KR101668515B1 - 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 다형성 분자 마커 및 이를 이용한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 구별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 분자 마커, 상기 다형성 분자 마커를 이용한 키트, 상기 다형성 분자 마커를 위한 프라이머 쌍 및 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 식별 방법에 관한 것으로, 본 발명을 이용하여 육안으로 감별하기 어려운 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 각각에 대하여 보다 정확하고 신속하게 종감별 하는 것이 가능하다.
Description
본 발명은 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 분자 마커, 상기 다형성 분자 마커를 이용한 키트, 상기 다형성 분자 마커를 위한 프라이머 쌍 및 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 식별 방법에 관한 것이다.
당귀는 국내에서 널리 사용되는 대표적인 한약재로서 신체허약, 관절통, 두통, 변비, 타박상 등 다양한 증상에 처방되고 있다. 당귀의 기원식물은 한국, 중국, 일본에서 자생하고 있으며 국내에서는 정선, 홍천, 제천, 봉화, 산청 및 함양 등에서 약용 식물로 재배되고 있다.
[대한민국약전]에 생약 당귀 (Angelicae Gigantis Radix)는 "참당귀 Angelica gigas Nakai (산형과 Umbelliferae)의 뿌리"로 정의되어 있다. 반면, [일본약국방]에서는 일당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa)를 기원식물로 정하고 있으며, [중국약전]에서는 중국당귀 (Angelica sinensis Oliv.)를 기원식물로 정립하고 있다. 이처럼 한국, 일본, 중국에서 규정하고 있는 당귀의 기원식물이 상이할 뿐만 아니라, 각국에서 다른 용도로 이용하고 내용성분에서도 차이를 나타내므로 객관적인 감별을 통한 유통, 품질 관리가 필수적이다.
전통적으로 한약재의 감별은 주로 외부 형태와 내부 해부학적 특징 및 이화학적 분석에 의존하여 왔다. 그러나 생육 환경에 따라 형태 및 대사물질에서 차이를 보일 수 있으나, 건조된 절편 및 가루 형태 유통품의 경우에는 형태학적 분석이 거의 불가능하다. 또한 성분분석 비교에 의한 약재 구분을 위해 미각센서 (Choi et al., 2011), NMR spectrometer (Yang et al., 2010) 등이 이용되었으나, 이 방법은 생산지의 재배환경에 따라 약재성분이 영향을 받을 수 있다는 한계가 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al., 1990), Sequence Characterized Amplified Regions (SCAR) (Wang et al., 2001; Choi et al., 2008), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (Ha et al., 2002) 등 DNA 단편의 다형성을 이용한 분자생물학적 식물 종감별이 시도되고 있을 뿐만 아니라, 또한 최근에는, 한약재 판별에 있어서 CBOL Plant Working Group이 제안한 DNA 바코드를 이용한 분류법이 그 유용성을 인정받고 있다 (CBOL Plnat Working Group, 2009). 특히 게놈 상에 존재하는 핵 리보솜 DNA 유전자 (Nuclear Ribosomal DNA gene, nrDNA)의 nrDNA-ITS (Internal transcribed spacer)부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라, 일반성, 단순성, 재현성 등의 이점으로 인해 계통분류나 종간 유전변이 탐색 등을 위해 널리 이용되는 염기서열로 알려져 있다 (Chen et al., 2010; Kim et al., 2005; Lee et al., 2010).
본 발명은 한약재 자원으로 사용, 유통되고 있는 참당귀 (Angelica gigas Nakai), 일당귀 (Angelica acutiloba Kitagawa) 및 중국당귀 (Angelica sinensis Oliv.)를 대상으로 ITS 지역에 존재하는 유전자 염기서열의 종간 다형성에 기인한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 분자마커를 제공한다. 또한 이를 이용하여 혼재된 약재 시료에서 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 확인할 수 있는 종감별법을 제공한다.
본 발명은 핵 리보솜 DNA의 ITS 지역에 해당하는 염기서열에서 다형을 확인하여, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 다형성 마커를 제공할 수 있다.
구체적으로, 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기 및 74 번째 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 다형성 분자 마커가 제공될 수 있으며, 이러한 다형성 분자 마커는 10 내지 100 개의 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어질 수 있다.
다형성 분자 마커의 실시예로서, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4 의 염기서열을 갖는 다형성 분자 마커가 제공될 수 있으며, 그 외에도 상기 ITS 지역의 54 번째 염기는 T, 59 번째 염기는 A, 및 230 번째 염기는 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 참당귀의 단일염기다형성을 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 참당귀를 구별하기 위한 다형성 분자 마커가 제공될 수 있다.
또한, 상기 ITS 지역의 54 번째 염기가 C인, 일당귀의 단일염기다형성을 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 일당귀를 구별하기 위한 다형성 분자 마커가 제공될 수 있다.
그 밖에도 본 발명은, 상기 ITS 지역의 54 번째 염기는 A, 60 번째 염기는 A, 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T 및 74 번째 염기는 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중국당귀의 단일염기다형성을 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 중국당귀를 구별하기 위한 다형성 분자 마커를 제공할 수 있다.
또한 본 발명에서는 상기 다형성 분자 마커를 포함하는, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 키트를 제공할 수 있다.
또한 본 발명에서는 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하는 방법은, 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 비교하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하는 방법은, 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 상기 증폭 산물과 상기 다형성 분자마커 조성물을 혼합하여, 상기 증폭산물과 상기 다형성 분자마커를 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 정도를 검출하여 상기 시료를 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 중 어느 하나로 감별하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 다형성 유전자의 염기서열에 기인하여, 54 번째 염기는 T, 59 번째 염기는 A, 또는 230 번째 염기가 T로 확인되는 경우, 참당귀로 감별할 수 있는 반면, 54 번째 염기가 C로 확인되는 경우에는 일당귀로 감별할 수 있다. 또한 54 번째 염기는 A, 59 번째 염기는 T, 60 번째 염기는 A, 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T, 또는 74 번째 염기는 C로 확인되는 경우에는, 중국당귀로 감별할 수 있다.
본 발명에 의하면, 혼오용이 우려되는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 각각에 대한 종감별이 가능한 다형성 분자 마커를 이용하여 감별할 수 있으며, 이는 기존의 방법들에 비하여 감도 및 정확성을 대폭 향상시킬 수 있다. 또한, 육안으로 감별하기 어려운 약재들이 혼재된 대량 시료에서 이들 분자 마커를 동시처리하여 감별하는 것이 가능하다.
도 1은 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 수집 시료의 ITS 지역의 DNA를 비교하여 나타낸 염기서열에 대한 실시예로서, 서열번호 2, 3, 4 인 분자 마커의 위치 및 서열번호 5, 6 인 프라이머의 위치이다.
도 2는 수집시료 번호 01, 06, 07번 시료 및 JX022913 (accession number) 염기서열이다.
도 3은 수집시료 번호 03, 05번 시료와 AB697596 (accession number)의 염기서열이다.
도 4는 수집시료 번호 04번 시료와 JX022936 (accession number)의 염기서열이다.
도 5는 DGC_Pb02_RC_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 참당귀 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 6은 DGI_pb_02_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 일당귀 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 7은 DGJ_pb_01_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 중국당귀 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 2는 수집시료 번호 01, 06, 07번 시료 및 JX022913 (accession number) 염기서열이다.
도 3은 수집시료 번호 03, 05번 시료와 AB697596 (accession number)의 염기서열이다.
도 4는 수집시료 번호 04번 시료와 JX022936 (accession number)의 염기서열이다.
도 5는 DGC_Pb02_RC_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 참당귀 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 6은 DGI_pb_02_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 일당귀 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
도 7은 DGJ_pb_01_FAM 형광 분자마커를 이용한 RT-PCR 사이클 수에 따른 중국당귀 기원식물의 형광값 검출을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 참고예 및 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 하기의 실시예에서 확인되는 바와 같이 수집된 약재들의 ITS 서열을 증폭하여 그 서열을 결정한 후, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 다형성을 보이는 부분(single nucleotide polymorphic site, 동일 종의 각 개체 사이에서는 서열이 보존되어 있어 동일한 염기 타입의 뉴클레오티드를 나타내지만, 종을 달리한 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 사이에서는 서로 염기 타입이 다른 뉴클레오티드를 나타내는 부분을 말한다)을 비교 분석한 결과(도 1 참조), 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기, 및 230 번째 염기가 다형성 염기인 것으로 나타났다.
참당귀, 일당귀 및 중국당귀 각각의 해당 다형성 염기는 하기의 표 1과 같다.
| ITS 내 SNP 위치 | 참당귀 | 일당귀 | 중국당귀 |
| 54 | T | C | A |
| 59 | A | T | T |
| 60 | T | T | A |
| 67 | G | G | A |
| 70 | C | C | T |
| 73 | C | C | T |
| 74 | G | G | C |
| 230 | T | C | C |
본 발명의 다형성 분자 마커는, 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기 및 74 번째 염기의 단일염기다형성을 포함하는 염기로 이루어진 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 것으로서, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하는데 이용될 수 있다. 표 1을 참고하면, 본 발명은, 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기는 T, 59 번째 염기는 A, 및 230 번째 염기는 T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 참당귀의 단일염기다형성을 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는 참당귀를 구별하기 위한 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은, 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기는 C인 일당귀의 단일염기다형성을 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는 일당귀를 구별하기 위한 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은, 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기는 A, 60 번째 염기는 A, 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T, 및 74 번째 염기는 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중국당귀의 단일염기다형성을 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는 중국당귀를 구별하기 위한 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서, "ITS 지역"은 ITS 지역(ITS1 & ITS2) 의 일부 또는 전부를 포함하고 rDNA (18S, 5.8S & 28S)의 전부 또는 일부 서열을 포함하는 gDNA 상의 지역을 의미하며, 본 명세서의 의미 내용상 문맥에 따라서는 그 gDNA 상의 지역으로부터 얻어진 증폭 산물, 전사체(transcript), 그 전사체로부터 얻어진 cDNA, 또는 그 cDNA 의 증폭 산물을 의미할 수 있다. 또한, 본 명세서에서, "분자 마커"는 개체들 사이의 유전적 변이를 측정할 수 있게 해주는 도구 또는 수단으로서, 유전적 정보를 검출할 수 있거나 또는 개체들 사이의 유전적 연관성을 추정할 수 있게 하는 것들을 포함한다.
본 발명의 다형성 분자 마커는 10 내지 100 개의 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어 질 수 있다. 이러한 분자 마커 또는 본 발명의 프라이머의 길이는 주형 DNA 와 특이적으로 결합하여 안정한 상보적인 결합을 형성하거나, DNA 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 한 특별한 제한은 없다. 다만, 분자 마커 또는 프라이머의 길이는 온도, 버퍼의 염 농도 등 증폭 조건을 고려하여 결정될 것이다. 통상은 10 내지 100 뉴클레오티드 범위의 길이를 가지도록 설계되어 제작될 것이나, 이들의 길이가 너무 짧거나 너무 길 경우에 주형 DNA와 비특이적 결합이 형성될 수 있으므로 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오티드의 길이를 가지도록 설계되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다형성 분자 마커의 구체적인 실시예로서, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4 를 참조할 수 있다.
하지만, 본 발명의 다형성 분자 마커의 염기서열은 상기 서열번호를 갖는 염기서열을 갖는 다형성 분자 마커에 한정되지 않으며, 구체적인 실시예로서, ITS 지역의 54 번째 염기가 T, 59 번째 염기가 A, 60 번째 염기가 T인, 염기를 갖는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함하며, 또는 230 번째 염기가 T인, 염기를 갖는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함할 수 있다.
이러한 염기서열을 포함하는 다형성 분자 마커는 참당귀를 감별하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 ITS 지역의 염기 서열 중에서 54 번째 염기가 C, 59 번째 염기는 T, 60 번째 염기는 T인, 염기를 갖는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커를 포함할 수 있다.
이러한 염기서열을 포함하는 다형성 분자 마커는 일당귀를 감별하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.
또 다른 실시예로서, ITS 지역의 54 번째 염기는 A, 59 번째 염기는 T, 60 번째 염기는 A인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열, 또는 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T, 74 번째 염기는 C인, 염기를 포함하는 연속적인 염기서열이나 그의 상보적인 염기서열로 이루어지는 다형성 분자 마커가 제공될 수 있다.
이러한 염기서열을 포함하는 다형성 분자 마커는 중국당귀를 감별하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.
각각의 다형성 분자 마커는 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 ITS 지역에 해당하는 연속적인 염기서열 부분 또는 그의 상보적인 염기서열 부분에 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 다형성 분자 마커를 포함하는, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 키트는 프라이머, 증폭반응 요소로서 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가적으로 포함할 수 있으며, 아울러, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가적으로 포함할 수 있다. 더 나아가 PCR 결과를 확인하는데 필요한 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머 쌍과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수도 있으며, 상용화된 96 well plate를 활용하여, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 기원식물 종감별용 분자마커 3종을 동시에 반응시켜 최대 30개 샘플의 혼입 여부를 한 번의 반응으로 판단할 수도 있다.
본 발명을 실시하기 위하여 사용되는 프라이머 쌍은, ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 염기를 포함하는 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열을 증폭할 수 있으며, 이러한 프라이머의 구체적인 염기서열은 서열번호 5 및 6을 참고할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 프라이머의 서열은 주형 DNA와 완전히 상보적일 필요는 없으나 주형 DNA와 특이적 결합을 형성하여 원하는 증폭 산물을 얻기 위해서 바람직하게는 80% 이상의 서열 상보성을 가지도록 설계되어 제작될 수 있으며, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 상보성을 가지도록 설계되어 제작될 수 있다.
본 발명의 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하는 방법은, 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 비교하는 단계;를 포함한다.
상기 단계에서 증폭을 위한 방법으로서 중합효소 연쇄반응 (PCR)의 구체적인 실시는 실시예 3을 참조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구별 방법은, 추출된 DNA에서 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기 중에서 적어도 하나 이상을 포함하는 부위를 증폭하여 염기서열을 비교하는 단계에 있어서, 상기 증폭 산물과 동일한 SNP 부분을 포함하는, 상기 다형성 분자마커 조성물과 상기 증폭 산물을 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화 정도를 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.
이러한 방법의 구체적인 실시 방법의 예시로서 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR)을 이용하는 실시예 5 를 참조할 수 있으며, RT-PCR에서는 PCR의 증폭산물을 형광감도에 의해 검출할 수 있으므로, 이를 위하여 검출 방법으로서, intercalator를 이용하는 방법과 형광 표지 프루브를 이용하는 방법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하는 방법에 기인하여, 구체적으로는 ITS 지역의 54 번째 염기가 T, 59 번째 염기가 A, 또는 230 번째 염기가 T로 확인되는 경우에는 참당귀로 감별할 수 있다.
또한, ITS 지역의 54 번째 염기가 C로 확인되는 경우에는 일당귀로 감별할 수 있다.
한편, ITS 지역의 54 번째 염기는 A, 60 번째 염기는 A, 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T, 또는 74 번째 염기는 C로 확인되는 경우에는, 중국당귀로 감별할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하며, 이는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 게노믹 DNA (genomic DNA) 추출
식품의약품안전청에서 참당귀의 표준 시료를 분양 받았으며, 봉화 고랭지약초시험장에서 당귀의 식물체 2구를 수집하였다. 또한 국내에 유통되고 있는 일당귀 2구, 중국당귀 2구 및 별도 분류 표기가 없는 당귀 유통품 3구를 수집하였다 (표 2).
게노믹 DNA (genomic DNA)를 추출하기 위하여, 건조된 뿌리 상태의 시료를 믹서기와 gyro shaker를 이용하여 분쇄한 후 DNA mini prep 키트를 이용하였다. (예를 들면 MACHEREY-NAGEL사의 NucleoSpin Plant II kit를 사용할 수 있다.)
또 다른 게노믹 DNA 추출을 위한 실시예로서, 구체적인 실시 방법은 다음과 같다.
약 100 mg의 건조된 약재의 뿌리 절편을 막자사발에 넣고 액체질소를 사용하여 미세분말 상태로 마쇄하고, 분말 시료를 500 ㎕의 lysis buffer에 넣고 10 ㎕ proteinase K를 첨가한 후, 37ㅀC 항온기에서 1시간 반응시킨 뒤 400 ㎕의 CTBA 완충용액 [50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.7 M NaCl, 50 mM EDTA (pH 8.0), 140 mM β-mercaptoethanol]와 혼합한 다음 65ㅀC 항온기에서 30분 간 처리하였다. 이 반응물에 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 혼합액 (25 : 24 : 1) 600 ㎕를 넣어 위아래로 균질하게 잘 섞어 14,000 rpm으로 20ㅀC에서 10 분간 원심분리하여 상등액 600 ㎕를 취하고 여기에 클로로포름 : 이소아밀알콜 혼합액 (24 : 1) 600 ㎕와 증류수 300 ㎕를 첨가하여 완전히 섞이도록 흔들어 준 다음, 14,000 rpm / 20ㅀC에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상등액 600 ㎕를 새 E-tube에 넣고 isopropanol 600 ㎕를 첨가한 다음 수차례 invert한 뒤 10 분간 방치하여 14,000 rpm / 20ㅀC에서 10 분간 원심분리 하였다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 500 ㎕로 2∼3 회 세척하고 상온에서 자연건조 시켰다. 건조된 DNA를 20∼30 ㎕ 멸균된 3차 증류수에 녹여 4ㅀC에서 1 시간동안 방치한 후 10 mg/ml RNase를 첨가하고 37ㅀC 항온기에서 1 시간동안 반응시켰다. 추출된 DNA를 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인한 후 DNA 순도검정 및 정량을 실시하였다.
실시예 2 : ITS 부위 특이 프라이머 제작
ITS 부위 특이 프라이머 제작을 위하여, 하기의 표 3과 같은, 곰팡이 균과 식물에서 광범위하게 이용되는 ITS universal primer를 이용하여 ITS1 및 ITS2 부위 증폭용 프라이머를 제작하였다.
수집 한약재를 대상으로 PCR (Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 DNA를 증폭하기 위하여 추출 및 정제된 게노믹 DNA와 ITS1, ITS4 프라이머 세트를 이용하였다.
또 다른 측면에서, 한약재 기원식물의 ITS 부위 염기서열 증폭에 최적화시키기 위하여, ITS 부위 DNA 증폭용 프라이머 염기서열을 조정하여 ITS1, ITS4 프라이머 염기서열 및 베이스페어 개수를 변경한 ITS_SF18, ITS_SR19 프라이머를 제작하였다(표 4).
실시예 3 : 수집된 약재의 ITS 부위 DNA 증폭을 위한 중합효소 연쇄반응 (PCR)
수집된 약재의 ITS 부위의 DNA를 증폭하기 위하여 중합효소 연쇄반응을 이용하며, 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
수집 약재로부터 분리 정제된 지노믹 DNA의 증폭반응용 용액은 ITS1 프라이머 (5 pmole) 1 ㎕, ITS4 프라이머 (5 pmole) 1 ㎕, dNTP (10 mM) 2 ㎕, 10 X PCR buffer 5 ㎕, Taq polymerase (2 units) 0.5 ㎕와 주형 DNA (10 ng/㎕) 5 ㎕를 혼합하여 사용하며 반응 부피는 50 ㎕로 하였다. 유전자 증폭을 위한 중합효소 연쇄 반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction)은 94℃에서 5분간 전처리 (predenaturation)한 후, 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 60℃에서 45초간 결합 (annealing), 72℃에서 60초간 증폭 (extension)으로 이루어지는 과정을 40회 반복하고, 72℃에서 10분간 최종 증폭 (final extension)시키는 조건으로 이루어졌다 (표 5). 증폭된 DNA 절편은 1.5% agarose gel에 점적하여 전기영동한 다음 EtBr 염색법으로 처리하여 증폭 밴드를 확인하였다.
실시예 4 : 수집된 약재들로부터 증폭된 ITS 부위 DNA의 염기서열 비교 분석
ITS1 프라이머와 ITS4 프라이머로 증폭된 DNA의 염기서열을 분석하여 정렬 및 비교하였다. DNA 염기서열 분석은 바이오니아 (주)에 의뢰하여 BigDyeTM terminator Cyclic Sequencing Reaction을 통하여 제공받았다. 이미 공개되어 있는 염기서열과 비교 분석을 하기 위하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하였다.
실시예 5 : 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 종감별을 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time PCR)
실시간 중합효소 연쇄반응에 최적화시키기 위하여 ITS1, ITS2 프라이머의 염기서열 및 베이스페어 개수를 일부 변형한 ITS_SF18, ITS_SR19 프라이머를 제작하여 사용하였다 (표 4 참조). 반응 용액은 QuantiTaq Probe Mastermix (Qiagen) 12.5 ㎕, ITS_SF18 프라이머 (5 pmoles/㎕) 1 ㎕, ITS_SR19 프라이머 (5 pmoles/㎕) 1 ㎕, 형광 분자마커 (5 pmoles/㎕) 1 ㎕ 및 정제한 주형 DNA (10 ng/㎕) 5 ㎕를 혼합하고 3차 증류수 4.5 ㎕를 첨가하여 제조하였으며, 최종 반응 부피는 25 ㎕로 하였다 (표 6 참조). 실시간 중합효소 연쇄반응은 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) 기계를 이용하며 반응조건은 95℃에서 15 분 (Enzyme Activation) 처리한 후, 95℃에서 15 초 (Denaturation), 60℃에서 1 분 (Annealing and Extension) 조건으로 40회 반복하여 유전자를 증폭시켰다 (표 7 참조).
실시예 6 : ITS 부위 DNA 염기서열 비교 분석
1) NCBI 등록 염기서열과 비교
수집된 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 시료의 ITS-1 부위, 5.8S rDNA 및 ITS-2 부위 DNA 염기서열을 분석하여 NCBI에 이미 등록된 염기서열과 비교하였다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 수집 시료 중 01, 06, 07번 시료의 염기서열이 NCBI에 등록된 Angelica gigas의 염기서열 중 JX022913, DQ647697 (accession number)의 염기서열과 일치하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이 수집 시료 03, 05번 시료의 염기서열은 NCBI에 등록된 Angelica acutiloba 염기서열 AB697596, AB569093, AY548227 과 일치하였다. 도 4에서 나타낸 바와 같이 04번 시료의 염기서열은 NCBI에 등록된 Angelica sinensis 의 염기서열 JX022936, GU289658, GU289657, GU289656, GU289655, GU289654, GU289653, FJ572042, AF393784 과 일치하였다.
2) 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 SNP (Single Nucleotide polymorphism, 단일염기다형) 분석
국내 유통 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 18S rDNA의 3' 말단 부위 일부, ITS1 부위, 5.8S rDNA, ITS2 부위 및 36S rDNA의 5' 말단부위 일부를 포함하는 총 277 bp의 유전자 절편에 대한 염기서열을 상호 비교한 결과 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기 및 230 번째 염기에서 SNP 위치가 확인되었다(표 1 참조).
실시예 7 : 프라이머 및 형광 분자마커 디자인
실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR)에 적합하도록 ITS-1 부위의 DNA를 증폭할 수 있는 총 18 bp의 길이를 가지는 ITS_SF18 프라이머와 총 19 bp의 길이를 가지는 ITS_SR19 프라이머를 디자인하였다. 참당귀 특이 형광 분자마커는 염기서열 218 bp부터 241 bp (도 1 에 비교된 염기서열 기준)에 해당하는 부위의 안티센스 DNA 가닥에 결합할 수 있도록 디자인하였으며, 일당귀 특이 형광 분자마커는 염기서열의 47 bp부터 66 bp에 해당하는 부위, 중국당귀 특이 형광 분자마커는 55 bp부터 75 bp에 해당하는 부위의 센스 DNA 가닥에 결합할 수 있도록 제작되었다
RT-PCR에서는 PCR의 증폭산물을 형광감도에 의해 검출하며, 대표적인 형광을 이용한 검출 방법에는 인터칼레이터(intercalator)를 이용하는 방법과 형광 표지 프루브를 이용하는 방법이 있다.
인터칼레이터로서 일반적으로 SYBR Green I을 사용 하며, 이 물질은 이중가닥 DNA에 결합해 형광을 발하는 시약 (interchelator)이다. PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.
형광표지 프루브는 많은 종류가 있으며, Linear probe (ex: Taqman probe), structured probe (Molecular Beacon), Cycling probe등이 있다.
1) 참당귀, 일당귀 및 중국당귀의 감별을 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR) 결과
ITS_SF18, ITS_SR19 프라이머 세트와 DGC_Pb02_RC_FAM 형광 분자마커, DGI_pb_02_FAM 형광 분자마커 및 DGJ_pb_01_FAM 형광 분자마커를 이용하여 국내 수집 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 시료에 대하여 각각 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-time PCR) 실험을 한 결과, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 각각에 대하여, PCR cycle 수에 따른 형광물질의 검출을 나타내는 그래프인 도 5 내지 도 7에서 볼 수 있듯이 감별이 효과적으로 이루어질 수 있는 것을 확인할 수 있다.
2) 국내 유통 당귀 시료에 대한 감별 방법 적용 결과
국내 시중에서 유통되고 있는 7구의 약재 시료를 대상으로 종감별 실험을 한 결과, '일당귀' 표기 유통 약재 2구 중 1구 (02번 시료)는 참당귀와 일당귀가 혼재되어 있었으며, '중국당귀'로 표기되어 있는 2구 중 1구 (05번 시료)는 일당귀로 판명되었다. '당귀'로 표기되어 유통되는 3구는 모두 참당귀로 판명되었다 (표 8).
<110> KT&G Corporation
<120> SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER FOR IDENTIFICATION OF
ANGELICA GIGAS, ANGELICA ACUTILOBA AND ANGELICA SINENSIS, AND
IDENTIFICATION METHOD USING THE SAME
<130> APC-2014-0116
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 278
<212> DNA
<213> Angelica gigas
<400> 1
tgcggaagga tcattgtcga atcctgcaat agcaaaatga cccgctaaca cgttaacaat 60
ttgggcgagc gtcggggggc ctcggtctcc tgtctgcgaa tccctggtag gtggccactc 120
tcgggtggcc actggcctgc aaaatcattc gggcgcggaa tgcgccaagg accttaaaac 180
tgaattgtac gtccgtatcc cgttagcggg caccggcgtc attccaaaat acaacgactc 240
tcgacaacgg atatctcggc tctcgcatcg atgaagaa 278
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DGC_Pb02_RC_FAM
<400> 2
agagtcgttg tattttggaa tgac 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DGI_pb_02_FAM
<400> 3
aacacgtcaa cattttgggc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DGJ_pb_01_FAM
<400> 4
aacatattgg gcaagtgttc g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITS_SF18
<400> 5
tgcggaagga tcattgtc 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITS_SR19
<400> 6
ttcttcatcg atgcgagag 19
Claims (19)
- 서열번호 1로 기재되는 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기 및 74 번째 염기의 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 21 내지 100개의 염기로 이루어진 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는, 참당귀, 일당귀 및 중국당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 삭제
- 서열번호 1로 기재되는 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서,
54 번째 염기는 T, 59 번째 염기는 A, 및 230 번째 염기는 T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 참당귀의 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 염기로 이루어진 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는, 참당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 다형성 분자 마커는 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 것인, 참당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 서열번호 1로 기재되는 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서,
54 번째 염기는 C 인, 일당귀의 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 염기로 이루어진 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는, 일당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 다형성 분자 마커는 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 것인, 일당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 서열번호 1로 기재되는 당귀의 ITS 지역 유전자 내에서,
54 번째 염기는 A, 60 번째 염기는 A, 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T, 및 74 번째 염기는 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중국당귀의 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 10 내지 100개의 염기로 이루어진 연속적인 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열의 다형성 분자 마커를 포함하는, 중국당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 다형성 분자 마커는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것인, 중국당귀를 구별하기 위한 조성물.
- 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 다형성 분자 마커를 포함하는, 당귀를 구별하기 위한 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
상기 추출된 DNA에서 서열번호 1 로 기재되는 당귀의 ITS 지역 유전자 내의, 54 번째 염기, 59 번째 염기, 60 번째 염기, 67 번째 염기, 70 번째 염기, 73 번째 염기, 74 번째 염기, 및 230 번째 염기 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 부분을 증폭시키는 단계;
상기 증폭 산물과 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 혼합하여, 상기 증폭산물과 상기 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물 내 다형성 분자마커를 혼성화하는 단계; 및
상기 혼성화 정도를 검출하여 상기 시료를 참당귀, 일당귀 및 중국당귀 중 어느 하나로 감별하는 단계;를 포함하는, 당귀를 구별하는 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 54 번째 염기는 T, 59 번째 염기는 A, 또는 230 번째 염기는 T로 확인되는 경우, 참당귀로 감별하는 것인, 당귀를 구별하는 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 54 번째 염기는 C로 확인되는 경우, 일당귀로 감별하는 것인, 당귀를 구별하는 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 54 번째 염기는 A, 60 번째 염기는 A, 67 번째 염기는 A, 70 번째 염기는 T, 73 번째 염기는 T, 또는 74 번째 염기는 C 로 확인되는 경우, 중국당귀로 감별하는 것인, 당귀를 구별하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제13항에 있어서,
상기 증폭시키는 단계는,
서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍으로 수행되는 것인, 당귀를 구별하는 방법.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |