한 PCR 프라이머 세트 개발

중국에서 건재 한약재 또는 건강식품 등으로 수입되는 중국당귀의 판별마커를 개발하기 위하여, 도 1의 염기서열 비교분석결과 다른 4종의 당귀 종들과 단일염기다형성을 보이는 위치에서 정방향 및 역방향 프라이머를 제작하도록 하였다. 즉 112번째 염기가 중국당귀만 유일하게 C로 다른 4종의 G와는 차이를 나타내어 정방향 프라이머의 3′-말단에 위치하도록 디자인하였으며, 마찬가지로 642번째의 염기가 다른 4종은 C인 반면에 중국당귀만 T를 나타내어 이를 역방향의 3′-말단에 위치하도록 하여 프라이머를 제작하여 각각 sinensis_ITS_SNP_F와 sinensis_ITS_SNP_R로 명명하였다(표 2 참조). 표 2는 중국당귀의 판별용 ITS 마커 염기서열 정보를 나타낸다.

상기한 프라이머를 사용하여 국내외서 수집한 당귀종으로부터 분리한 DNA를 사용하여 다음과 같이 핵산증폭실험을 수행하였다. iNtRON사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하였으며, 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA 50 ng과 프라이머를 각각 10 pmole을 혼합 한 후 94℃에서 5분간 DNA를 변성 시킨 후 94℃에서 30초, 그리고 주어진 Tm값의 온도에서 10초, 72℃에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 마지막으로 72℃에서 5분간 연장반응을 시킨 다음 4℃에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 2.0% agarose gel을 이용하여 전기 영동하여 그 결과를 확인하였다(도 2 참조). 대조구로 사용한 다른 당귀종 즉 국내 토종으로 알려진 참당귀 및 세발당귀, 일당귀 그리고 속이 다른 구당귀에는 DNA가 증폭되지 않았으나 중국당귀에만 예상한 크기(577 bp)의 DNA가 증폭됨을 확인하여 표 2에서 제시한 프라이머 세트는 중국당귀의 판별용 마커로 사용할 수 있다는 결론을 얻었다.

실시예 3. 구당귀의 핵 내 ITS 유전자를 이용한 PCR 프라이머 세트 개발

구당귀의 판별마커용 프라이머는 속이 다르기 때문에 Angelica 속에 속하는 참당귀, 중국당귀, 일당귀와는 많은 단일염기다형성을 보여 상대적으로 용이하게 프라이머를 디자인할 수 있었다. 즉 정방향은 100번째 염기인 C그리고 역방향은 536번째 염기인 T를 3′-말단에 위치하도록 하여 각각의 프라이머를 제작하여 각각 officinale_ITS_SNP_F와 officinale_ITS_SNP_R로 명명하였다 (표 3 참조). 표 3은 구당귀(Levisticum officinale)의 판별용 ITS 마커 염기서열 정보를 나타낸다.

상기한 프라이머를 사용하여 주어진 Tm값을 어닐링(annealing) 온도로 하여 PCR을 수행한 결과 도 2에서 보는 바와 같이 구당귀의 게놈 DNA를 사용한 경우에만 정확하게 예상한 크기(480 bp)의 단일 밴드를 생산하여 다른 4종의 당귀와 구분하기 위한 판별마커로 사용하기에 충분하다는 결론을 얻었다.

실시예 4. 일당귀의 핵 내 ITS 유전자를 이용한 PCR용 프라이머 세트 개발

일당귀의 경우에도 도 2의 염기서열 비교 분석 결과로부터 일당귀에만 나타나는 단일염기다형성을 확인하여 정방향은 92번 염기(T), 그리고 역방향은 592번째 염기(C)를 각각의 3′-말단에 위치하도록 하여 프라이머를 제작하여 각각 acutiloba_ITS_SNP_F와 acutiloba_ITS_SNP_R로 명명하였다(표 4 참조). 표 4는 일당귀의 판별용 ITS 유전자의 SNP 및 ARMS PCR용 프라이머 세트 염기서열 정보를 나타낸다.

상기한 프라이머 즉 정방향과 역방향 프라이머의 3′-말단에 단일염기다형성을 포함하는 프라이머 acutiloba_ITS_SNA_F (Accession No. 603)과 acutiloba_ITS_SNA_R (604)을 사용하여 PCR 반응을 수행한 결과 도 3에 나타난 바와 같이 일당귀뿐만 아니라 국내 토종인 참당귀와 세발당귀 그리고 구당귀에서도 동일한 크기의 강한 DNA 밴드가 확인되는 결과를 얻었다.

일당귀의 경우에는 정방향과 역방향 프라이머의 3′-말단에 공히 각각의 단일염기다형성을 포함하고 있음에도 불구하고 종의 특이성이 낮아 판별 마커로 사용할 수 없는 결과를 얻었으며 이러한 현상은 기존의 다른 연구결과에서 이미 지적한 바와 같이 단일염기다형성의 실용화의 걸림돌이 되고 있다.

따라서 각각의 3′-말단에서 5′-말단 쪽으로 세 번째 염기를 다른 3종류의 염기로 변경시킨 ARMS-프라이머를 제작하여 가장 우수한 마커를 개발하고자 하였다. 표 4에서 각각의 세 번째 염기를 A로 변경한 609번과 612번 조합(서열번호 15 및 18),T로 변경한 610번과 613번 조합(서열번호 16 및 19), 그리고 C로 변경한 611번과 614번 조합(서열번호 17 및 20)을 사용하여 각각 PCR 반응을 수행한 결과 T 또는 C로 변경한 조합에서 일당귀에만 선명하게 밴드를 확인할 수 있어 이들을 판별 마커로 사용할 수 있다는 결론을 얻었다(도 3 참조). A로 변경한 경우에도 그 효과는 인정할 수 있었으나 세발당귀 및 참당귀에서 약한 밴드가 확인되었다.

<110> GYEONGNAM NATIONAL UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for the differentiation of Angelica sinensis oliv. Diels and Angelica acutiloba Kitag lines and use thereof <130> NPF30836 <160> 20 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 599 <212> DNA <213> Angelica kangdingensis <400> 1 tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa aaatttgggc gagcgtcggg 60 aggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actcccgggt ggccactggc 120 ctacaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggaactta aaactgaatt gtacgtctgt 180 atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaacacaacg actctcgaca acggatatct 240 cggctctcgc atcgatgaag aacgtagcga aatgcgatac ttggtgtgaa ttgcagaatc 300 ccgtgaacca tcgagtcttt gaacgcaagt tgcgcccgaa gccacttggc tgagggcacg 360 cctgcctggg tgtcacgcat cgtattgccc acaaaccact cacacctgag aaggtgtgcc 420 ggtttggggc ggaaattggc ctcccgtacc ttgtcgtgcg gttggcggaa aaacgagtct 480 ccggcgatgg acgtcgcgac atcggtggtt gtaaaagacc ctcttgtctt gtcgcgcgaa 540 tcctcgtcat cttagcgagc tccaggaccc ttaggcagca catactctgt gcgcttcga 599 <210> 2 <211> 641 <212> DNA <213> Angelica gigas <400> 2 aaatgacccg ctaacacgtt aacaatttgg gcgagcgtcg gggggcctcg gtctcctgtc 60 tgcgaatccc tggtaggtgg ccactctcgg gtggccactg gcctgcaaaa tcattcgggc 120 gcggaatgcg ccaaggacct taaaactgaa ttgtacgtcc gtatcccgtt agcgggcacc 180 ggcgtcattc caaaatacaa cgactctcga caacggatat ctcggctctc gcatcgatga 240 agaacgtagc gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct 300 ttgaacgcaa gttgcgcccg aagccactag gctgagggca cgcctgcctg ggtgtcacgc 360 atcgtattgc ccacagacca ctcacacctg agaagttgtg ccggtttggg gcgcaaattg 420 gcctcccgta ccttgtcgtg cggttggcgg aaaaacgagt ctccggcgac ggacgtcgcg 480 acatcggtgg ttgtgaaaga ccctcttgtc ttgtcgcgcg aatcctcgtc atcttagcga 540 gctccaggac ccttaggcag cacacactct gtgcgcttcg actgtgaccc caggtcaggc 600 gggactaccc gctgagttta agcatatcaa taagcggagg a 641 <210> 3 <211> 639 <212> DNA <213> Angelica gigas Jiri <400> 3 atgacccgct aacacgttaa caatttgggc gagcgtcggg gggcctcggt ctcctgtctg 60 cgaatccttg gtaggtggcc actctcgggt ggccactggc ctgcaaaatc attcgggcgc 120 ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttag cgggcaccgg 180 cgtcattcca aaatacaacg actctcgaca acggatatct cggctctcgc atcgatgaag 240 aacgtagcga aatgcgatac ttggtgtgaa ttgcagaatc ccgtgaacca tcgagtcttt 300 gaacgcaagt tgcgcccgaa gccactaggc tgagggcacg cctgcctggg tgtcacgcat 360 cgtattgccc acagaccact cacacctgag aagttgtgcc ggtttggggc gcaaattggc 420 ctcccgtacc ttgttgtgcg gttggcggaa aaacgagtct ccggcgacgg acgtcgcgac 480 atcggtggtt gtgaaagacc ctcttgtctt gtcgcgcgaa tcctcgtcat cttagcgagc 540 tccaggaccc ttaggcagca cacactctgt gcgcttcgac tgtgacccca ggtcaggcgg 600 gactacccgc tgagtttaag catatcaata agcggagga 639 <210> 4 <211> 599 <212> DNA <213> Angelica acutiloba <400> 4 tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgtcaa cattttgggc gagcgtcggg 60 gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actcccgggt ggccactggc 120 ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180 atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaacacaacg actctcgaca acggatatct 240 cggctctcgc atcgatgaag aacgtagcga aatgcgatac ttggtgtgaa ttgcagaatc 300 ccgtgaacca tcgagtcttt gaacgcaagt tgcgcccgaa gccactaggc tgagggcacg 360 cctgcctggg tgtcacgcat cgtcttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgcc 420 ggtttggggc ggaaactggc ctcccgtacc ttgtcgtgcg gttggcggaa aaacgagtct 480 ccggcgacgg acgtcgcgac atcggtggtt gtaaaagacc ctcttgtctt gtcgtgcgaa 540 tcctcgtcat cttagcgagc tccaggaccc ttaggcagca cacactctgt gcgcttcga 599 <210> 5 <211> 714 <212> DNA <213> Angelica sinensis <400> 5 cgaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attgtcgaat 60 cctgcgatag cagaacgacc cgctaacatg taaacatatt gggcaagtgt tcgggggctt 120 tggtcccttg tatgcgaacc ctggtaggtg gcccctctcg ggtggccact ggcctgcgaa 180 atcattcggg cgcggaatgc gccaaggaac ttaaaattga attgtacgtc ggcatcccgt 240 tagcgggcat cgacgtcatt ccaaaacaca acgactctcg acaacggata tctcggctct 300 cgcatcgatg aagaacgtag cgaaatgcga tacttggtgt gaattgcaga atcccgtgaa 360 ccatcgagtc tttgaacgca agttgcgccc gaagccatta ggctgagggc acgtctgcct 420 gggtgtcacg catcatcttt gcccacaacc actcactcct cgtggagctg tactggtatg 480 ggggcggaaa ttggcctccc gtgccttgtt gtgcggttgg cgcaaaagtg agtctccggc 540 gacggacgtc gtgacattgg tggttgtaaa ataccctcat gtcttgtcgc gcgaatccgc 600 gtcatcttag tgagctcaag gacccttagg cggcacacac tttgtgcact tcgaatgtga 660 ccccaggtca ggcgggacta cccgctgagt ttaagcatat caataagcgg agga 714 <210> 6 <211> 635 <212> DNA <213> Levisticum officinale <400> 6 acgacccgct aacatgtaaa cacgtcgggc aagcatcggg ggcctttggt cccttgtttg 60 cgaaccctgg taggtggtcc ctctcaagtg gccatcggcc tgcgaaatca tttgggcgcg 120 gaatgcgcca aggaacttaa aattgaattg tatgtctgca tcccgttagt gggtagcggc 180 gtcattccaa aatacaatga ctctcgacaa cggatatctc ggctctcgca tcgatgaaga 240 acgtagcgaa atgcgatact tggtgtgaat tgcagaatcc cgtgaaccat cgagtctttg 300 aacgcaagtt gcgcccgaag ccactaggct gagggcacgt ctgcctgggt gtcacgcatc 360 atctttgccc acaaccactc actcctcgag gagctgtgct gggttggggg cggaatttgg 420 cctcccgtgc cttgttgtgc ggttggcgca aaagtgagtc ttcggcgatg gatgtcgtga 480 tattggtggt tttaaaagac cctcatgtct tgtcgcgcga atccgcgtca tcttagtgag 540 ctctaggacc cttaggtggc acagactctg tgtgcttcga ctgtgacccc aggtcaggcg 600 ggactacccg ctgagtttaa gcatatcaat aagcg 635 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gccgttacta ggggaatcct tg 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catgtaaaca tattgggcaa gtgttc 26 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gggtcacatt cgaagtgcac aa 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acccgctaac atgtaaacac gtc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atatcacgac atccatcgcc ga 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aatgacccgc taacacgtc 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctaagatga cgaggattcg ca 22 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aatgacccgc taacacatc 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aatgacccgc taacacttc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aatgacccgc taacacctc 19 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctaagatga cgaggattca ca 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gctaagatga cgaggattct ca 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gctaagatga cgaggattcc ca 22

Claims

서열번호 5로 표시되는 염기서열의 112번째 염기는 G 또는 C이고, 상기 112번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 642번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 642번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 100번째 염기는 T 또는 C이고, 상기 100번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
서열번호 5로 표시되는 염기서열의 536번째 염기는 C 또는 T이고, 상기 536번째 염기를 포함하고, 서열번호 5의 5 내지 200 염기의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하며,
상기 제제는 서열번호 15 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 16 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 17 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 더 포함하고,
중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 ITS(intergenic transcribed spacer) 유전자에서 유래된, 당귀 계통 판별용 조성물.
제1항 기재의 조성물을 포함하는, 당귀 계통 판별용 키트.
제1항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하며, 중국당귀 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 더 포함하며, 구당귀 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별용 조성물.
삭제
제5항 또는 제6항에 기재된 조성물을 포함하는, 당귀 계통 판별용 키트.
당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
상기 분리된 핵산을 주형으로 하고,
서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 15 및 18의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 16 및 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 17 및 20의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR 산의 염기서열을 분석하는 단계;
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 112번째 염기가 C인 경우; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 642번째 염기가 T인 경우, 중국당귀 계통으로 판별하는 단계;
상기 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 100번째 염기가 C인 경우; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 536번째 염기가 T인 경우, 구당귀 계통으로 판별하는 단계;
상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및
전기영동의 결과를 분석하여 일당귀 여부를 판별하는 단계를 포함하며, 중국당귀, 구당귀, 및 일당귀 계통 여부를 판별할 수 있는, 당귀 계통 판별 방법.
삭제
제9항에 있어서,
당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및
전기영동의 결과를 분석하여 중국당귀 여부를 판별하는 단계를 더 포함하는, 당귀 계통 판별 방법.
제9항에 있어서,
당귀 시료로부터 핵산을 분리하는 단계;
상기 분리된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
상기 PCR 산물을 이용하여 전기영동을 수행하는 단계; 및
전기영동의 결과를 분석하여 구당귀 여부를 판별하는 단계를 더 포함하는, 당귀 계통 판별 방법.
삭제