CN110592260B - 硬粒小麦成株抗叶锈病位点的竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记及其应用 - Google Patents

硬粒小麦成株抗叶锈病位点的竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小麦抗叶锈病相关的KASP分子标记及其应用。所述KASP分子标记选自BA00138075，和/或BA00606902；其中，所述BA00138075和所述BA00606902的碱基序列分别如表1所示。根据本发明提供的KASP分子标记，能增强位点的选择性，提高抗叶锈病育种材料选择的准确性，实现分子标记辅助选择育种和提高硬粒小麦育种的选择效率具有重要意义。

Description

硬粒小麦成株抗叶锈病位点的竞争性等位基因特异聚合酶链 式反应标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种硬粒小麦抗叶锈病相关的竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记及其应用。
背景技术
硬粒小麦叶锈病是一种分布非常广的流行性真菌病害，由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)侵染引起。叶锈病主要侵染小麦的叶片，在被侵染的叶片上会产生不规则的红褐色夏孢子堆。叶锈病普遍发生于全球主要硬粒小麦产区，可以造成15-40％的产量损失。在我国，叶锈病不仅在温暖湿润的西南麦区和长江流域麦区流行，在寒冷干燥的华北麦区和东北麦区也可造成严重的经济损失。
选育抗病品种和化学防治都可有效的抵制硬粒小麦叶锈病的流行，但后者存在污染环境和成本高的缺点，选育抗病品种则是防治硬粒小麦叶锈病经济环保的措施。国际上正式命名的叶锈病抗性基因大概有80个，其中大部份都是苗期抗性基因，这类抗病性是主效单基因控制，具有小种专化性。正式命名的叶锈病成株抗性基因仅有11个，成株抗性由微效多基因控制，具有广谱抗性。由于苗期抗病基因的抗病性容易丧失，在小麦生产上存在非常大的隐患。因此挖掘具有广谱抗性的成株抗性基因，培育具有持久抗病品种是防控叶锈病的关键。
基因推导法、常规杂交法、染色体定位法和分子标记法为硬粒小麦抗性遗传的主要方法，目前使用最普遍的方法为分子标记法(RAPD、RFLP、SSR、RGAP、SNP、DArT、STS和EST)。由于单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)标记具有高通量、多态性高，遗传稳定性强和自动化筛选等优点，目前广泛用于小麦抗叶锈病基因型鉴定。SNP的检测通常采用英国LGC公司的竞争性等位基因特异聚合酶链式反应(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP)技术。
硬粒小麦抗病品种Heller#1和Dunkler均来源于国际玉米小麦改良中心，这两个品系在苗期对当地叶锈病主导生理小种均表现为感病，而成株期其抗性可达到高抗水平，为典型的成株抗性硬粒小麦。感病品种Atred#2也由国际玉米小麦改良中心培育。对Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2的RILs群体进行遗传分析，在1BL染色体上检测到效应较大的叶锈病成株抗性位点，命名为QLr.hzau-1BL。该位点来源于两个抗病亲本Heller#1和Dunkler。因此，开发出一种硬粒小麦抗叶锈病相关分子标记对提高硬粒小麦育种的选择效率具有重要意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种KASP标记。
本发明的另一个目的在于提供一种用于筛选抗叶锈病硬粒小麦的试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种筛选成株抗叶锈病硬粒小麦的方法。
本发明提供了一种KASP标记，所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记选自BA00138075，和/或BA00606902；其中，所述BA00138075和所述BA00606902的碱基序列分别如表1所示。
在本发明一实施方式中，所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记用于筛选位于硬粒小麦1BL染色体上的抗叶锈病位点QLr.hzau-1BL。
本发明还提供了一种用于筛选抗叶锈病硬粒小麦的试剂盒，所述试剂盒包含竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记，其中，所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记选自BA00138075，和/或BA00606902；所述BA00138075和所述BA00606902的碱基序列分别如表1所示。
本发明还提供了一种筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，采用包含竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记的引物进行检测筛选；其中，所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记选自BA00138075，和/或BA00606902；所述BA00138075和所述BA00606902的碱基序列分别如表1所示。
在本发明的一实施方式中，所述筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，包括以下步骤：S1，提供一待测硬粒小麦的基因组DNA；S2，以所述基因组DNA为模板，采用所述包含竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记的引物进行聚合酶链式反应扩增；S3，检测所述扩增反应后的基因型，筛选硬粒小麦抗叶锈病位点QLr.hzau-1BL。
具体地，开发KASP标记，通过全基因组测序或通过重测序获得SNP信息；提取待测硬粒小麦材料DNA，并把DNA稀释到50ng/ul备用；引物设计：作为左引物F为从该SNP所在碱基开始往上游数20bp，SNP的碱基作为左引物的第20个碱基，于是有左引物f1，f2；使用引物设计软件，通过blast得到右引物R，产物大小需小于60bp；f1加上FAM接头(5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’)得到引物F1，f2加上HEX接头(5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’)得到引物F2。在合成引物F1，F2，R时选用ULTRPAGE纯化方式；将浓度为36um的左引物F1、F2，浓度为90um的右引物R按体积比1:1:1混匀后得到primer mix；引物筛选：每种引物每个亲本设置8次重复。
在本发明的一实施方式中，所述待测硬粒小麦的基因组脱氧核糖核苷酸的浓度为50纳克/微升。
在本发明的一实施方式中，在所述步骤S2中，所述聚合酶链式反应扩增包括以下步骤：(1)94℃变性15min；(2)94℃变性20s，65℃退火60s，每循环一次降0.8℃，10个循环；(3)94℃变性20s，57℃退火60s，32个循环。
在本发明的一实施方式中，在所述步骤S3中，采用荧光定量分析所述扩增反应后的基因型。
本发明提供了一种硬粒小麦抗叶锈病相关的KASP标记及其应用。根据本发明提供的KASP标记，遗传稳定性好、分辨率高，对不同来源的硬粒小麦1BL染色体上的抗叶锈病基因具有良好的特异性。本发明的KASP分子标记，能增强对抗性位点的选择，提高育种材料选择的准确性，实现分子标记辅助选择育种和提高硬粒小麦育种的选择效率具有重要意义。
附图说明
图1A、图1B分别为Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2的RILs群体叶锈病最大严重度(MDS)的田间频率分布图。
图2A、2B分别为KASP标记BA00606902和BA00138075对Dunkler/Atred#2RILs群体的基因分型。
图3为复合区间作图法定位到叶锈病成株抗性位点QLr.hzau-1BL连锁图，其中3A、3B分别为在Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2RIL群体中定位到叶锈病成株抗性位点QLr.hzau-1BL连锁图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明作进一步详细阐述。
随SNP基因分型检测技术不断发展，KASP因其具有操作简单，快捷，成本低等特点在实验中被广泛使用(Christopherson et al.1997；Huang et al.1992；Stadhouders etal.2010)。本发明提供了一种位于1BL染色体上抗性位点QLr.hzau-1BL的KASP标记BA00138075和BA00606902。
实施例硬粒小麦叶锈病基因的分子标记BA00138075和BA00606902及其专用引物的获得
生物材料的来源：
硬粒小麦材料：由国际玉米小麦改良中心提供。涉及的148份Heller#1/Atred#2和148份Dunkler/Atred#2两个F5代重组自交系群体，抗病亲本Heller#1和Dunkler以及感病亲本Atred#2均由国际玉米小麦改良中心提供。
叶锈菌菌种：叶锈菌小种BBG/BP由国际玉米小麦改良中心提供。
引物：所有引物合成均由上海英骏生物公司合成。
一、表型数据以及基因型数据的获得
在2012-2013，2013-2014，2014-2015和2015-2016作物种植季节期间，Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2的重组自交系(RIL)群体及其亲本在墨西哥克夫雷贡城(Ciudad Obregon)的试验基地进行叶锈病的田间表型鉴定。在田间试验中，用感病硬粒小麦品种Banamichi作诱发行。在每年的1月20日左右接种叶锈菌小种BBG/BP，接种后需要进行叶锈病严重度调查，第一次叶锈病严重度调查是在感病亲本Atred#2严重度达到60-80％时，此后每隔一周调查一次。在2013，2014和2016年分别调查了2-3次，2015年仅调查一次。调查结果表明，Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2的RIL群体的最终严重度(FDS)在田间表现为连续性变化(见图1A、1B)，为典型的数量性状遗传。在Heller#1/Atred#2的群体中采用了15K和35K SNP进行基因分析，共得到4275个多态性SNP标记用于构建连锁图。Dunkler/Atred#2的群体采用50K的基因多样性阵列技术(DArT)和简单序列重复(SSR)标记相结合进行基因分析，最终得到7,001个多态性标记用于构建连锁图。
二、叶锈病抗性位点的定位
利用上述田间鉴定表型值的最终严重度，均值以及病害曲线下进展面积通过IciMapping4.1软件结合基因型分析结果进行QTL分析，即对抗叶锈病基因进行遗传连锁定位分析。在Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2群体的1BL染色体上成功定位到1个共同叶锈病成株抗性位点，将其分别命名为QLr.hzau-1BL。
三、KASP标记的开发
结合小麦抗性位点的QLr.hzau-1BL的遗传图谱以及小麦SNP标记信息，使用在线平台PolyMaker网站(polymarker.tgac.ac.uk/)对所有候选SNP进行KASP设计，然后从中挑选出染色体特异的标记。对于设计好的KSAP标记序列，需要在两条正向特异引物的5’端加上FAM或者HEX荧光的接头序列，其中FAM接头序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，HEX接头序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。本实施例所用引物由上海英骏生物公司合成。
四、KASP标记的筛选
选取Heller#1/Atred#2和Dunkler/Atred#2共计两个RIL群体及其相关亲本进行标记筛选。
PCR扩增反应体系：在384孔的PCR程序中，反应体系总体积为10ul，其中2×KASPV4.0Mastermix体积为2.5ul，引物mix为0.056ul，DNA 模板为5ul(50ng/ul左右)。
PCR反应程序：(1)94℃变性15min；(2)94℃变性20s，65℃退火60s，每循环一次降0.8℃，10个循环；(3)94℃变性20s，57℃退火60s，32个循环。
PCR反应完毕后放在酶标仪FLUOstar Omega中读取终端荧光读数，然后将数据导入KlusterCaller软件进行基因分型。本实验根据基因分型的结果，获得了抗叶锈病基因QLr.hzau-1BL的特异性KASP标记，并分别命名为BA00138075和BA00606902(见图2A、2B)，结合基因型数据，利用复合区间作图法在两个RIL群体中均检测到叶锈病成株抗性位点QLr.hzau-1BL连锁图(见图3中3A、3B)。所述特异性KASP标记BA00138075和BA00606902的序列表如表1所示。
表1 QLr.hzau-1BL已开发的2个KASP标记序列表
Figure GDA0002258694920000051
Figure GDA0002258694920000061
五、所述分子标记BA00138075和BA00606902与已有标记对比
利用上述筛选获得的1BL上叶锈病抗性位点的KASP标记BA00138075和BA00606902与已知的特异性标记csLV46g22进行比较。上述三个特异性标记在由国际玉米小麦改良中心提供的155个硬粒小麦中进行验证最终发现本实验中开发的2个KASP标记具有良好的特异性。
表2 2个KASP标记和1个前报道标记在155份硬粒小麦中的基因型对比情况
Figure GDA0002258694920000062
Figure GDA0002258694920000071
Figure GDA0002258694920000081
Figure GDA0002258694920000091
Figure GDA0002258694920000101
Figure GDA0002258694920000111
Figure GDA0002258694920000121
备注：“+”表示含有抗叶锈病基因，“-”表示不含抗叶锈病基因，“.”表示数据缺失
实验结果表明，51个硬粒小麦品系携带BA00138075和BA00606902的阳性等位基因，并且这些品系还显示存在Lr46连接的标记csLV46G22的阳性等位基因。相反，有53个品系缺少两个KASP标记的阳性等位基因，而只有22个品系缺少csLV46G22的阳性等位基因。鉴于Lr46的两个KASP标记比csLV46G22检测频率低，显示新标记较旧标记更具诊断性。即本实验中开发的2个KASP标记具有良好的特异性。本发明的KASP分子标记，序列、引物明确，经案例实施，可直接用于分子标记辅助选择育种。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 硬粒小麦成株抗叶锈病位点的竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记及其应用
<140> 2019109618642
<141> 2019-10-11
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc ttccatactt gcagttacag gttag 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat ttccatactt gcagttacag gttac 45
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagaatttt tgggttaact cgg 23
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc taagctgcat gagattgcta ca 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat taagctgcat gagattgcta cg 42
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actacaatgt acctgatgaa tcccc 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (5)

1.一种筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，其特征在于，采用竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记的引物进行检测筛选；其中，所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记为BA00138075，或所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记为BA00138075与BA00606902的组合；
所述BA00138075的引物序列中，左引物F1为GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCATACTTGCAGTTACAGGTTAG，左引物F2为GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCATACTTGCAGTTACAGGTTAC，右引物R为GCAGAATTTTTGGGTTAACTCGG；
所述BA00606902的引物序列中，左引物F1为GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGCTGCATGAGATTGCTACA，左引物F2为
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGCTGCATGAGATTGCTACG，右引物R为ACTACAATGTACCTGATGAATCCCC。
2.如权利要求1所述的筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提供一待测硬粒小麦的基因组DNA； S2，以所述待测硬粒小麦的基因组DNA为模板，采用所述竞争性等位基因特异聚合酶链式反应标记的引物分别进行聚合酶链式反应扩增；S3，检测所述扩增反应后的基因型。
3.如权利要求2所述的筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，其特征在于，所述待测硬粒小麦的基因组DNA的浓度为50纳克/微升。
4.如权利要求2所述的筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，所述聚合酶链式反应扩增包括以下步骤：（1）94℃变性15min；（2）94℃变性20s，65℃退火60s，每循环一次降0.8℃，10个循环；（3）94℃变性20s，57℃退火60s，32个循环。
5.如权利要求2所述的筛选抗叶锈病硬粒小麦的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，采用荧光定量分析所述扩增反应后的基因型。
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