KR102066595B1

KR102066595B1 - 감국 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커

Info

Publication number: KR102066595B1
Application number: KR1020190022821A
Authority: KR
Inventors: 양현옥; 이택주
Original assignee: 한국과학기술연구원; 재단법인한택식물원
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2020-01-15
Also published as: KR20190103053A

Abstract

본 발명은 감국 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것으로, 본 발명의 품종은 감국 중에서 꽃이 큰 특징을 가지고 있어서 관상가치가 일반 감국에 비해 높고, 일반 국화 품종의 경우 흰가루병과 같은 병해에 약하나 감국은 내병성과 환경적응성이 뛰어나므로 재배하는데 어려움이 없는 장점이 있다.

Description

감국 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커{Han Taek, new cultivar of Dendranthema indicum and molecular marker for discriminating the same}

본 발명은 감국 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것이다.

감국(Dendranthema indicum (L.) Des Moul.)은 국화과(Asteraceae) 산국속(Dendranthema)의 여러해살이풀로, 황국이라고도 한다. 풀 전체에 짧은 털이 나 있고 줄기의 높이는 60∼90cm이며 검은색으로 가늘고 길다. 잎은 짙은 녹색이고 어긋나며 잎자루가 있고 달걀 모양인데 보통 깃꼴로 갈라지며 끝이 뾰족하다. 갈라진 조각은 긴 타원형이고 가장자리가 패어 들어간 모양의 톱니가 있다. 9∼10월에 줄기 윗부분에 산방꼴로 두화(頭花)가 핀다. 꽃은 지름 2.5cm 정도이며, 설상화(혀꽃, ray flower)는 노란색이나 흰색도 있다.

10월에 꽃을 말려서 술에 넣어 마시고, 어린 잎은 나물로 쓴다. 꽃에 진한 향기가 있어 관상용으로도 가꾼다. 한방에서 열감기·폐렴·기관지염·두통·위염·장염·종기 등의 치료에 처방한다. 민간요법으로는 풀 전체를 짓찧어서 환부에 붙이거나 생초를 달인 물로 환부를 씻어낸다. 한국·타이완·중국·일본 등지에 분포한다.

감국은 가을을 대표하는 식물로 우리나라 각처에 자라는 들국화의 일종으로 노란색 꽃이 달린 두상꽃차례가 가지의 끝에 많이 달리는 것이 특징이다. 이런 점에서 산국(Dendranthemum boreale (Makino) Ling ex. Kitam.)과 비슷하나 산국에 비해 바닷가에서 흔하게 자라며, 두상꽃차례의 지름이 약 2배 가까이 크고, 줄기는 아래쪽이 땅에 누우므로 구분된다. 또, 두상꽃차례가 산방상으로 배열되어 있어 꽃차례 무리가 역삼각형 모양인 점에서 구분된다.

관상용으로 정원에 심는다. 잎은 차로 쓰이기도 한다. 전체 식물체는 소염성이 있고, 조혈강장제, 혈액정화제, 해열제의 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 약용으로 널리 쓰인다. 감국은 윤기가 나는 황색을 띠고 향기로우며 영양성분이 풍부하게 함유되어 있기 때문에 사계절 모두에 적합한 건강음료로 활용이 가능하다. 함유된 황색소(黃色素)는 음식 첨가제로 쓰인다.

한국등록특허 제0726874호에는 '새로운 국화품종'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1748566호에는 '초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 감국 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명자들은 감국 식물체의 자연교잡을 유도하고 채집한 종자를 파종하여 발아시킨 유묘를 번식시킨 결과, 일반 감국에 비해 꽃의 직경 및 설상화의 길이가 큰 식물체를 선발할 수 있었으며, 상기 식물체를 계통 육성하여 감국 신품종 '한택'으로 명명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18689P이며, 꽃의 직경이 3.2~3.8cm이고, 설상화의 길이가 12~15mm인 감국 신품종 '한택' (Dendranthema indicum 'Han Taek') 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 감국 신품종 '한택' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18689P인 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 감국 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18689P인 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별방법을 제공한다.

본 발명의 감국 신품종 '한택'은 감국 중에서 꽃이 큰 특징을 가지고 있어 관상가치가 일반 감국에 비해 높고, 일반 국화 품종의 경우 흰가루병과 같은 병해에 약하나. 감국은 내병성과 환경적응성이 뛰어나므로 재배하는데 어려움이 없는 장점이 있어 화훼농가에 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 출원품종(한택)과 대조품종인 감국 및 제주감국의 꽃 크기를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 출원품종(한택)과 대조품종인 감국 및 제주감국의 잎 크기를 보여주는 사진이다.
도 3은 한택감국 및 근연종 간 분자마커를 이용한 PCR 결과이다. 11, 구절초; 13, 마키노국화; 14, 감국; 15, 제주감국; 16, 한택감국(출원품종); 19, 개미취.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18689P이며, 꽃의 직경이 3.2~3.8cm이고, 설상화의 길이가 12~15mm인 감국 신품종 '한택' (Dendranthema indicum 'Han Taek') 식물체를 제공한다.

본 발명의 감국 신품종 '한택'은 표 1 내지 표 5에 기재된 것과 같은 형태학적 특징을 가지며, 일반 감국과 비교하여 꽃의 직경 및 설상화의 길이가 각각 1.3배 및 1.6배 큰 특징이 있는 식물체이다(도 1).

본 발명의 일 구현 예에 따른 감국 신품종 '한택'은 국내 여러 지역에서 채집한 감국들을 식물원 내의 포지에서 자연교잡을 유도한 후, 일반 감국에 비해 꽃이 큰 형질의 개체를 선발하여 상기 개체를 계통 육성하였다. 본 발명자는 일반 감국에 비해 꽃의 직경이 3.2~3.8cm이고, 설상화의 길이가 12~15mm로 큰 특성을 가지는 감국 품종을 '한택'으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 6월 15일자에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC18689P).

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCTC18689P인 감국 신품종 '한택' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 식물체의 '부분체'는 이에 한정하지 않으나, 감국 신품종 '한택'의 화분, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 자손 식물체는 감국 신품종 '한택'의 무성생식을 통해 유래된 자손 식물체 또는 감국 신품종 '한택'을 모본으로 사용하여 다른 품종과 교배를 통해 유해된 자손 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18689P인 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이서 세트에 있어서, 상기 3개의 프라이머 세트는 삽입결실(insertion-deletion) 변이지역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다(표 6).

상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 및 서열번호 5 및 6의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트는 상기 3개 프라이머 세트 중, 1개의 프라이머 세트, 2개의 프라이머 세트 조합 및 3개의 프라이머 세트 조합이 가능하며, 상기 3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면, 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별이 보다 정확하게 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

감국 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18689인 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 감국 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 감국 신품종 한택의 육성과정 및 수집

본 품종은 한택식물원(용인) 내에서 2006년부터 감국의 신품종 개발을 위하여 식물원내 포지에 국내 다양한 지역(제주도, 거제도, 해남, 동해 일대)에서 채집한 감국을 자연교잡이 이루어지도록 교호식재(열식을 변형한 수법으로 같은 간격으로 어긋나게 식재)하였으며, 2006년 가을 각각의 지역에서 채집한 감국에서 채종한 종자를 파종하여 2007년 발아시켰으며 유묘를 재배 포지에 모두 식재하여 재배하였다.

식재 후 2년간 재배하였으며 2008년 첫 개화한 개체 중 일반 감국에 비해 꽃이 크고 꽃잎(설상화) 길이도 길어 관상가치가 높은 품종을 선발하였으며, 2009년 품종의 특징이 동일하게 발현이 되는 것을 확인하고 증식시켰다.

본 품종은 감국 중에서 꽃이 큰 특징을 가지고 있어서 관상가치가 일반 감국에 비해 높고, 일반 국화 품종의 경우 흰가루병과 같은 병해에 약하나 감국은 내병성과 환경적응성이 뛰어나므로 재배하는데 어려움이 없는 장점이 있다.

실시예 2. 감국 신품종 한택의 형태적 변이 분석

상기 실시예 1에서 선별된 신품종 한택과 대조품종인 감국과의 형태적인 특성을 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 1 내지 표 5, 도 1 및 도 2에 나타내었다.

실시예 3. 감국 신품종 한택의 판별을 위한 분자마커 개발

3-1. DNA 추출

국화과(한택감국, 제주감국, 감국, 마키노국화(Dendranthema makinoi (Matsum.) Y.N.Lee), 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum), 개미취(Aster tataricus L.f.) 식물체(한택식물원 보유)의 잎을 채취하였으며, 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.

건조한 시료 0.2g을 막사 사발에 넣고 액체 질소를 사용하여 미세분말 상태가 되도록 분쇄하고 2㎖ 튜브에 옮겨담았다. 1.2㎖의 추출 버퍼(1.4M NaCl, 100mM Tris (pH 8.0), 20mM EDTA (pH 8.0), 2% CTAB, 0.2% β-mercaptoethanol)를 튜브에 첨가하고 5초간 볼텍싱하였다. 65℃ 항온기에서 30~60분 반응 시키고(10분에 한번씩 섞어줌), 13,500xg로 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 800㎕의 Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1)을 넣고 상온에서 20분간 인버팅(inverting) 한 후 13,500xg로 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 -20℃에 보관했던 차가운 isopropanol 800㎕를 넣고 5분간 인버팅하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠릿만 남긴다. 200~250㎕의 TE 버퍼를 넣어 펠릿을 녹이고, 2.5㎕의 RNase(10mg/㎖)를 넣어 30~60분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 3M NaAc 25㎕를 넣고 잘 섞어준 다음, 600㎕의 차가운(-20℃) 100% 에탄올을 튜브에 넣고 잘 섞어주고 -20℃에서 20분간 반응시킨다. 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 차가운(-20℃) 70% 에탄올 500㎕를 넣는다. 탭핑 또는 1~2초의 볼텍싱으로 펠릿을 튜브 벽에서 분리시키고, 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거한 다음, DNA 펠릿을 적어도 1시간 이상 건조시켰다. 건조된 DNA를 20~30㎕의 TE 버퍼에 완전히 녹였다.

3-2. 염기서열 분석 및 엽록체 게놈 서열 조립

추출된 약 2㎍의 게놈 DNA는 랩지노믹스(www.labgenomics.co.kr)에서 제조 업체가 제공하는 paired-end 표준 프로토콜에 따라 500bp 삽입 크기(insert size)의 게놈 라이브러리로 제작되었다. 시퀀싱은 일루미나사의 MiSeq 플래폼을 이용하여 진행하였다.

차세대유전체분석기술(Next-generation sequencing, NGS)로 생산된 대량의 염기서열은 식물체 유전체 크기의 0.5~1X의 low coverage(엽록체 게놈 크기의 300~400X)에 해당하며, 엽록체 게놈 서열은 이 소량의 데이터를 이용하여 dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(한국등록특허 제1447593호)을 통해 완성하였다. 본 분석의 경우 각 1.8~3.0Gbp에 해당하는 원시데이터를 이용하여 엽록체 게놈을 완성하였다. 완성한 엽록체 유전체의 크기는 한택감국이 150,973bp, 제주감국이 151,050bp, 감국이 151,075bp, 마키노국화가 151,051bp, 구절초가 151,152bp, 개미취가 152,447bp 였다. 완전한 엽록체 게놈을 조립한 후 DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/) 프로그램과 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 엽록체 유전체의 유전자 부위를 결정하였다.

3-3. 염기서열 비교 분석을 통한 종간 변이지역 발굴

완성된 6종의 엽록체 게놈의 염기서열을 MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) 프로그램을 통하여 비교 분석하였다. 엽록체 게놈 서열의 종간 변이지역은 개미취의 경우 참취속(Aster) 식물이므로 국화속(Chrysanthemum)에 속하는 감국류와 비교하였을 때 많은 수의 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)과 삽입-결실(InDel)이 확인되었으며, 개미취를 제외한 감국류 간 변이지역은 40~58개의 SNP, 74~200개의 InDel이 확인되었다. 이 중 InDel 다섯 지역을 대상으로 종 구분마커를 개발하였다. 엽록체 게놈의 염기서열 비교분석을 통하여 개발된 구분마커들을 확인하기 위한 프라이머 세트는 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 6).

한택감국(출원품종) 및 근연종 구분 InDel 분자마커 및 프라이머 정보

마커명	위치	산물 크기(bp) (N11/N13/N14/N15/N16/N19*)		프라이머 서열(5'→3') (서열번호)
NC_i_12	petN	340/340/330/340/346/304	F	GTCTCGCTTGGGCTGCTTTA (1)
			R	TGGAATTGACGTAGGACCCAA (2)
NC_i_14	psbE-petL	306/247/259/234/263/239	F	ATCTGAAGGTTCTTTCTTGACCT (3)
			R	AGATTCCGCAATAGGTTCACTC (4)
NC_i_15	intron	263/258/263/263/274/267	F	CGGGTAAAGATCCGCCCAAT (5)
			R	TGAAGTATCCAGGCTCCGTT (6)
NC_i_16	rps8-rpl14	194/194/194/185/194/252	F	ACTCAGGGAATCTTTGGGCTT (7)
			R	ACGGGCCTCTTGAATCCTCT (8)
NC_i_17	petD-rpoA	242/265/242/242/242/233	F	TCTAGGGAGCAGTCACTTCA (9)
			R	GAAGATGTCAAACAAATTTTAGGAA (10)

(N11, 구절초; N13, 마키노국화; N14, 감국; N15, 제주감국; N16, 한택감국; N19, 개미취.)

3-4. 중합효소연쇄반응(PCR)

PCR 반응은 총 볼륨을 25㎕로 하였고, 20ng의 주형 DNA 2㎕, 각 10mM의 dNTPs 0.5㎕, 각 10 pmole의 프라이머 1㎕, 1U의 Taq 중합효소(Inclone, 한국) 0.25㎕, 10X Taq 반응완충용액 2.5㎕, 멸균수를 사용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 DNA 변성을 수행하였고, DNA 증폭을 위해 94℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초를 총 35회 수행하였다. 마지막 신장 과정은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 증폭산물은 9% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 확인하였다.

개발한 상기 프라이머 세트를 한택감국 및 근연종에 적용한 결과는 도 3 및 표 7과 같다. 엽록체 게놈 InDel 변이지역을 기반으로 개발된 NC_i_12 마커를 적용하여 구절초-마키노국화-제주감국과 감국-한택감국-개미취를 구분할 수 있었으며 NC_i_16 마커를 적용하여 구절초-마키노국화-감국-한택감국과 제주감국-개미취를 구분할 수 있었다. 또한 NC_i_17 마커를 적용하여 마키노국화를 특이적으로 구분할 수 있었으며 NC_i_14 마커를 적용하여 마키노국화-감국-구절초와, 제주감국-개미취-한택감국을 구분할 수 있었다. NC_i_15 마커를 적용하여 구절초-마키노국화-감국-제주감국과 한택감국-개미취를 구분할 수 있었다.

엽록체 기반 마커를 이용한 한택감국(출원품종) 및 근연종의 구별 결과

마커명	구절초	마키노국화	감국	제주감국	한택감국	개미취
NC_i_12	A	A	B	A	C	D
NC_i_16	A	A	A	B	A	C
NC_i_17	A	B	A	A	A	A
NC_i_14	B	A	A	C	D	C
NC_i_15	A	A	A	A	B	C

한국생명공학연구원

KCTC18689P

20180615

<110> HANTAEK BOTANICAL GARDEN FOUNDATION <120> Hanteak, new cultivar of Dendranthema indicum and molecular marker for discriminating the same <130> PN19056 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtctcgcttg ggctgcttta 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tggaattgac gtaggaccca a 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atctgaaggt tctttcttga cct 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agattccgca ataggttcac tc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgggtaaaga tccgcccaat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgaagtatcc aggctccgtt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actcagggaa tctttgggct t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acgggcctct tgaatcctct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tctagggagc agtcacttca 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaagatgtca aacaaatttt aggaa 25

Claims

꽃의 직경이 3.2~3.8cm이고, 설상화의 길이가 12~15mm인 감국 신품종 '한택' (Dendranthema indicum 'Han Taek') 식물체로서,
상기 식물체로부터 유기된 캘러스가 기탁번호 KCTC18689P로 기탁된 것인 식물체.
제1항의 감국 신품종 '한택' 식물체의 부분체.
서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 구절초, 마키노국화, 감국, 제주감국 및 개미취로부터 제1항의 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트.
삭제
감국 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 구절초, 마키노국화, 감국, 제주감국 및 개미취로부터 제1항의 감국 신품종 '한택' 식물체의 판별방법.