CN111041122B - 小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记及其应用，所述indel分子标记位于小麦2B染色体第157755888位，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对抗病和感病小麦进行遗传分析，通过构建遗传连锁图谱确定抗叶锈病基因Lr13的区间位置，并相应地开发了与该基因连锁的indel分子标记，该indel分子标记和小麦抗锈病基因Lr13高度连锁，通过该indel分子标记可以筛选出含有小麦抗叶锈病基因Lr13的小麦株系，提高选择效率加速小麦抗病育种的进程，实现多个抗病基因聚合育种的目标。
Description
技术领域
本发明涉及生物遗传学领域，尤其涉及小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记及其应用。
背景技术
小麦叶锈病是由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)侵染所引起的真菌性病害，发病时严重影响小麦的生产。小麦叶锈病发病轻微时会减产3％，发病严重时会达到25-30％，且发病轻重与产量的损失程度呈正相关。
目前，防治小麦叶锈病最经济环保有效的方法是选育抗病品种，单一抗源的品种在生产上抗性易丧失，在一个材料中聚合多个抗病基因可以保持小麦在生产应用中的持久抗性，但是在育种中通过表型选择确定抗病基因的存在与否非常困难，尤其是在同一个材料中不止有一个抗病基因时。通过分子标记辅助选择可以解决这一难题。抗叶锈病基因Lr13在我国小麦抗叶锈病育种中广泛应用，但是该基因的应用主要是通过表型选择，本发明希望找到一个与抗叶锈病基因Lr13紧密连锁的标记，使标记辅助育种和分子设计育种成为可能。
indel分子标记是一种插入缺失标记，指的是两种亲本在全基因组中的差异。相对于另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失，而根据基因组中插入缺失位点，可以设计一些用于扩增这些插入缺失位点的引物，通过PCR扩增可以进行不同品种植株的副辅助选育。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记，用于抗叶锈病小麦辅助育种。
第一方面，本发明提供一种小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记，所述indel分子标记位于2B染色体第157755888位，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述indel分子标记位于如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第176位。
SEQ ID NO.2为本发明针对该indel分子标记设计出的引物对小麦基因组DNA扩增得到的结果，此扩增序列不唯一，但是该indel分子标记和小麦抗叶锈病基因Lr13高度连锁，且使用本发明提供的引物组合可以检测出在不同株系中的该indel分子标记。
本发明进一步提供用于扩增上述indel分子标记的引物对，包括：
Lseq102-正向引物：5’-GGCTTCTTCATCATCAGGTACG-3’(SEQ ID NO.3)
Lseq102-反向引物5’-GCATGCGATCCAACCCTTTG-3’(SEQ ID NO.4)。
本发明将抗叶锈病材料辽春10和感叶锈病材料87-1构建的含有3057个单株的F2群体，辽春10和7D49构建的含有851个单株的F2群体，辽春10和RL4031(Lr13)构建的含有1395个单株的F2群体及感病对照种植于北京，分蘖期时接种叶锈菌生理小种PHT，待感病对照充分发病时，对F2群体进行抗病性鉴定。结果辽春10和RL4031表现为抗病，辽春10和RL4031杂交产生的F2群体中的1395个单株全部抗病，这表示辽春10中的抗叶锈病基因LrLC10和Lr13为等位基因；辽春10的系谱中含有Lr13的供体亲本UP301和Frontana，表示辽春10中的抗叶锈病基因LrLC10为Lr13。
之前有研究报道辽春10中的抗叶锈病基因位于染色体2BS上，本发明筛选之前报道中所用的引物，并用有差异的引物对辽春10和87-1，辽春10和7D49构建的F2群体中的单株进行基因分型，利用JoinMap4.0分析软件将该抗病基因定位在标记Xbarc18和CAUT163之间。然后，根据亲本重测序数据设计开发引物，共有14个标记加密到该区间。其中标记Lseq102与抗病基因共分离，并且能够有效的筛选出该基因。
第二方面，本发明进一步提供检测小麦抗叶锈病基因Lr13的方法，包括：
以待测小麦基因组DNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增。
进一步地，若PCR扩增结果包括如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的条带，则所述待测小麦具有抗叶锈病基因Lr13；若PCR扩增结果不包括如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的条带，则所述待测小麦不具有抗叶锈病基因Lr13。
可以采用本领域常规技术手段对上述PCR扩增结果进行检测，例如琼脂糖凝胶电泳。
本发明进一步提供用于检测小麦抗叶锈病基因Lr13的试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增上述indel分子标记的引物对。
第三方面，本发明提供上述indel分子标记和上述引物对在检测小麦抗叶锈病基因Lr13中的应用。
本发明进一步提供上述indel分子标记和上述引物对在鉴定小麦抗叶锈病性状中的应用。
本发明进一步提供上述indel分子标记和上述引物对在抗锈病小麦辅助育种中的应用。
本发明提供小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记及其应用，具有如下有益效果：
本发明通过对抗病和感病小麦进行遗传分析，通过构建遗传连锁图谱确定抗叶锈病基因LrLC10(Lr13)的区间位置，并相应地开发了与该基因连锁的indel分子标记，该indel分子标记Lseq102与抗叶锈病基因Lr13紧密连锁，通过PCR扩增即可以准确区分待测植株Lr13有抗病功能的基因型，可以筛选出含有该抗锈病基因的小麦株系，提高选择效率，加速小麦抗病育种的进程，实现多个抗病基因聚合育种的目标。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的抗叶锈病基因LrLC10(Lr13)的遗传连锁图谱；
图2为本发明实施例1提供的抗叶锈病基因LrLC10(Lr13)的精确定位及定位区间内的基因注释；
图3为本发明实施例2提供的已知含有和不含Lr13材料的电泳结果，其中M为Marker，1为辽春10，2-23为含有Lr13基因的小麦，24-31为不含Lr13基因的小麦。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明提供一种筛选小麦抗叶锈病分子标记的方法，具体如下：
1、遗传分析
对田间种植的87-1/辽春10、7D49/辽春10、辽春10/RL4031衍生的F2群体单株进行表型鉴定，87-1和辽春10衍生的F2群体包含3057个单株，其中2300个单株表现为抗病，757个单株表现为感病，7D49和辽春10衍生的F2群体包含851个单株，其中抗病单株624株，感病单株227株。利用SPSS对表型结果进行卡方检验(适合性检验)，在期望比例为3:1情况下，卡方值为0.092，和1.268，P>0.05(表2)，得出辽春10的抗叶锈病性状为显性单基因控制。辽春10和RL4031(Lr13)衍生的F2群体中的1395个单株全部抗病，得出辽春10中的抗叶锈病基因为Lr13。
表1叶锈病鉴定分级标准
表2 87-1/辽春10、7D49/辽春10衍生的F2群体中的单株成株期对叶锈菌PHT抗性的遗传分析
2、遗传连锁图谱的构建
用辽春10，7D49进行引物筛选，将在亲本间有多态性的引物对辽春10和7D49杂交衍生的F2群体中的92个纯合感病单株进行分型，构建遗传图谱，利用目标区间内抗病和感病亲本重测序数据开发一系列indel标记，只有四个引物在亲本之间有多态性、带型清晰明显并加密到抗叶锈病基因Lr13的区间内，如图1所示，Lr13的定位区间为1.65cM，侧翼的标记为CAUT163和Lseq22。
3、精细遗传连锁图谱的构建
将CAUT163和Lseq22的序列比对中国春的参考基因组序列，确定抗病基因所在区间对应的物理位置及区间，并在该区间内根据亲本重测序数据继续设计一些indel标记和KASP引物，只有10个标记在亲本之间有多态性。为了寻找更多的交换单株，用标记CAU T163和Lseq22筛选辽春10和7D49，87-1分别杂交衍生的F2群体中的984株纯合感病植株，共找到32株重组单株，并用在这区间内的10个多态性标记对32株重组单株进行基因分型。最终抗叶锈病基因LrLC10被定位到314.3kb的区间内，根据中国春参考基因组的注释，该区间内有3个基因。根据亲本重测序数据，对两亲本间这3个基因的序列进行比较，如图2所示，基因TraesCS2B01G182800和TraesCS2B01G183000在亲本间存在差异，根据TraesCS2B01G183000的差异设计indel分子标记Lseq102与LrLC10(Lr13)共分离。
实施例2
本实施例利用indel分子标记Lseq102对33份已知含有/不含Lr13的材料进行筛选，具体步骤如下：
1、利用CTAB法提取33份小麦材料叶片组织的DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用表3中序列1所示的单链DNA分子(上游引物)和序列2所示的单链DNA分子(下游引物)组成的引物对进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系(10μl体系)：模板DNA(50ngμL-1)2.0μL、2×PCR Mix 5.0μL(GenStar公司产品)、上游引物1μL、下游引物1μL、ddH2O 1.0μL。
PCR扩增的反应程序：94℃5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，35个循环；72℃5min。
表3 Indel分子标记Lseq102的上下游引物序列
| Lseq102序列1 | GGCTTCTTCATCATCAGGTACG |
| Lseq102序列2 | GCATGCGATCCAACCCTTTG |
3、将步骤5.4.2.1的PCR扩增产物进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳并用快速银染法显色，扫描照相进行带型统计，结果见图3。将辽春10显示的带型命名为A带型，片段大小为229bp，87-1和7D49的带型命名为B，片段大小为238bp。
4、如图3所示，23份含有Lr13的材料(1-23号)田间鉴定均为抗叶锈病，且带型与辽春10一致，不含Lr13的材料(24-31号)田间鉴定均为感叶锈病，且带型与87-1/7D49一致，说明标记Lseq102可以准确区分Lr13有抗病功能的基因型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记及其应用
<130> KHP191116705.1
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 239
<212> DNA
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cggtcagcct tccagaggta tgatcgataa aacgcagttc aaagggttgg atcgcatgc 239
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ggcttcttca tcatcaggta cg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatgcgatc caaccctttg 20
Claims (5)
1.小麦抗叶锈病基因Lr13的indel分子标记，其特征在于，所述indel分子标记位于小麦2B染色体第157755888-157755897位，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述indel分子标记类型为G-缺失的小麦具有抗叶锈病基因Lr13；所述indel分子标记类型为G-ACGACGGTC的小麦不具有抗叶锈病基因Lr13。
2.一种检测小麦抗叶锈病基因Lr13的方法，其特征在于，包括：
以待测小麦的基因组DNA为模板，使用引物对进行PCR扩增；若检测结果片段大小为230bp，则所述待测小麦具有抗叶锈病基因Lr13；若检测结果片段大小为239bp，则所述待测小麦不具有抗叶锈病基因Lr13；
所述引物对包括：
正向引物：5’- GGCTTCTTCATCATCAGGTACG-3’，
反向引物 5’- GCATGCGATCCAACCCTTTG-3’。
3.引物对在检测小麦抗叶锈病基因Lr13中的应用；
所述引物对包括：
正向引物：5’- GGCTTCTTCATCATCAGGTACG-3’，
反向引物 5’- GCATGCGATCCAACCCTTTG-3’。
4.引物对在鉴定小麦抗叶锈病性状中的应用；
所述引物对包括：
正向引物：5’- GGCTTCTTCATCATCAGGTACG-3’，
反向引物 5’- GCATGCGATCCAACCCTTTG-3’。
5.引物对在抗叶锈病小麦辅助育种中的应用；
所述引物对包括：
正向引物：5’- GGCTTCTTCATCATCAGGTACG-3’，
反向引物 5’- GCATGCGATCCAACCCTTTG-3’。
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