KR20100021834A

KR20100021834A - Ｓｔｓ 프라이머를 이용한 인삼 품종 판별 방법

Info

Publication number: KR20100021834A
Application number: KR1020080080459A
Authority: KR
Inventors: 방경환; 김영창; 김옥태; 정지웅; 차선우; 이제완
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2008-08-18
Publication date: 2010-02-26
Also published as: KR101073000B1; CN101654709A; CN101654709B

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 8로 표시된 4개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 STS (Sequence Tagged Site) 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 인삼 품종을 판별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 4종의 STS 핵산표지인자를 이용하여 인삼 5 품종을 확실하게 구분할 수 있어, 품종의 지적재산권 보호를 위한 품종 보증 표지자로 사용할 수 있는 것이다.

인삼, 품종, 판별, Genomic DNA 라이브러리, STS 프라이머

Description

ＳＴＳ 프라이머를 이용한 인삼 품종 판별 방법{Method of discriminating ginseng cultivars using STS primers}

본 발명은 STS 프라이머를 이용한 인삼 품종 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인삼 5 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 및 선풍을 판별하기 위한 STS 핵산표지인자 개발에 관한 것으로, 인삼의 염기서열 정보를 바탕으로 STS 프라이머를 제작한 후 이들 프라이머를 사용하여 품종 간의 유전양상을 분석하여 품종을 명확하게 구분할 수 있는 기반 기술 개발에 관한 것이다.

세계 인삼속의 식물은 약 12종 이상이 보고되었으며, 이중 Panax ginseng C. A. Meyer (Oriental ginseng), P. quinquefolium L. (American ginseng) 및 P. notoginseng (Burkill) F.H. Chen (Sanchi)의 3종이 주로 한약재로 사용되고 있다. 한편, P. ginseng은 한국, 중국, 일본, 러시아 등지에서, P. quinquefolium L.은 미국, 캐나다, 중국에서, P. notoginseng (Burkill) F.H. Chen은 중국에서 주로 재배되고 있는데, 아주 오래전부터 여러 병 등의 예방과 치료의 목적으로 이용되었고, 최근 항산화작용, 항피로, 항암 등 다양한 기능성이 계속 보고됨에 따라 인삼의 주산지인 아시아와 북아메리카뿐만 아니라 유럽과 오세아니아에서도 재배되고 있다.

국내에서 인삼 재배는 주로 지역 재래종인 자경종에 의존하여 왔으나, KT&G(구 한국인삼연초연구원)에서 체형이 우수하고, 수량 또는 진세노사이드 함량이 높으며, 병해충에 강한 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍 등 인삼 품종들이 개발되어 선도농가를 중심으로 재배가 확대되고 있는 추세이다. 이들 개발된 품종은 육종 전문가에 의해서 지상부의 형태적인 특성(열매색, 줄기색, 출아기 등)에 따라 구별이 가능하나 주 이용부위인 뿌리로는 분간이 불가능하여, 외국산 수삼 및 제품의 국내산 둔갑으로 인한 유통시장 혼란, 인삼 재배 시 품종 간 혼입으로 인한 순도 저하 등의 국내외 심각한 사회적 문제를 일으킬 가능성이 상재되어 있다.

최근 외국에서는 국가별 주요 관심 작물(오이, 토마토, 유채, 밀 등)을 대상으로 품종의 구별, 안정성 검정 및 품종보호의 목적으로 핵산표지인자를 개발하고 있으며, 국내에서도 벼 등의 주곡작물, 고추 등의 채소작물, 버섯류, 소의 다양한 분야에서 핵산표지인자 개발에 관한 연구가 진행 중에 있으나, 국내에서는 아직까지 버섯에서 분자기법에 의한 유전양상만을 품종심사의 법적 과정인 DUS (distinctness, uniformity, stability) 검정의 특성항목으로 인정하고 있다.

인삼의 품종을 구별하기 위한 수단으로 DNA 수준에서 표식자를 개발하기 위한 연구가 진행되어 왔는데, 주로 RAPD(random amplified polymorphic DNA), ISSR(inter simple sequence repeat), ITS(internal transcribed spacer) 등의 임의의 프라이머를 이용하여 국내에서 육성된 품종을 구분하고자 시도하였으나, 이들 기법으로는 품종 간 구분에 한계를 나타내었다.

본 발명자들이 보고한 문헌[In & Kim et al (2005), Genetic relationships of Panax species by RAPD and ISSR analyses, Korean Journal of Medicinal Crop Science, 13, 249-253]에서도, 고려인삼 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍과 국내외 수집종인 자경종, 황숙종, 미마끼, 석주삼, 죽절삼(P. japonicus), 미국삼을 대상으로 RAPD와 ISSR 기법을 이용하여 이들의 유연관계 및 유전양상을 분석하였으나, 이들 기법을 이용하였을 시 품종 간 구분이 힘들었다. 이러한 결과는 임의의 프라이머를 이용하는 기법의 특성으로, 실험결과의 재현성이 낮고 품종 간 다형성을 찾더라도 유전정보의 획득에 제한이 있어 구별성, 재현성 및 안정성을 확보해야 하는 품종의 표지자로 이용하기에는 적합하지 않은 문제가 있다.

다른 문헌[Yang et al (2001), Comparison of ITS and 5.8S rDNA sequences among varieties and cultivars in Panax ginseng, Journal of Photoscience, 8, 55-60]에서는, 고려인삼 품종인 천풍, 연풍과 수집종인 자경종, 청경, 황숙종의 ITS와 5.8S rDNA 염기서열을 비교 분석한 바, 황숙종이 다른 종들과 구분되는 단일염기서열 다형성(Single nucleotide polymorphism)을 나타낸다고 하였다. 한편, 본 발명자들의 문헌[Kim & Bang et al (2007), Molecular authentication of ginseng cultivars by comparison of internal transcribed spacer and 5.8S rDNA sequences, Plant Biotechnology Report, 1, 163-167]에서는, 고려인삼 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍과 국내외 수집종인 자경종, 황숙종, 미마끼, 석주삼, 죽절삼, 미국삼의 ITS와 5.8S rDNA 염기서열과 단일염기서열 다형성 부위를 인식하는 제한효소 TaqⅠ을 처리하여 유전양상을 비교 분석한 바, 고풍과 금풍만이 다른 품종 및 국내외 수집종 들과 구분됨을 보고 하였다.

하지만 이들 방법만으로는 개발된 인삼 품종들을 명확하게 구별하기 어려운 단점이 있었다.

한국특허등록 제10-0215084호에는 RAPD 표식에 의한 고려인삼의 산지 판별방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2004-0034331호에는 단일염기다형성을 이용한 산삼과 재배인삼의 판별방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0610312에는 인삼의 종간 유전자 감별 키트가 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머 세트와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 임의 프라이머를 이용하는 RAPD, ISSR 기법과 염기서열 보존적인 ribosomal DNA 부위를 분석하는 ITS 기법이 지니는 구별성 및 재현성의 문제를 해결하기 위하여, 인삼 기준 품종(연풍)의 DNA를 대상으로 유전자 클로닝과 형질전환 방법을 이용하여 게놈 DNA 라이브러리를 구축하고, 특정 클론들을 선발하며 이들 클론들을 대상으로 염기서열 분석을 수행하여 이들 유전정보를 바탕으로 STS 프라이머를 제작한 후, 이들 프라이머를 사용하여 품종별 시료를 대상으로 PCR 한 후 아가로스 겔에서 전기영동 하여 나타나는 유전패턴들을 종합하여 인삼 천풍 등 주요 5 품종을 구분하는 것으로 안정성과 재현성이 높은 품종 판별 시스템을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 8로 표시된 4개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 STS (Sequence Tagged Site) 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 인삼 품종을 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 인삼 5 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍, 선풍을 개발된 4종의 STS 프라이머를 이용하여 이들의 유전양상으로 확실하게 구분할 수 있어, 품종 보증을 위한 핵산표지인자로 활용이 가능하여 국내 우수 품종 개발자 및 보급자의 대외 지적재산권을 행사하는데 큰 도움이 될 수 있을 것이다. 또한, 인삼재배 시 혼종 및 가공품 제조 시 외국산 수삼의 국내산 둔갑 등으로 야기될 수 있는 유통시장의 혼란을 바로잡기 위한 기반기술로 이용 가능하고, 인삼 육종 시 품종의 유전적 안정성 (순도)을 높이는 데 활용할 수 있어 품종 혼입을 방지하여 순도 높은 종자를 농가에 보급하는 사업에도 활용할 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 8로 표시된 4개 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 STS (Sequence Tagged Site) 프라이머 세트를 제공한다.

상기 올리고뉴클레오티드는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 각각 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열 내 의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 각각 서열번호 7 및 서열번호 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 인삼 품종 판별용 STS (Sequence Tagged Site) 프라이머 세트이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 STS 프라이머 세트이다.

4개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 인삼 품종을 비교적 쉽고 정확하게 분별할 수 있다.

상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 선풍(Sunpoong)일 수 있으며, 본 발명의 인삼 품종 판별용 STS 프라이머 세트는 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 기준 품종(연풍)을 대상으로 유전자 클로닝 방법을 이용하여 게놈 (Genomic) DNA 라이브러리를 구축하고, 특정 클론들을 선발하며 이들 클론들을 대상으로 염기서열 분석을 수행하여 이들 유전정보를 바탕으로 STS 프라이머를 제작하였다. 상기한 바와 같이, 소위 'active genome region-enriched semi-genomic DNA library'를 구축하였으며, 이 과정을 통하여 특정 크기 (0.6-1.3kb)의 클론들을 선발되었고, 염기서열 분석된 클론들의 유전정보로부터 다양한 STS 프라이머들이 제작되었다.

상기와 같은 방법에 의해 제공되는 STS 프라이머 들은 본 발명에 의해 처음으로 개시되는 것이다.

제작된 프라이머들을 이용하여 품종별 시료를 대상으로 PCR 한 후 아가로스 겔에서 전기영동 하여 나타나는 유전적 다형성을 관찰하였는데, 이를 통하여 품종 간 다형성을 보이는 2종의 STS 프라이머(KGY+0130A, KGY+0183A)가 선발되었다. 또한 이들 PCR 생성물을 대상으로 6종의 제한효소를 처리하여 품종 간 다형성을 확인하였는데, 이를 통하여 또 다른 2종의 STS 프라이머(KGY+0110A, KGY-0074)에서 품종 간 다형성이 관찰되었다.

상기한 바와 같이 본 발명에 따라 개발된 4종의 STS 핵산표지인자를 이용하면 지금까지 구분하지 못했던 국내 인삼 5품종을 명확하게 구분할 수 있어, 품종 판별의 기반 기술로 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점 으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 선풍(Sunpoong)일 수 있다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인삼 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 인삼 품종의 판별 방법은 보다 구체적으로, 기준 품종(연풍)을 대상으로 유전자 클로닝 방법을 이용하여 게놈 (Genomic) DNA 라이브러리를 구축하고, 특정 클론들을 선발하며 이들 클론들을 대상으로 염기서열 분석을 수행하여 이들 유전정보를 바탕으로 STS 프라이머를 제작하는 단계;

제작된 프라이머를 사용하여 품종별 시료를 대상으로 PCR 하여 아가로스 겔에서 전기영동한 후 품종 간 유전적 다형성을 분석하는 단계;

제작된 프라이머를 사용하여 품종별 시료를 대상으로 PCR 하여 아가로스 겔에서 전기영동한 후 monomorphic band로 확인된 경우는, AluI 등 총 6개의 제한효소를 처리하여 반응 후 아가로스 겔에서 전기영동 하여 품종 간 유전적 다형성을 분석하는 단계; 및

상기 유전분석 단계의 결과로부터 품종 간 대립유전자를 종합 판단하여 구별하는 것을 특징으로 하는 인삼 천풍 등 주요 5 품종의 판별방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합 효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 선풍(Sunpoong)일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

< 실시예 1>

농촌진흥청 작물과학원 인삼약초연구소 인삼 포장에서 재배 중인 기준 품종 연풍의 어린잎으로부터 추출된 DNA 1㎍을 methylation에 둔감한 제한효소인 SpeI으로 절단하였다. 절단 산물은 아가로스겔에 전기 영동하여 PCR 정제 키트 (Qiagen) 를 이용하여 DNA를 회수한 후 준비된 pGEM_7zf(Promega)와 라이게이션시켰다. 라이게이션된 혼합물은 야생형의 Mcr A 및 BC 유전자를 지니는 대장균(Stratagene)에 전기천공법으로 형질전환하여 소위 'active genome region-enriched semi-genomic DNA library'를 구축하였는데, 이를 통하여 총 2,039개의 클론이 확보되었다.

< 실시예 2>

확보된 클론들의 염기서열 분석은 (주)솔젠트에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 염기서열을 바탕으로 STS 프라이머를 합성하였는데, 상기 확보된 클론은 0.6kb~1.3kb 크기의 총 343 개 클론으로서, 이를 통하여 총 262쌍의 STS 프라이머 조합을 제작하였다.

< 실시예 3>

인삼 품종 간 다형성을 관찰하기 위하여 수행한 PCR 반응 혼합물(50 ㎕)의 조성은 다음과 같다: 인삼의 게놈 DNA 20 ng, 각 프라이머 0.4 μM, dNTPs 250 μM, 10x PCR 반응 완충용액(75mM Tris-HCl pH 9.0, 2.5mM MgCl₂, 15mM (NH₄)₂SO₄, BSA 100㎍/ml), 0.5 unit DNA 중합효소 및 나머지 증류수. 합성된 STS 프라이머 조합들의 효율적인 이용과 비특이적 증폭 산물의 과도한 출현을 억제하기 위하여 55~65℃의 어닐링 온도 범위에서 PCR을 수행한 후 적정 프라이머 Tm 값을 정하였다. 그 결과 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 95℃에서 30초간 변성; 65℃에서 30 초간 어닐링; 및 72℃에서 1분간 연장을 총 40 사이클로 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 연장하는 것이 특이적인 증폭 산물을 나타내었다.

제작된 STS 프라이머를 이용하여 인삼 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 및 선풍의 DNA를 대상으로 PCR한 후 아가로스겔에서 전기영동 하여 품종 간 다형성을 확인하였으며, 한편 PCR한 후 monomorphic DNA 밴드가 관찰되면 다형성을 확보하기 위하여 AluI 등 총 6개의 제한효소를 처리하여 전기영동하고 절단 산물의 크기를 100 bp 크기 마커에 의해 측정하여 기록하고, 제한효소를 적용하기 전에 미리 증폭산물 중 'target band'를 지정하였다. 절단 산물들의 크기의 합이 이 target band와 반드시 일치할 때만 분석하여 재현성이 떨어지는 minor band가 절단되어 나타나는 다형성과 구분하였다.

실험 결과, 인삼 5 품종을 판별할 수 있는 STS 프라이머 4조합 (KGY+0130A, KGY+0183A, KGY+0110A, KGY-0074)이 선발되었는데, 이 중 2 조합 (KGY+0130A, KGY+0183A)은 PCR한 후 아가로스겔에서 전기영동 결과 확인 시 품종 간 다형성이 관찰되었고, 나머지 2조합 (KGY+0110A, KGY-0074)은 PCR 산물인 monomorphic band를 HinfⅠ의 제한효소로 처리하였을 때 다형성을 나타냈다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, KGY+0130A 프라이머를 이용하여 PCR 하였을 때 천풍, 고풍, 금풍은 약 370bp 크기에서 DNA가 증폭되어 이를 A의 유전양상으로 표시하였고, 연풍과 선풍은 약 320bp 크기에서 DNA가 증폭되어 이를 다른 B의 유전양상으로 다형성을 나타내었다.

도 2에서는 KGY+0183A 프라이머를 이용하였을 때는 천풍이 약 250bp 크기에 서 DNA가 증폭되어 A의 유전양상으로 표시하였고, 연풍과 선풍은 약 280bp 크기에서 DNA가 증폭되어 B의 유전양상으로, 고풍은 220bp 크기에서 DNA가 증폭되어 C의 유전양상으로, 금풍은 300bp 크기에서 DNA가 증폭되어 D의 유전양상으로 다형성을 나타내었다.

한편, 도 3에서는 PCR 생성물을 HinfⅠ의 제한효소를 처리하였을 때 천풍과 고풍은 HinfⅠ의 제한효소 인식부위가 있어 420bp와 80bp 크기의 잘려진 두개의 DNA 밴드가 관찰되어 A의 유전양상으로 표시하였고, 연풍, 금풍, 선풍에서는 제한효소 인식부위가 없어서 500bp 크기의 DNA 밴드가 관찰되어 이를 B의 유전양상으로 다형성을 나타내었다.

도 4에서는 PCR 생성물을 HinfⅠ의 제한효소를 처리하였을 때 천풍과 선풍에서 HinfⅠ의 제한효소 인식부위가 없어서 90bp 크기의 DNA 밴드가 관찰되어 이를 A의 유전양상으로 표시하였고, 연풍, 고풍, 금풍에서는 제한효소 인식부위가 있어 50bp와 40bp 크기의 잘려진 두개의 DNA 밴드가 관찰되어 B의 유전양상으로 다형성을 나타내었다.

상기의 내용을 종합하여 도 5에서 표시된 바와 같이, 천풍은 AAAA, 연풍은 BBBB, 고풍은 ACAB, 금풍은 ADBB, 선풍은 BBBA의 유전양상으로 다형성을 표현하였다. 한편, 이들 4종의 선발된 프라이머의 염기서열 및 Tm 값에 관한 정보를 하기 표 1에 기재하였는데, 결론적으로 총 4종의 STS 프라이머 조합을 이용한 유전양상으로 인삼 천풍 등 5 품종을 확실하게 구분할 수 있었다.

표 1. 본 발명의 STS 프라이머 조합

	프라이머	서열(5'-3')	서열번호	Tm(℃)
1	KGY+0130A	^aF-GGAAAGCGTTCAGCTCTTACG	1	65
		^bR-TAAATGCTGTCAAGCCCAGAG	2
2	KGY+0183A	F-GAATTGACCCTTTGCCTTTG	3	65
		R-AAAGCCTACGTTAGCGCATC	4
3	KGY+0110A	F-AGTCCCAACGGAATTTCATC	5	65
		R-GTTTTCCGCTTATGTTGCAG	6
4	KGY-0074	F-GCGAATTTCACAGAATTAGACG	7	65
		R-ACAGGTCTCGAAACAATTGAAG	8

^aF: 정방향 프라이머, ^bR: 역방향 프라이머

우리나라의 2007년도 인삼 재배면적은 17,831ha, 생산량은 21,819톤으로 이중 품종은 약 1,000ha로 적은 면적이 재배되고 있는데, 그 이유는 2002년도에 인삼 최초 품종인 천풍이 등록되었고 증식률이 10배로 타작물에 비해 매우 낮기 때문이다. 하지만 재래종과 비교하여 품종의 우수성이 최근 입증됨에 따라 점차 재배면적은 증가하고 있는 실정이며 앞으로도 확대될 전망이다.

인삼 품종은 재래종인 자경종과 황숙종의 모집단에서 선발육종을 통해 육성된 것으로 유전적으로 유사도가 높아 구분이 쉽지 않고, 더불어 관행의 식별 방법으로는 품종의 구별이 불가능하여 판별기술의 실용화가 이루어지지 않고 있는 실정이다.

이러한 문제를 해결하기 위해 개발된 인삼 품종 보증용 STS 핵산표지인자 4종은 실험결과의 재현성과 안정성이 높아 인삼 천풍 등 5 품종의 구분이 명확하고, PCR 및 아기로스겔을 이용하여 품종 간 유전양상을 간단히 구별할 수 있는 방법이어서 기술이전 또한 용이하다. 이러한 판별 기술은 인삼을 주 작목으로 연구하는 각 도 농업기술원 및 농업기술센터에서 즉시 적용이 가능하여, 농가에 순도가 보장 된 인삼 품종의 조기 보급 체계 구축에 활용 가능하다. 또한 산업체에서 홍삼 등 원료의 정확성을 판별하는 용도에도 충분한 시장성이 있어, 소비자의 제품 신뢰 향상으로 인한 유통시장 질서를 정립하기 위한 기반기술로도 활용 가능하다고 판단된다.

도 1은 STS 프라이머 KGY+0130A를 이용하여 인삼 5 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 및 선풍을 대상으로 PCR 하여 아가로스 겔에서 품종 간 다형성을 확인한 그림이다. 레인 M: 1 Kbp plus 100 bp DNA Ladder Marker(Elpis Biotech), 레인 1: 천풍(Chunpoong), 레인 2: 연풍(Yunpoong), 레인 3: 고풍(Gopoong), 레인 4: 금풍(Kumpoong), 레인 5: 선풍(Sunpoong).

도 2는 STS 프라이머 KGY+0183A를 이용하여 인삼 5 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 및 선풍을 대상으로 PCR 하여 아가로스 겔에서 품종 간 다형성을 확인한 그림이다. 레인 M: 1 Kbp plus 100 bp DNA Ladder Marker(Elpis Biotech), 레인 1: 천풍(Chunpoong), 레인 2: 연풍(Yunpoong), 레인 3: 고풍(Gopoong), 레인 4: 금풍(Kumpoong), 레인 5: 선풍(Sunpoong).

도 3은 STS 프라이머 KGY+0110A를 이용하여 인삼 5 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 및 선풍을 대상으로 PCR 한 후 PCR 산물을 제한효소 HinfⅠ으로 처리하여 아가로스 겔에서 품종 간 다형성을 확인한 그림이다. 레인 M: 1 Kbp plus 100 bp DNA Ladder Marker(Elpis Biotech), 레인 1: 천풍(Chunpoong), 레인 2: 연풍(Yunpoong), 레인 3: 고풍(Gopoong), 레인 4: 금풍(Kumpoong), 레인 5: 선풍(Sunpoong).

도 4는 STS 프라이머 KGY-0074를 이용하여 인삼 5 품종인 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 및 선풍을 대상으로 PCR 한 후 PCR 산물을 제한효소 HinfⅠ으로 처리하여 아가로스 겔에서 품종 간 다형성을 확인한 그림이다. 레인 M: 1 Kbp plus 100 bp DNA Ladder Marker(Elpis Biotech), 레인 1: 천풍(Chunpoong), 레인 2: 연풍(Yunpoong), 레인 3: 고풍(Gopoong), 레인 4: 금풍(Kumpoong), 레인 5: 선풍(Sunpoong).

도 5는 도 1 내지 도 4에서 확인된 대립유전자의 차이를 판단하여 5 품종의 유전 양상을 종합적으로 나타낸 그림이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method of discriminating ginseng cultivars using STS primers <130> PN08144 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 ggaaagcgtt cagctcttac g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 taaatgctgt caagcccaga g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 gaattgaccc tttgcctttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 aaagcctacg ttagcgcatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 agtcccaacg gaatttcatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 gttttccgct tatgttgcag 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 gcgaatttca cagaattaga cg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 acaggtctcg aaacaattga ag 22

Claims

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 인삼 품종 판별용 STS (Sequence Tagged Site) 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 인삼 품종 판별용 STS 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 선풍(Sunpoong)인 것을 특징으로 하는 인삼 품종 판별용 STS 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 인삼 품종 판별용 STS 프라이머 세트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프 라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 인삼 품종을 판별하기 위한 키트.
제5항에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 선풍(Sunpoong)인 것을 특징으로 하는 키트.
인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 인삼 품종의 판별 방법.
제7항에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍(Chunpoong), 연풍(Yunpoong), 고풍(Gopoong), 금풍(Kumpoong), 선풍(Sunpoong)인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.