CN109652579B - 水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用。水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记包括位于水稻第6号染色体第10389729～10389747bp处，多态性为5’‑CAGGAATCTCAGATGG‑3’/5’‑TGTTATTCTCAGGTATTAT‑3’和位于水稻第6号染色体第10452027bp处，多态性为A/G的分子标记。本发明提供的分子标记能够将Pi2与其它复等位基因进行有效鉴别，具有高度的特异性和准确性；本发明提供的Pi2基因型的检测方法通过扩增产物的电泳条带判定待测水稻材料的Pi2基因型，无需酶切，成本低廉，有利于缩短水稻的育种周期，降低育种成本。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与 应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用。

背景技术

水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，近一半以上的人口以稻米作为主食。稻瘟病是水稻生产中最为严重的病害之一，给水稻安全生产造成了重大威胁。长期的生产实践表明，培育水稻抗性品种或种质是防治稻瘟病的有效措施之一。然而，由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植3～5年时间后逐渐丧失，因此，挖掘和利用光谱抗性基因是获得持久抗性品种的重要途径。近几十年来，已定位或克隆了诸多抗稻瘟病基因，同时分子标记技术的发展与应用极大促进了分子标记辅助选择及聚合育种技术在水稻抗稻瘟病品种选育中的应用。在已经克隆的抗稻瘟病基因中，诸多基因成簇分布或为复等位基因，基因之间序列高度同源，导致一些连锁标记难以甄别各种水稻材料的功能抗病基因。因此，基于基因序列或功能位点开发特异性的分子标记不仅使得检测的可靠性更高，还可有效加快育种进程。

目前，在抗稻瘟病Pi2/9(LOC_Os06g17900)位点已克隆了多个稻瘟病抗性基因，如Pi2、Pi9、Pizt。研究表明，来源于供体材料C101A51的Pi2基因对792个生理小种中的绝大部分均可表现出抗性，此外，C101A51还对来自不同生态区的36个稻瘟病株表现出抗性。目前针对抗稻瘟病基因Pi2已开发出一些基于PCR技术与Pi2连锁标记或基于Pi2基因的CAPS或dCAPS标记等，这些标记为Pi2在分子育种中提供了方便，但也存在诸多不足，如连锁标记易出现重组交换、dCAPS或CAPS标记检测手段较为繁琐、检测成本相对较高等，限制了Pi2基因在抗稻瘟病品种选育中的高效利用。为了更为准确高效地将Pi2基因应用到水稻抗稻瘟病育种工作中，开发准确、有效、易于检测的Pi2的特异性分子标记具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用。

本发明通过对抗稻瘟病水稻材料C101A51(Pi2)、Toride-1(Pizt)、75-1-127(Pi9)以及Nipponbare、9311等水稻材料进行基因组重测序及序列的比对分析，在Pi2基因序列中发现了两处特异核苷酸序列，分别为:

(1)位于Nipponbare水稻第6染色体第10389729～10389747bp处，其中Pi2为5’-CAGGAATCTCAGATGG-3’，其余等位为5’-TGTTATTCTCAGGTATTAT-3’；

(2)在Pi2基因下游，位于Nipponbare第6染色体第10452027bp处的SNP位点，其中Pi2为A，其余等位为G(Nipponbare基因组版本号为IRGSP1.0，第6染色体GenBank登录号为AP014962.1)。

本发明针对这两处特异核苷酸序列开发了高效、准确鉴定Pi2基因型的共显性分子标记以及检测抗稻瘟病基因Pi2的基因型的方法，通过检测位于水稻第6染色体第10389729～10389747bp处的核苷酸序列和位于水稻第6染色体第10452027bp处的SNP位点的核苷酸序列，判断待测水稻抗稻瘟病基因Pi2的基因型。如水稻第6染色体第10389729～10389747位的核苷酸序列为5’-CAGGAATCTCAGATGG-3’，则待测水稻携带抗稻瘟病基因Pi2，表现为抗稻瘟病表型；如第6染色体10389729～10389747位的核苷酸序列为5’-TGTTATTCTCAGGTATTAT-3’，则待测水稻不携带抗稻瘟病基因Pi2；如第6染色体10452027位的核苷酸序列为A，则为待测水稻携带抗稻瘟病基因Pi2，表现为抗稻瘟病表型；如第6染色体10452027位的核苷酸序列为G，则待测水稻不携带抗稻瘟病基因Pi2。

首先，本发明提供水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记，其包括如下分子标记的一种或两种：

(1)位于水稻第6号染色体第10389729～10389747bp处，多态性为5’-CAGGAATCTCAGATGG-3’/5’-TGTTATTCTCAGGTATTAT-3’；

(2)位于水稻第6号染色体第10452027bp处，多态性为A/G。

基于上述分子标记，为实现抗稻瘟病基因Pi2基因型的高效检测，本发明提供用于检测所述分子标记的引物。

具体地，所述引物包括如下(1)、(2)的一种或两种：

(1)正向引物1：Pi2-RF:GATGCTGCAGGTATCTCAGTTG；

反向引物1：Pi2-RR:GGTCGTGATACCTTCGGTCA；

(2)正向引物2：Pi2-SF:GCATGTTATGTTTGGAAGTAGCC；

反向引物2：Pi2-SR:CATGTCTCGATAATTAGGAATCGC。

进一步地，本发明提供一种水稻抗稻瘟病Pi2基因检测试剂盒，其包括本发明所述的用于检测所述水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记的引物。

优选地，所述试剂盒还包括Mg²⁺、DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和dNTPs。

进一步地，本发明提供所述的分子标记或所述的引物或所述的试剂盒的如下任意一种的应用：

(1)抗稻瘟病Pi2基因检测；

(2)水稻抗稻瘟病性状检测；

(3)水稻抗稻瘟病分子辅助育种；

(4)水稻种质资源改良。

基于上述分子标记和引物，本发明提供一种检测水稻抗稻瘟病Pi2基因的方法：以待测水稻的基因组为模板，利用所述引物或所述试剂盒进行PCR扩增，分析扩增产物的序列。

本发明中，分析扩增产物的序列可以采用本领域常用的方法，如直接测序法、芯片或质谱鉴定等。

为实现低成本、高效率的检测，优选地，所述分析扩增产物的序列为将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列。

本发明中，所述检测水稻抗稻瘟病Pi2基因的方法包括如下步骤：

(1)提取待测水稻的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用所述引物或所述试剂盒进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列；

所述判断扩增产物的序列的标准如下：当扩增产物为550bp条带时，待测水稻为Pi2抗稻瘟病等位基因纯合基因型；当扩增产物为384bp条带时，待测水稻不携带Pi2抗稻瘟病等位基因；当扩增产物为550bp和384bp两种带型时，待测水稻为Pi2等位杂合基因型。

本发明中，Pi2等位杂合基因型为含有Pi2等位基因与其它感病或抗病等位基因的杂合基因型。

上述方法中，步骤(2)的PCR扩增的反应条件为：94℃～98℃预变性3～10分钟；94℃～98℃变性10～30秒，52℃～55℃退火10～30秒，72℃延伸30～60秒，共25～35个循环；72℃延伸3～10分钟。

上述方法中，步骤(2)的PCR扩增的反应体系(10μL)如下：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM dNTP 0.8μL，4条检测引物(10μM)各0.15μL，DNA聚合酶0.1μL，DNA模板2μL，以水补足至10μL。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的水稻抗稻瘟病Pi2基因的共显性分子标记基于Pi2基因内部和基因下游的特异核苷酸序列开发，该分子标记为Pi2基因特异的分子标记，能够将Pi2与其它所有等位基因进行有效鉴别，具有高度的特异性和准确性；

(2)本发明提供的分子标记的检测方法，能够通过扩增产物的电泳条带判定待测水稻材料的Pi2基因型，无需酶切，成本低廉、方便快捷；

(3)利用本发明提供的分子标记及其检测方法进行水稻分子辅助育种，能够实现子代Pi2基因型的准确、高效、快速检测，同时实现水稻生长早期的非破坏性检测，适于商业化大规模育种中对Pi2基因型的大量检测以及对水稻种质资源中Pi2等位基因型的鉴定。

附图说明

图1为本发明实施例1中部分水稻材料在Pi2等位的目标位点的序列比对结果图。

图2为本发明实施例1中部分水稻材料在Pi2等位的目标位点的序列比对结果图。

图3为本发明实施例4中利用Pi2共显性分子标记的检测引物对不同的水稻育种亲本材料进行检测的电泳结果图，其中，M为DNA marker，泳道1-30依次为：C101A51，华占，特青，9311，CO2，Mf63，海水稻，华润2号，成恢19，广东竹稻，徽粳602，江苏粳-2，浙粳75，象牙香占，辽盐287，绵恢3728，热粳35，玉珍香，盐稻1531，龙稻9号糯，丰玉占，IR64，IR29，R1206，R1128，沪粳5，R6444，镇稻819，Fukuniski，农香18号的扩增产物的电泳结果；各材料所属基因型标注于对应泳道上方，S代表其余等位基因型，R代表含有抗稻瘟病Pi2等位基因，H代表Pi2等位基因和其余等位基因型的杂合基因型。

图4为本发明实施例5中利用Pi2共显性分子标记的检测引物对水稻杂交的F2分离群体进行检测的电泳结果图，其中，M为DNA marker，泳道1、2分别为含抗稻瘟病基因Pi2的亲本华占和感病亲本9311，泳道3-34为利用两亲本构建F2群体的单株；各材料所属基因型标注于对应泳道上方，S代表其余等位基因型，R代表含有抗稻瘟病Pi2的抗病基因型，H代表Pi2抗病等位基因和其余等位基因的杂合基因型。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用的水稻材料均为可从商业途径或国家种质库得到或为本领域技术人员广泛推广使用的材料。

实施例1水稻抗稻瘟病Pi2基因共显性分子标记的开发

水稻抗稻瘟病基因Pi2位于水稻的第6号染色体上，通过对Pi2基因及其复等位基因Pi9、Piz-t供体水稻亲本材料C101A51、Toride-1、75-1-127、谷梅4号、kasalath、638S、02428、华占、Nipponbare、9311等二十余个水稻材料进行基因组重测序，并利用DNAMAN等软件进行序列比对分析，在Pi2基因序列中发现一段特异核苷酸序列(位于Nipponbare水稻第6染色体第10389729～10389747bp处)，其中Pi2为5’-CAGGAATCTCAGATGG-3’，其余等位为5’-TGTTATTCTCAGGTATTAT-3’(部分水稻材料的序列比对结果如图1所示)；此外在Pi2基因下游(位于Nipponbare水稻第6染色体第10452027bp处)发现一特异SNP位点，其中Pi2为A，其余等位为G(部分水稻材料的序列比对结果如图2所示)。针对这两处特异核苷酸序列开发了Pi2基因的共显性分子标记。

实施例2Pi2基因共显性分子标记的检测引物设计

针对实施例1开发的两个Pi2基因特异性分子标记设计检测引物，引物设计原理如下：

首先设计扩增Pi2抗病等位特异性引物，以Pi2基因内特异核苷酸序列5’-CAGGAATCTCAGATGG-3’为引物3’端设计上游引物Pi2-RF(为提高引物特异性及优化扩增效果，进行个别碱基替换)，再在其下游设计反向引物Pi2-RR。引物Pi2-RF与Pi2-RR只能特异性扩增Pi2等位，产生一条550bp条带，而其余等位无条带；

然后设计扩增其余等位基因的特异性引物，以Pi2基因下游特异SNP位点中G互补的C碱基为3’端设计反向引物Pi2-SR，并在3’端第2位引入错配碱基以增强特异性，再在其上游设计与之匹配的正向引物Pi2-SF，引物Pi2-SF与Pi2-SR只能特异性扩增除Pi2之外的等位产生一条384bp的条带，而扩增Pi2等位时无条带。

上述Pi2基因的检测引物序列如表1所示，Pi2-RF、Pi2-RR、Pi2-SF和Pi2-SR四条引物组成Pi2的共显性分子标记的检测引物组，采用Pi2-RF、Pi2-RR、Pi2-SF和Pi2-SR四条引物扩增，当扩增产物只有550bp条带时，待测水稻品种为Pi2等位基因纯合基因型；当扩增产物只有384bp条带时，待测水稻品种不携带Pi2等位基因；当扩增产物有550bp和384bp两种条带时，待测水稻为Pi2等位杂合基因型。

表1 Pi2特异性分子标记的检测引物序列及其扩增的相关参数

实施例3水稻抗稻瘟病基因Pi2特异性分子标记检测方法的建立

根据实施例2设计的Pi2两个分子标记的检测引物，设计PCR的反应程序和反应体系，经过不断优化，确定如下反应程序和体系：

PCR反应体系(10μL)：记为：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM dNTP 0.8μL，4条引物(10μM)均为0.15μL，Taq DNA聚合酶0.1μL；DNA模板2μL，双蒸水补足余量。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。

实施例4Pi2特异性分子标记在检测水稻育种亲本材料中的应用

(1)生物材料

Pi2供体材料C101A51，华占，特青，9311，CO2，Mf63，海水稻，华润2号，成恢19，广东竹稻，徽粳602，江苏粳-2，浙粳75，象牙香占，辽盐287，绵恢3728，热粳35，玉珍香，盐稻1531，龙稻9号糯，丰玉占，IR64，IR29，R1206，R1128，沪粳5，R6444，镇稻819，Fukuniski，农香18号。

(2)水稻基因组DNA的提取及引物合成

采用CTAB法提取上述水稻材料的基因组DNA并合成如表1所示的引物序列，具体为：

Pi2-SR:CATGTCTCGATAATTAGGAATCGC

Pi2-SF:GCATGTTATGTTTGGAAGTAGCC

Pi2-RF:GATGCTGCAGGTATCTCAGTTG

Pi2-RR:GGTCGTGATACCTTCGGTCA

(3)PCR扩增及电泳检测

PCR的反应体系和反应程序如实施例3所述。PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

(4)结果分析

PCR扩增产物的电泳结果如图3所示，泳道1-30依次为：C101A51，华占，特青，9311，CO2，Mf63，海水稻，华润2号，成恢19，广东竹稻，徽粳602，江苏粳-2，浙粳75，象牙香占，辽盐287，绵恢3728，热粳35，玉珍香，盐稻1531，龙稻9号糯，丰玉占，IR64，IR29，R1206，R1128，沪粳5，R6444，镇稻819，Fukuniski，农香18号的扩增产物电泳结果。从电泳结果可以看出，水稻育种亲本材料中的华占、CO2、象牙香占以及R1206均扩增出与Pi2供体材料C101A51相同的条带，说明均含有Pi2抗病等位基因，同时对这些基因标记位点进行测序，测序结果与电泳结果一致，证明本发明提供的引物能够准确鉴定抗稻瘟病基因Pi2的基因型，可实现高效准确的水稻品种资源的筛选。

实施例5水稻抗稻瘟病基因Pi2在F2分离群体中的单基因分离检测

(1)生物材料

以含抗稻瘟病基因Pi2的亲本华占为父本，感病亲本9311为母本，进行杂交，在构建的F2群体中的随机选取的100个F2单株。

(2)基因组DNA提取及PCR检测

基因组DNA提取及PCR检测方法同实施例4。

(3)结果分析

对100个单株的基因型进行检测，结果表明，3种不同基因型的分离比为20SS:58H:22RR，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ²＝2.64<χ² _0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离，采用分子标记进行检测的基因型结果与测序结果一致，部分检测的电泳结果如图4所示，其中，泳道1、2分别为含抗稻瘟病基因Pi2的亲本华占和感病亲本9311，泳道3-34为利用两亲本构建F2群体的单株，各材料所属基因型标注于对应泳道上方，S代表感病等位基因型，R代表含有抗稻瘟病Pi2等位基因的纯合抗病基因型，H代表Pi2抗病等位基因和感病等位基因的杂合基因型。

本发明提供的抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法，能够实现抗稻瘟病基因Pi2的基因型的高效、准确鉴定，可以用于水稻资源的筛选鉴定，也可用于水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子遗传育种。

上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司 湖南隆平高科种业科学研究院有限公司湖南亚华种业科学研究院 湖南杂交水稻研究中心

<120> 水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用

<130> KHP181118147.2

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgctgcag gtatctcagt tg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtcgtgata ccttcggtca 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatgttatg tttggaagta gcc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgtctcga taattaggaa tcgc 24

Claims (1)

1.一种检测水稻抗稻瘟病Pi2基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测水稻的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增；

（3）将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列；

所述引物为：

（1）正向引物1：

Pi2-RF: 5’-GATGCTGCAGGTATCTCAGTTG-3’；

反向引物1：

Pi2-RR: 5’-GGTCGTGATACCTTCGGTCA-3’；

（2）正向引物2：

Pi2-SF: 5’-GCATGTTATGTTTGGAAGTAGCC-3’；

反向引物2：

Pi2-SR: 5’-CATGTCTCGATAATTAGGAATCGC-3’；

所述判断扩增产物的序列的标准如下：当扩增产物为550 bp条带时，待测水稻为Pi2抗稻瘟病等位基因纯合基因型；当扩增产物为384bp条带时，待测水稻不携带Pi2抗稻瘟病等位基因；当扩增产物为550bp和384 bp两种带型时，待测水稻为Pi2等位杂合基因型。

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