CN112980993B

CN112980993B - 与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112980993B
Application number: CN202110381706.7A
Authority: CN
Inventors: 廖伯寿; 罗怀勇; 雷永; 黄莉; 刘念; 晏立英; 康彦平; 姜慧芳; 蒋艺飞
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN112980993A

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记及其应用。本发明的与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点连锁的SNP分子标记包括：qPSIIB10‑L或qPSIIB10‑R。其中，SNP分子标记qPSIIB10‑L含有如SEQ ID NO.1所示序列第235位的多态性为C/T和第338位的多态性为G/A的核苷酸序列；SNP分子标记qPSIIB10‑R含有如SEQ ID NO.2所示序列的第297位的多态性为G/A的核苷酸序列。本发明可以辅助选择花生种仁抗黄曲霉菌侵染的材料，有利于促进花生抗黄曲霉新品种的选育和应用。

Description

与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL 位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

花生(Arachis hypogea L.)是重要的油料作物之一。花生种子含有丰富的食用油脂、蛋白质、氨基酸和维生素，可以加工为食用油、坚果、花生酱等食品。然而，在花生生产和收获后，花生都有可能受到黄曲霉菌(Aspergillus flavus)的侵染，产生黄曲霉毒素，严重破坏花生的品质。因此，如何减少黄曲霉菌对花生种子的侵染、控制黄曲霉毒素的危害，是花生产业发展的重大需求。

选育和利用抗病品种是防治作物病害最为经济有效的措施之一。研究发现，部分花生种质荚壳和种仁对黄曲霉菌侵染存在抗性，部分种质的种仁对黄曲霉菌产毒具有抗性。整合这三类抗性是花生遗传改良研究的重要方向之一。

花生对黄曲霉菌的抗性表型为多基因控制的数量抗性。数量性状易受环境条件的影响，因此对表型直接进行选择的效果不好。通过构建高密度遗传连锁图谱，对分子标记基因型和表型进行QTL分析，可以将复杂的数量性状分解成多个QTL，利用与QTL连锁的分子标记可以进行分子标记辅助选择，提高育种效率。

目前对花生种仁抗黄曲霉菌侵染的QTL定位研究还较少，检测到的主效 QTL数目更少，难以在花生育种中应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一个抗黄曲霉菌侵染主效QTL 位点qPSIIB10的SNP标记、SNP标记引物对、SNP标记检测方法及其应用。

具体地，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的 SNP分子标记，其包括qPSIIB10-L或qPSIIB10-R；

其中，SNP分子标记qPSIIB10-L含有如SEQ ID NO.1所示序列第235位的多态性为C/T和第338位的多态性为G/A的核苷酸序列；SNP分子标记qPSIIB10-R含有如SEQ ID NO.2所示序列的第297位的多态性为G/A的核苷酸序列。

所述SNP分子标记qPSIIB10-L对应的两个SNP位点及其侧翼序列如SEQ ID NO.1所示；所述SNP分子标记qPSIIB10-R对应的一个SNP位点及其侧翼序列如 SEQ ID NO.2所示。

所述SNP分子标记qPSIIB10-L中，具有第235位多态性位点的基因型为T 且第338位多态性位点的基因型为A，对应于含有抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10，具有第235位多态性位点的基因型为C且第338位多态性位点的基因型为G，对应于不含有qPSIIB10；所述SNP分子标记qPSIIB10-R中，具有第297位多态性位点的基因型为A，对应于含有qPSIIB10，基因型为G，对应于不含qPSIIB10。

第二方面，本发明提供与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记组合，其包括qPSIIB10-L和qPSIIB10-R；其中，SNP分子标记qPSIIB10-L和qPSIIB10-R如上所述。

第三方面，本发明提供用于扩增上述SNP分子标记或SNP分子标记组合的引物。

所述引物包括如SEQ ID NO.3-6所示的序列。

qPSIIB10-L的引物对：

正向引物序列5’-TGCAAAGACTCCAATGTGCAAGT-3’(如SEQ ID NO.3 所示)，

反向引物序列5’-CTGTGTTTTCCACCCACACACTC-3’(如SEQ ID NO.4 所示)。

qPSIIB10-R的引物对：

正向引物序列5’-ACGAGTATGAAGGATTAGAGCACTTAGG-3’(如SEQ ID NO.5所示)，

反向引物序列5’-TTTTTAAATAGACAACGACGCCGTTTAG-3’(如SEQ ID NO.6所示)。

第四方面，本发明提供上述SNP分子标记或SNP分子标记组合或引物的以下任一应用：(1)在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

(2)在花生中黄曲霉菌侵染抗性早期预测中的应用；

(3)在筛选高黄曲霉菌侵染抗性花生中的应用。

本发明的SNP分子标记可在选育抗黄曲霉花生品种中进行应用。

优选，所述花生为中花16及其祖先或子代。

第五方面，本发明提供鉴定花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10 的方法，包括：

(1)利用SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所示引物对待鉴定花生的 DNA进行PCR扩增；

(2)分析PCR扩增产物中上述SNP分子标记或SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生是否含有抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点 qPSIIB10。

其中，步骤(2)中判断待鉴定花生是否含有抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10的方法如下：

若SNP分子标记qPSIIB10-L具有第235位的多态性的位点的基因型为T且第338位的多态性的位点的基因型为A，则待鉴定花生含有qPSIIB10，若具有第235位的多态性的位点的基因型为C且第338位的多态性的位点的基因型为 G，则待鉴定花生不含有qPSIIB10；和/或，

若SNP分子标记qPSIIB10-R具有第297位的多态性的位点的基因型为A，则待鉴定花生含有qPSIIB10，若基因型为G，则待鉴定花生不含有qPSIIB10。

一种花生抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10的SNP标记鉴定方法，包括如下步骤：利用SNP标记qPSIIB10-L的引物对和/或SNP标记qPSIIB10-R的引物对，对待鉴定花生材料的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行二代高通量测序，测序reads与上述SNP位点及其侧翼序列比对，鉴定扩增产物在SNP位点的碱基，如检测结果显示待鉴定材料与花生品种中花16扩增得到相同的碱基，则标志着抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10的存在，待鉴定材料对黄曲霉菌侵染具有较高的抗性；所述扩增得到相同的碱基是指：利用分子标记qPSIIB10-L的引物对扩增得到的DNA片段在两个SNP位点的碱基分别为T和A、利用分子标记qPSIIB10-R的引物对扩增得到的DNA片段在SNP位点的碱基为A。

本发明的有益效果在于：

本发明筛选得到与花生抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10连锁的2个 SNP标记，利用2个SNP标记的引物对，采用花生抗黄曲霉菌侵染主效位点 qPSIIB10的SNP标记的检测方法，可以辅助选择种仁抗黄曲霉菌侵染的材料，有利于推动抗黄曲霉花生品种的选育，提高育种效率。

本发明的两个SNP标记主要是检测是否含有抗黄曲霉菌侵染位点 qPSIIB10，只用一个标记检测基本准确，但是两个标记同时使用，准确率更高。含有qPSIIB10位点的花生材料抵抗黄曲霉菌侵染的能力更强。在育种应用中，可以用中花16或具有qPSIIB10的其他材料做亲本进行杂交，在其后代中会产生含有或不含有qPSIIB10的许多个体，通过两个标记或其中1个，辅助选择保留含有qPSIIB10位点的个体材料，再从这些个体材料中再选择产量高、品质优的，最终就可以形成抗黄曲霉菌侵染的花生新品种。

附图说明

图1为本发明中花生抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10在染色体B10的定位，其中纵向垂直线表示花生染色体B10，B10右侧横向短线段表示染色体上的遗传重组bin，并列出了根据bin位点内SNP筛选出的SNP标记qPSIIB10-L和 qPSIIB10-R；左侧横向短线段表示bin间的遗传距离(cM)；抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10定位于bin位点c20b057和c20b058之间1cM的区域，B10右侧列出了该QTL在2017～2019三年间检测到的置信区间。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

供试材料：以花生品种中花16为母本，花生种质J11为父本进行杂交，通过单粒传法获得包含200个株系的重组自交系(RIL)群体F₇(2017年)、F₈(2018 年)和F₉(2019年)。

表现型鉴定：2017～2019年在中国农业科学院油料作物研究所阳逻实验基地种植中花16、J11及F₇(2017年)、F₈(2018年)和F₉(2019年)代RIL群体200个株系。采用完全随机区组实验设计，3次重复。每次重复每份材料种植1行10-12 株，行距30厘米，株距10厘米。采取标准的田间管理方式。成熟后选择健康的植株收获荚果，干燥并妥善保存。剥壳后选择20粒典型种仁于室内接种黄曲霉菌，发病充分后记录每粒种子的侵染等级：0级，种仁表面没有黄曲霉菌孢子； 1级，有黄曲霉菌孢子的种仁表面小于1/4；2级，有黄曲霉菌孢子的种仁表面小于1/2；3级，有黄曲霉菌孢子的种仁表面大于1/2。然后计算侵染率(PSII)：PS II＝(n1+n2×2+n3×3)×100％/(N×3)，其中n1、n2、n3和N分别表示1级、2级、3级种仁个数和它们的总数。

遗传连锁图谱的构建：用CTAB法提取亲本和RIL群体200个单株叶片DNA；依据Illumina文库构建Protocol进行Paired-end(PE)文库构建，每个样本DNA建一个300-500bpPE文库，在Illumina HiSeq测序仪上进行PE150测序。对于下机的原始数据进行质控得到高质量的cleandata，然后将cleandata比对到参考基因组上，使用的参考基因组为四倍体栽培花生参考基因组(https://www.peanutbase.or g/data/public/Arachis_hypogaea/Tifrunner.gnm1.KYV3/)，使用的比对软件为BWA 软件，最后使用GATK的HaplotypeCaller模块进行SNP检测。然后分三步构建遗传连锁图谱。第一步，根据每个SNP在基因组上的位置来确定它们的连锁群，然后根据每个内标记等基因之间关系推断亲本的基因型，再确定等位基因的来源。第二步，利用基于隐马尔科夫模型(HMM)的算法填补缺失的基因型。第三步，将基因型相同的SNP位点合并成bins，最后计算bins遗传图距从而得到终连锁图谱。该连锁图谱包含2802个bin位点(233365个SNP)，总长度为1573.85cM，标记间平均距离为0.58cM。

QTL的定位：利用IciMapping 4.2软件的开展侵染率QTL分析，利用三年的侵染率表型数据均在染色体B10上c20b057～c20b058区间检测到主效QTL位点 qPSIIB10，在2017～2019三年间的LOD值分别为5.39、5.28和4.92，表型解释率分别为10.10％、9.94％和10.58％。2017～2019年的置信区间相互重叠，位于一个1cM 的区间(32.5～33.5cM)，其位置的示意图见图1。因此，花生抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10能在三年实验中稳定表达，其抗性等位基因来源于中花16。

利用bin位点c20b057中的两个连续的SNP(分别位于上述参考基因组B10染色体24873414bp(C/T变异)和24873517bp(G/A变异))开发出一个SNP标记 qPSIIB10-L(SEQ IDNO.1)，扩增产物二代高通量测序检测SNP位点碱基组成：在中花16中分别检测出T和A碱基，属于抗侵染等位基因；而在J11中分别检测出 C和G碱基。

利用bin位点c20b058中的一个SNP(位于上述参考基因组B10染色体 25033564bp(G/A变异))开发出一个SNP标记qPSIIB10-R(SEQ ID NO.2)，扩增产物二代高通量测序检测SNP位点碱基组成：在中花16中检测出A碱基，属于抗侵染等位基因；而在J11中检测出G碱基。

实施例2

利用与抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10相连锁的两个SNP标记对中花 16和J11的200个RIL(见实施例1)进行检测。以基因组DNA为模板，SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示序列为引物，用KAPA2G Fast Multiplex Mix 试剂盒同时扩增两个分子标记。PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性 15s、55℃复性30s、72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。扩增产物添加测序接头后用Illumina HiSeq平台进行Paired-end 150bp(PE150)测序，测序序列比对到参考序列，检测SNP位点的碱基。如果RIL 与中花16的扩增片段检测出的SNP位点碱基一致，说明该株系含有qPSIIB10 的抗黄曲霉菌侵染等位基因。同时用实际测得的侵染率(测试方法见实施例1)结果与分子标记检测结果进行验证。

结果显示，在200个RIL中，105个RIL的两个分子标记的基因型都与中花16相同(基因型分类1)，说明含有纯合的主效抗黄曲霉菌侵染QTL位点 qPSIIB10；而88个RIL的两个分子标记的基因型都与J11相同(基因型分类2)，说明不含有qPSIIB10；多重比较发现，含有qPSIIB10的105个RIL在2017、 2018、2019三年鉴定的侵染率中均显著低于不含有qPSIIB10的88个RIL(表1)。因此，同时用本发明的与抗黄曲霉菌侵染主效位点qPSIIB10相连锁的两个SNP标记qPSIIB10-L和qPSIIB10-R预测花生对黄曲霉菌侵染的抗性有较好的预测效果。

表1利用本发明的两个标记进行选择RIL株系的侵染率差异

**表示在0.01水平上，基因型分类1与基因型分类2之间存在显著差异。基因型分类 1的基因型与中花16相同，基因型分类2的基因型与J11相同。

仅利用分子标记qPSIIB10-L也具有较好的预测效果(表2)。鉴定出106 个含有qPSIIB10的RIL，它们的侵染率显著低于91个不含有qPSIIB10的RIL。

表2利用分子标记qPSIIB10-L进行选择RIL株系的侵染率差异

**表示在0.01水平上，基因型分类1与基因型分类2之间存在显著差异。基因型分类1的基因型与中花16相同，基因型分类2的基因型与J11相同。

相似地，仅利用分子标记qPSIIB10-R也具有较好的预测效果(表3)。鉴定出108个含有qPSIIB10的RIL，它们的侵染率显著低于89个不含有qPSIIB10 的RIL。

表3利用分子标记qPSIIB10-R进行选择RIL株系的侵染率差异

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记及其应用

<130> KHP211112216.7

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaagcaaga ggataaaaat ttatatagaa gtataaagag aaaatataga gtagtatcag 60

aagtgttttt actctttcga gtttaagagt tacttgaaca aaattgtaga gagtagatta 120

gagacacaat gttgtcgtta tcctcatttt ctgagttcct aatgtcccga gttcgtcatt 180

cctaatagtg gggagtgttt ttgcaaagac tccaatgtgc aagttagcat ggattgcaaa 240

aagaactaag ttagagatca tattttagta catgtatttg gaatagtgca tatattgtga 300

ggttgtgatg ttatgagctc ctctctttat gttctttaaa aggtataagt taatttttag 360

gttaaattga tctaggagaa gttttttctc caaaaataga gagatgagag agagagagta 420

agagagagag agtgtgtggg tggaaaacac agggaagggt agaacgataa gtcaggtcaa 480

ggatcctaga gtttggaatc gagatgagta tcgacgcttg gagaacgagt ccttctcaat 540

tttcgtggat aatctcccat caaacatatc gaggagagag ttgttccaac tgtttaactg 600

gactggacgc ataaccgaca tctacttatc gaggaaagaa aagaatggtg gct 653

<210> 2

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtgggctga agacagtgat caagaagttt gggacaaaaa aaatcctgat agattgttcc 60

atgcttgtcc aagataccgg gtgagttatg aatgtagtct tgttgaaact tgtaattatt 120

tgagtgggat tttgacattt ttgtacccta atgttgtgca gaaggacagc cactgtaatt 180

actttaggtg ggctgaggat aacgagtatg aaggattaga gcacttagga gatgttaaaa 240

ccatggttct aaaaatcgaa ccggaccggt cggttcaact gaaataaccg gaaaccagtc 300

acctaatcga tccgggtaag gtcaaaaacc gcctggcaaa aaattgataa aaaaccggcc 360

aaaccggtgg ttaaccggtg aaccgggaga accgtccgat tttttagcgg tttttggttt 420

gaaagaaaaa atgctaaacg gcgtcgttgt ctatttaaaa aaaaattcat aaaaagaaac 480

ctgatcccca acgcacccaa ccccattcct ctcttctcct cacctctctg aaactgaact 540

gcaaatttta tattgaaagc acaaagaacc ctagccctcc agccaccgca gccagccagc 600

cactgcgccc cgcagccccc agatccgcgc aacaatactt cattgtcatc gacaaactcg 660

tc 662

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcaaagact ccaatgtgca agt 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtgttttc cacccacaca ctc 23

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgagtatga aggattagag cacttagg 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttttaaata gacaacgacg ccgtttag 28

Claims

1.与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记，其特征在于，包括qPSIIB10-L或qPSIIB10-R；

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记qPSIIB10-L中，具有第235位多态性位点的基因型为T且第338位多态性位点的基因型为A，对应于含有抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10，具有第235位多态性位点的基因型为C且第338位多态性位点的基因型为G，对应于不含qPSIIB10；所述SNP分子标记qPSIIB10-R中，具有第297位多态性位点的基因型为A，对应于含有qPSIIB10，基因型为G，对应于不含qPSIIB10。

3.与花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10连锁的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP分子标记组合包括qPSIIB10-L和qPSIIB10-R；

其中，SNP分子标记qPSIIB10-L和qPSIIB10-R同权利要求1或2中所述。

4.用于扩增权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的引物，包括如SEQ ID NO.3-6所示的序列。

5.权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合或权利要求4所述的引物的以下任一应用：

（1）在花生种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；

（2）在花生中黄曲霉菌侵染抗性早期预测中的应用；

（3）在筛选高黄曲霉菌侵染抗性花生中的应用。

6.鉴定花生抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10的方法，其特征在于，包括：

（1）利用SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.5-6所示引物对待鉴定花生的DNA进行PCR扩增；

（2）分析PCR扩增产物中权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的基因型，根据所述基因型判断待鉴定花生是否含有抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）中判断待鉴定花生是否含有抗黄曲霉菌侵染主效QTL位点qPSIIB10的方法如下：

若SNP分子标记qPSIIB10-L具有第235位多态性位点的基因型为T且第338位多态性位点的基因型为A，则待鉴定花生含有qPSIIB10，若具有第235位多态性位点的基因型为C且第338位多态性位点的基因型为G，则待不含有qPSIIB10；和/或，

若SNP分子标记qPSIIB10-R具有第297位多态性位点的基因型为A，则待鉴定花生含有qPSIIB10，若基因型为G，则待鉴定花生不含有qPSIIB10。