CN107447026B - 一种水稻抗褐飞虱基因bph3基因型鉴定的特异性分子标记引物及其应用 - Google Patents

一种水稻抗褐飞虱基因bph3基因型鉴定的特异性分子标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物及其应用，包括BPH3‑RF、BPH3‑RR、BPH3‑SF、BPH3‑SR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:4所示。该方法以待检测水稻的基因组DNA为模板，用4条引物序列BPH3‑RF、BPH3‑RR、BPH3‑SF、BPH3‑SR进行PCR扩增，如该待测水稻扩增产物大小为348bp的条带，则该待测水稻为含BPH3基因的候选抗褐飞虱水稻。该方法可用于选育抗褐飞虱水稻，缩短抗褐飞虱水稻的育种周期，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短等优点。

Description

一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引 物及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学技术领域，涉及一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物及其应用。
背景技术
水稻作为重要的一种粮食作物，是世界上近一半人口的主食。随着水稻基因组精细遗传图谱和物理图谱的完成，对水稻的研究工作也进入了后基因组时代，全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域，对水稻功能基因的研究也成为水稻科研工作的重要内容，对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。
我国是一个人口大国，粮食安全是我国乃至世界人民面临的挑战。水稻的安全生产直接关系着我国粮食安全问题。目前褐飞虱已经成为我国水稻生产中第一大害虫，对我国粮食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要以化学农药的使用为主，但长期的使用导致褐飞虱的抗药性出现及其他生态破坏问题。众多实践表明，利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是综合防治褐飞虱最为经济有效的方法。
BPH3位于水稻4号染色体短臂上，是由3个基因构成的一个抗性基因簇，其供体亲本来源于RATHU HEENATI，是一个对褐飞虱具有广谱、持久抗性的品种，因此通过开发BPH3特异性分子标记，利用分子标记辅助选择将BPH3抗性等位基因导入到栽培稻品种，对于培育具有广谱抗性的水稻品种具有巨大的利用价值。
等位基因特异性PCR(allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR)是一种基因等位基因特异性引物引导的PCR技术，可以有效的分析单核苷酸(SNP)多态性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物，该引物特异性好，扩增效率高，方法简便易行，可广泛用于水稻抗褐飞虱基因BPH3的基因型鉴定。
本发明的另一个目的是提供了一种水稻抗褐飞虱基因BPH3的特异性分子标记引物在水稻种质资源中BPH3基因型的鉴定或水稻抗褐飞虱基因BPH3的分子育种中的应用，利用该引物可以有效的对水稻中抗、感褐飞虱等位基因BPH3进行基因型鉴定，通过鉴定、筛选新的BPH3抗性基因应用水稻育种与生产，增强现有栽培稻品种褐飞虱抗性。
其技术方案为：
一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物，包括BPH3-RF、BPH3-RR、BPH3-SF、BPH3-SR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。
本发明所述水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物在水稻抗褐飞虱分子育种过程中的应用。
本发明所述水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物在对水稻资源BPH3基因型鉴定或筛选过程中的应用。
进一步，应用过程包括PCR反应：PCR体系以10ul记为：1ul 10×PCR反应缓冲液，0.8ul 10mM dNTP，4条引物均为0.15ul 10uM引物，0.1ul Taq DNA聚合酶；2ul DNA模板，双蒸水补足余量。
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸5分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明通过对BPH3编码区的等位基因进行PCR扩增、等位基因重测序，在OsLecRK3序列内获得2个BPH3基因特异性的SNP位点，其中BPH3等位基因2个SNP位点分别为T碱基与C碱基,感性等位基因对应分别为C碱基与T碱基；
2.本发明在AS-PCR方法基础上加以改进，利用目标基因内的2个特异SNP位点设计两对显性标记，其中一对用于检测BPH3抗性等位型，一对用于检测其感性等位型，两对显性标记组合作为共显性标记即可鉴定亲本及F2子代BPH3基因型；
3.与其他现有标记相比，本发明提供的BPH3标记为基因内特异性共显性SNP分子标记，可直接对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳即可判定目标材料的基因型，无需酶切，方便快捷、准确率高，且可分辨目标材料基因型是杂合还是纯合；
4.利用本发明标记进行分子标记辅助选择时，可准确实现子代基因型检测，且方法简单、准确、成本低廉并且可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等多优点，适于商业化育种中对BPH3基因型的大量筛选以及对水稻种质资源中BPH3等位基因型鉴定。
附图说明
图1是利用本发明设计的引物检测水稻育种常用亲本的电泳图，M：DL1000DNAmarker，其中泳道1-32依次对应为RATHU HEENATI、9311、华占、R1212、R1206、丰玉占、6116-765、R1128、玉针香、华润2号、R900、Mf63、綿恢3728、华恢272、华恢284、日本晴、农垦31、沪粳6、沪粳5、越粳0618、02428、热粳35、浙粳75、徽粳602、镇稻819、江苏粳2、龙5、盐稻531、一上S01、杨粳5507、辽盐287、龙稻9号(糯)；
图2是利用本发明设计的引物检测目标位点分离的F2群体电泳图，M：DL1000DNAmarker，泳道1、2分别为含有纯合BPH3感虫等位基因的亲本9311和含有纯合BPH3抗虫等位基因的亲本RATHU HEENATI，泳道3-32为利用RATHU HEENATI/9311构建的F2群体单株，各材料所属基因型标注与对应泳道下方，S代表感虫等位基因类型，R代表抗虫等位基因类型，H代表杂合类型。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
BPH3位于水稻4号染色体短臂，其是由3个基因(OsLecRK1、OsLecRK2、OsLecRK3)构成的抗性基因簇，通过对已知的分别包含BPH3抗虫基因和感虫等位基因的水稻品种BPH3编码区进行PCR扩增、测序和序列比对，在OsLecRK3基因中鉴定出两个适用于引物设计SNP位点，其中SNP1(T/C)中抗性等位为T，感性等位为C；SNP2(C/T)中抗性等位为C，感性等位为T。引物设计时以SNP1位点进行感性等位特异性引物设计，以SNP2位点进行抗性等位特异性引物设计，具体设计原理如下：在设计感性等位基因鉴定引物时，以SNP1(T/C)中的感性等位基因特异的碱基C作为3’端设计正向引物SF，并在3’端第2位碱基处C碱基改为A碱基,再设计与SF配对的反向引物SR，因此SF引物与抗性等位T型材料在3’存在两个错配碱基而无法扩增，与感性C型材料正常结合扩增获得一条455bp条带；同理以SNP2(C/T)位点中抗性等位基因特异性碱基C作为3’端设计正向引物RF，并在3’第3位碱基处将A碱基改为C碱基，再设计一条与RF配对的RR引物，同样RF引物可与抗性等位C型材料在3’正常配对扩增获得一条348bp的条带，而在感性等位T型材料配对时3’端存在2个碱基错配而无法扩增。将两对引物等量混合扩增便可实现对水稻BPH3抗感基因型的鉴定，其中纯合抗性等位可特异性扩增出一条348bp的条带，纯合感性等位基因可特异扩增出一条455bp的条带，杂合等位型可扩增出348bp和455bp两条带型。4条引物名称、序列、Tm值及扩增片段长度见表所示。
鉴定水稻抗褐飞虱基因BPH3的特异性分子标记引物，包括：
B3-SF:ATCCAGTTATCACAACCGTAC；B3-SR：ATCGCAGTGGATGATTTG；
B3-RF:GCCGATTTCAACTAAACGC；B3-RR：TTGACTGGCAGATGTTTTC。
水稻抗褐飞虱基因BPH3特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：
1)水稻DNA提取；
2)合成表1所示的引物序列；
3)PCR扩增
PCR体系以10ul记为：1ul 10×PCR反应缓冲液，0.8ul 10mM dNTP，4条引物均为0.15ul 10uM引物，0.1ul Taq DNA聚合酶；2ul DNA模板，双蒸水补足余量。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
4)结果判断
4条引物B3-SF、B3-SR、B3-RF和B3-RR等量混合扩增，根据扩增条带类型判断基因型，含有抗虫纯合BPH3等位基因类型的水稻品种扩增出348bp条带，感虫等位基因类型材料扩增出455bp条带，杂合型品种扩增出348bp和455bp条带。
表1 BPH3特异性分子标记引物序列及相关参数
Figure BDA0001404648500000051
实施例1：
一种鉴定水稻抗褐飞虱基因BPH3的特异性分子标记引物，包括：
B3-SF:ATCCAGTTATCACAACCGTAC；B3-SR：ATCGCAGTGGATGATTTG；
B3-RF:GCCGATTTCAACTAAACGC；B3-RR：TTGACTGGCAGATGTTTTC。
实施例2：
水稻抗褐飞虱基因BPH3特异性分子标记的应用：
1)生物材料
BPH3供体材料RATHU HEENATI对应泳道1，感虫对照材料9311对应泳道2，并选取30份育种核心亲本材料，对应泳道3-32依次为：华占、R1212、R1206、丰玉占、6116-765、R1128、玉针香、华润2号、R900、Mf63、綿恢3728、华恢272、华恢284、日本晴、农垦31、沪粳6、沪粳5、越粳0618、02428、热粳35、浙粳75、徽粳602、镇稻819、江苏粳2、龙5、盐稻531、一上S01、杨粳5507、辽盐287、龙稻9号(糯)等。
2)水稻DNA提取及引物合成
CTAB法提取上述材料DNA，合成表所示引物序列，具体为：
B3-SF:ATCCAGTTATCACAACCGTAC
B3-SR：ATCGCAGTGGATGATTTG
B3-RF:GCCGATTTCAACTAAACGC
B3-RR：TTGACTGGCAGATGTTTTC。
3)PCR
PCR体系以10ul记为：1ul 10×PCR反应缓冲液，0.8ul 10mM dNTP，4条引物均为0.15ul 10uM引物，0.1ul Taq DNA聚合酶；2ul DNA模板，双蒸水补足余量。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
4)结果分析
如图1所示，1泳道BPH3供体RH材料特异性扩增出348bp的条带，2泳道感虫对照材料9311扩增出455bp的条带，3-32泳道对应的个亲本材料均扩增出与感虫对照材料9311一致的455bp的条带；为了验证我们的结论，我们将RH、9311及30个亲本材料对应SNP编码区进行了测序比对，结果表明，分子标记检测结果与测序结果一致。
本发明提供的引物，可用于有效的对抗褐飞虱基因BPH3进行基因型选择及水稻资源的鉴定筛选。
实施例3：
水稻抗褐飞虱基因BPH3F2群体的单基因分离的检测
1)生物材料
如图2所示，泳道1、2分别目标位点分别为含有纯合BPH3感虫等位基因的亲本9311和含有纯合BPH3抗虫等位基因的亲本RH，泳道3-32为利用两亲本构建的随机选取的部分F2单株，各材料所属基因型标注与对应泳道下方，S代表感虫等位基因类型，R代表抗虫等位基因类型，H代表杂合类型。
2)PCR
PCR体系同实施例2。
3)结果分析
利用亲本RH与9311杂交构建F2群体，并对96个单株的基因型进行了检测，结果表明，3种不同基因型的分离比为25SS:49H:22RR，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ2＝0.230<χ2 0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离(见图2)。
本发明提供的引物，可用于有效的对抗褐飞虱基因BPH3进行基因型鉴定，及用于水稻资源的筛选鉴定，也可用于水稻抗褐飞虱基因BPH3的分子育种。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司
湖南隆平高科种业科学研究院
湖南亚华种业科学研究院
<120> 一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccagttat cacaaccgta c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgcagtgg atgatttg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgatttca actaaacgc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgactggca gatgttttc 19

Claims (4)

1.一种水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物，其特征在于，包括BPH3-RF、BPH3-RR、BPH3-SF和BPH3-SR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。
2.权利要求1所述水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物在水稻抗褐飞虱分子育种过程中的应用。
3.权利要求1所述水稻抗褐飞虱基因BPH3基因型鉴定的特异性分子标记引物在对水稻资源BPH3基因型鉴定或筛选过程中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，应用过程包括PCR反应：PCR体系以10μl记为：1μl 10×PCR反应缓冲液，0.8μl 10mM dNTP，4条引物均为0.15μl 10μM引物，0.1μlTaq DNA聚合酶；2μl DNA模板，双蒸水补足余量；
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸5分钟；扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
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