KR100720864B1 - 당귀의 종간 유전자 감별 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 당귀의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것으로써, 상세하게는 중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas)를 파이로시퀀싱법에 의하여 유전자형을 분석하고, 당귀의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 고안하여 당귀의 종간 연관성과 유전적 변이를 평가하기 위한 감별 키트에 관한 것이다. 본 발명의 감별 키트를 통하여 당귀의 종을 판별함으로써 정확한 당귀 원료를 공급할 수 있으며, 당귀의 품질관리 방법으로 활용 할 수 있다.

중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas), 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법, 감별 키트

Description

당귀의 종간 유전자 감별 키트 {A kit for discriminating genetical identification of Angelica species}

도 1 은 일당귀(Angelica acutiloba)에 대해 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 수행한 결과를 나타낸 도이고,

도 2 는 참당귀(Angelica gigas)에 대해 파이로시퀀싱 법을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

도 3 은 중당귀(Angelica sinensis)에 대해 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의한 당귀의 종간 유전자 감별 키트에 관한 것이다.

당귀는 만주, 일본과 우리나라 남부, 중부, 북부의 산계곡 습기가 있는 토양에서 자생하며 약용식물로 재배하고 있다. 당귀는 본초학적으로 성미는 따뜻하고 독이 없으며, 맛은 달고 맵다. 보혈, 구어혈, 조경, 진정 작용이 있고, 신체허약, 관절통, 두통, 현훈,복통, 월경불순, 변비, 장건조, 타박상 등에 사용한다.

일당귀의 물 추출액은 실험동물의 혈압내림작용이 있고, 이뇨작용, 대뇌의 진정작용, 연수의 흥분과 마비작용이 있다. 또한 당귀는 단백질 합성과 자궁조직의 신생을 돕고, 포도당의 흡수를 늘리는 등 물질대사를 활성화 시키며, 골수를 재생시켜 조혈작용에 도움을 준다. 에탄올 추출액은 자궁의 운동을 활발하게하고, 당귀 물추출액은 안압 및 혈압을 낮추고, 참당귀의 달임액은 진정진경작용이 있으며 뿌리의 정유 수용액은 관절염의 진통과 소염작용 등의 약리효과가 있다.

주요성분으로는 쿠마린, 베르갑텐, 이소핌피넬린, 정유, 니코틴산, 비타민 B12 등이 있다.

당귀에는 중당귀, 일당귀, 참당귀 이렇게 세가지가 있다. 약용으로 사용하는 당귀는 한, 일, 중에서 서로 약간 다른 식물을 사용하고 있다. 한국에서 흔히 쓰는 약용당귀를 "참당귀"라 하여 학명은 "Angelica gigas"이고, "2-3년생 초본" 이다. 일본에서 약용당귀를 "왜당귀" 라 하여 학명은 "Angelica acutilobae" 이고, "다년생 초본" 이다. 중국에서 약용당귀를 "중국당귀"라 하여 학명은 "Angelica sinensis"이고 "다년생 초본" 이다. 이들 "당귀"들은 효능과 약성이 서로 조금식 다르지만 약용으로 구별없이 혼용하고 있다.

당귀는 옛날부터 우리나라 생약으로 충분히 조달할 수 있었지만, 한방약에 대한 수요가 급격히 증가하면서 국산 생약의 부족 사태가 일어나 외국산의 수입을 추진하게 되었다.

기존의 당귀 감별 유전자 분석법의 경우 주관적인 요소가 있을 수 있는 겔을 토대로 한 방법(gel-based method)으로 판독자에 따라 감별 결과가 달라질 가능성이 있었다.

이에 본 발명자들은 최근 발전되고 있는 유전적 변이를 평가하는데 사용되는 DNA 시퀀싱 기술인 ‘파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법'을 이용하여 중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas) 종들로부터 추출된 DNA로부터 단일 염기 형태의 변이를 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 자동적인 유전자 분석법인 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 당귀의 종간 유전적 변이를 분석하여 당귀의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당귀의 종간 유전적 변이를 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 분석하여 당귀의 종을 감별하기 위한 감별 방법을 제공한다.

본 발명의 감별 방법은 당귀 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA 및 프라이머(primer)의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용 액을 증폭시키는 제 3단계; 상기 증폭된 DNA의 전체 염기서열을 분석하는 제 4단계; 증폭된 DNA를 조합하여 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법을 수행함으로써 얻어진 유전자형 분석(genotyping)을 통하여 당귀의 종을 감별하는 제 5단계;를 포함하는 당귀 종 감별 방법을 제공한다.

상기 센스 프라이머는 서열번호 1을 포함하는 바이오틴 결합성 프라이머임을 특징으로 하고, 상기 안티센스 프라이머는 서열번호 2를 포함함을 특징으로 하는 감별방법을 제공한다.

또한, 상기 제 5단계의 파이로시퀀싱법에 사용되는 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 프라이머를 사용하여 수행됨을 특징으로 한다.

상기 서열번호 1로 기재되는 바이오틴 결합성 프라이머는 18 내지 20 염기서열(mer)로써 염기서열을 바탕으로 고안됨을 특징으로 한다.

또한, 상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법에 사용되는 프라이머는 서열번호 3으로 기재되는 당귀 시료의 종간 특이성 시퀀싱(sequencing) 프라이머로서 유전자형 분석에 사용됨을 특징으로 한다.

상기 서열번호 3으로 기재되는 프라이머는 10 내지 15 염기서열(mer)로써 2차 구조(secondary structure)가 형성되지 않게 돌연변이 자리(mutation site)로부터 조금 떨어지게 고안하여 첨가함을 특징으로 한다.

상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법을 수행 시, 신장되는 DNA 가닥에서 뉴클레오티드가 합성될 때 빛이 발생되며, 이러한 과정을 통하여 당귀의 다형성(polymorphism)이 자동적으로 유전자형이 판별됨을 특징으로 한다.

상기 제 5단계의 파이로시퀀싱 법은 15분 안에 시료의 동시 분석이 가능한 자동화된 미세역가를 기초로 한 파이로시퀀서 기구(microtiter-based pyrosequencer instrument)로 실행되며, 각 뉴클레오티드의 제조는 약 1분정도 걸리므로, 유전적 변이의 정확한 서열(sequence)의 측정에 빠른 방법으로 이용될 수 있다.

본 발명은 DNA 추출시약, 서열번호 1의 센스 프라이머 또는 서열번호 2의 안티센스 프라이머를 포함하는 PCR용 시약 및 서열번호 3의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 당귀의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 당귀의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 파이로시퀀싱법에 의해 얻어진 분석결과(도 1 및 도 2 참조)에 따른 종별 당귀 비교를 위한 표준 분석도 및 이를 분석한 분석표를 포함하는 당귀의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

본 발명의 감별 키트는 소량의 시료를 이용하여 단시간 내에 감별이 가능하며, 겔을 이용하지 않는 방법(non-gel based method)으로써 주관적인 요소가 배재된 보다 정확한 진단이 가능하다.

또한, 본 발명의 감별 키트는 육안으로 감별이 어려운 당귀에 있어서 종특이적 프라이머를 이용하여 당귀의 종, 바람직하게는 중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas)를 감별 할 수 있으며, 상기 감별 방법 또는 감별 키트를 위한 당귀 시료로는 중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas)의 전초, 뿌리, 줄기, 또는 잎 등이 가능하다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 당귀 시료의 준비

당귀 시료로서 중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas)는 국내에서 자생중인 원식물을 경희대학교 본초학교실(서울, 대한민국)에서 확인한 것을 제공 받아 사용하였다.

실시예 1. 당귀의 DNA 정제

뿌리부분 전체가 포함된 형태의 당귀 3g을 멸균된 작은 칼로 잘게 썰고, 멸균된 분쇄기로 분쇄하여 분말화 하였다. DNA 분리용 키트(DNeasy, No. 69104, Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)는 제조사의 설명서에 의하여 약간 변형하여 사용하였다. 분말화 된 당귀 시료 300 mg은 세정과정을 거쳐 사용하였다. 시료를 용출(elution)하기 전에, 컬럼(column)은 남은 에탄올을 증발시키기 위해 5분 동안 37℃에서 건조시켰다. 시료들은 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) 총 부피 200 ul에서 용출시켰다.

실험예 1. PCR 법을 이용한 DNA 증폭

추출된 DNA의 증폭은 PCR법에 의하여 수행되었다. 각 당귀 시료의 ITS(internal transcribed spacer regions) 구역은 DNA 25 ng, 각 프라이머 (정방향(forward): 서열번호 1, 역방향(reverse): 서열번호 2) 5 pmol을 사용하여 증폭되었다. PCR 증폭은 0.5 단위(unit) Taq 폴리머라제(HT Biotechnology Ltd., Cambridge, United Kingdom)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응 혼합물 30 ul는 10 mM 트리스(Tris)-HCl, pH 9.0, 1.5 mM 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), 50 mM 포타슘 클로라이드(potassium chloride), 0.1% 트라이톤(Triton)-X 100, 0.01 % [v/v] 안정제(stabilizer), 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 각 0.25 mM, 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer) 각 0.1 M로 구성되었다. PCR 과정은 95 ℃에서 5분 동안 변성과정을 거치고, 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30 초 동안 30회 PCR 시스템(PCR System, Astec, Japan)을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 역방향 프라이머(reverse primer)는 단일가닥 DNA 조합이 가능한 바이오틴 결합성이다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 확인되었다.

실험예 2. 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법에 의한 유전자형 분석(Genotyping)

파이로시퀀싱을 위한 DNA 조합(preparation)(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)은 제조사의 표준 프로토콜(protocol)을 따라 수행되었다. 스트렙트아비딘 세파로즈 비즈(streptavidin sepharose beads, Streptavidin Sepharose HP, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)는 PCR 산물에 고정되었다. 당귀 시료의 시퀀싱 프라이머는 서열번호 3으로 기재된 서열이고, 이것은 파이로시퀀싱 AB(Pyrosequencing AB)로부터 변종(mutation)의 기부에 바로 가까이 인접한 말단 잔기 혼성화에 의해 제작되었다(http://www.pyrosequencing.com). 10분 동안 실온에 방치한 후, 바이오틴결합성 PCR 산물 20 ul는 스트렙트아비딘 코팅된 세파로즈 비즈에 고정되었고, 고정된 PCR 산물은 96-웰 필터에 옮겨졌다(Millipore, Bedford, MA, USA). 비즈는 웰에 남겨지고 다른 용액과 시약들을 제거하고 순수한 단일가닥 DNA를 얻기 위해 진공(vacuum)을 사용하였다. 시퀀싱 프라이머 0.35 uM이 포함된 4M 아세트산(acetic acid) 55 ul에 주형(template)이 고정된 비즈를 다시 담그고, 부유물의 45 ul를 PSQ 96 플레이트(Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)로 이동시켰다. PSQ 96 샘플 프렙 열플레이트(PSQ 96 Sample Prep Thermoplate)를 사용하여, 시료가 포함된 PSQ 96 플레이트를 시퀀싱 프라이머를 어닐링(annealing)하기 위해 90 ℃에서 5분동안 열을 가하고, 10분 동안 실온에 옮겨놓은 후, PSQ 96 플레이트는 PSQ 96 기구의 작동 챔버(process chamber, Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)로 이동시켰다. 효소(enzyme)와 기질(substrate), 뉴클레오티드(nucleotide)는 PSQ 96 SNP 시약 키트(PSQ 96 SNP Reagent Kit, Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 웰 안에서 시약 카세트(reagent cassette)로부터 제조되었다. 신장되는 DNA 가닥에서 뉴클레오티드가 합성될 때 빛이 발생된다. 이러한 과정으로부터 당귀의 다형성(polymorphism)은 자동적으로 유전자형이 판별되 었다.

세 가지 당귀의 종을 구별하기 위하여 파이로시퀀싱 법에 의하여 동정하였고, 그 결과, 참당귀, 일당귀, 중당귀는 서로 비교하여 다른 형태를 보여 명백한 차이를 나타내었다. 중당귀의 피크(peak)는 일당귀, 참당귀와 비교하여 두 번째 C 뉴클레오티드에서 매우 약하게 나타났다. 일당귀의 피크(peak)는 네 번째 C 뉴클레오티드에서 존재하였으나 참당귀, 중당귀는 나타나지 않았다. (도 1 내지 도 3 참조) 이 결과는 당귀의 종간 감별 염기서열에서 일당귀는 CGTC이고 참당귀는 CGTT이며 중당귀는 TGTA 염기인 점을 잘 반영하는 것이다.

따라서 참당귀, 일당귀, 중당귀를 비교하기 위한 본 발명의 당귀의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머가 적합하게 고안되었음을 확인 할 수 있었다.

본 발명은 당귀에 대하여 파이로시퀀싱법을 이용하여 유전자형을 분석하고, 당귀의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 고안하여 중당귀(Angelica sinensis), 일당귀(Angelica acutiloba), 참당귀(Angelica gigas)의 종간 연관성과 유전적 변이를 감별하는 당귀의 종간 확인시험법을 이용한 감별 키트를 제공함으로써 정확한 당귀 원료를 공급하고 당귀의 품질관리 방법으로 활용 할 수 있으며, 당귀 외에 기타 한약재 자원에 대한 신물질 탐색이나 품종간 감별에 대한 기초 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 당귀 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA , 서열번호 1로 기재되는 센스 프라이머(AAGGATCATT GTCGAATCCT) 및 서열번호 2로 기재되는 안티센스 프라이머(ACGGACGTAC AATTCAGTTT TAA)를 포함하는 프라이머(primer)의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 PCR을 통해 증폭시키는 제 3단계; 상기 증폭된 DNA의 전체 염기서열을 분석하는 제 4단계; 증폭된 DNA를 조합하여 서열번호 3으로 기재되는 프라이머(GCAAAATGAC CCGCT)를 사용하여 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 법을 수행함으로써 얻어진 유전자를 도 1(일당귀), 도 2(참당귀) 및 도 3(중당귀)에 나타난 서열과 비교함으로써, CGTC를 나타내는 일당귀, CGTT를 나타내는 참당귀 및 TGTA를 나타내는 중당귀를 감별하는 제 5단계를 포함하는 당귀의 종을 감별하기 위한 감별 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. DNA 추출시약, 서열번호 1의 센스 프라이머 또는 서열번호 2의 안티센스 프라이머를 포함하는 PCR용 시약 및 서열번호 3의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)법에 의해 당귀의 종간 유전적 변이가 분석됨을 특징으로 하는 당귀의 종을 감별하기 위한 감별 키트.

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