CN105154431A - 一种利用issr分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌dna指纹图谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，包括黄曲霉菌DNA提取、ISSR-PCR反应、反应产物的电泳图谱的分析，ISSR-PCR所使用的引物分别为R1引物：AGAGAGAGAGAGAGAGG；R2引物：CACACACACACACACAA；R3引物：AGAGTTGGTAGCTCTTGATC。本发明方法稳定、重现性好、易于掌握；所选引物特异性好，能将中国花生主产区黄曲霉菌污染溯源至单个产地或者范围较小的片区，可作为中国花生主产地黄曲霉菌污染的产地溯源理论方法和技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，属于食品安全领域。
背景技术
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等真菌产生的次级代谢产物，在我国，黄曲霉毒素主要由黄曲霉菌产生。黄曲霉毒素具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌的主要因素之一，最短24周内就能导致肝脏坏死癌变。
花生极易受到黄曲霉菌侵染，侵染的黄曲霉菌一旦遇到适宜的环境，就会快速的生长繁殖，并产生毒素，造成黄曲霉毒素的污染和超标。目前我国花生及其制品中黄曲霉污染严重，调查发现，江苏、上海、广东、广西、福建、四川等肝癌高发病地区主要粮油产品中黄曲霉毒素B1(AFB1)超标现象比较常见。丁晓霞报道我国产后花生的黄曲霉总量检出率高达29.6％。黄曲霉毒素污染严重影响着花生制品的食用安全性，已成为制约花生产业发展和食用安全的最大限制因子。
花生中黄曲霉毒素的污染虽在花生种植、收获、加工、贮运及销售等环节均会发生，但研究表明受黄曲霉毒素污染的花生中的黄曲霉菌70％以上来自于花生土壤中的黄曲霉菌，花生在种植和收获过程中被土壤中的黄曲霉菌侵染后，在各个环节遇适宜的环境则会快速繁殖并产生毒素，导致黄曲霉毒素的污染，即来自土壤中黄曲霉菌的浸染是导致花生及制品中黄曲霉毒素污染的主要因素。因此当发生污染时，能够借助一定的方法和技术来追溯黄曲霉菌污染发生的源头，即追溯到污染花生的产地，再通过一定的技术方法(如改良种植方式、种植抗黄曲霉菌的花生品种、添加拮抗菌等)来减少土壤中黄曲霉菌，就可从根本上防控花生中黄曲霉毒素的污染；此外对于黄曲霉菌污染的花生产地溯源，还可为花生黄曲霉毒素的预警提供指导；因此对于花生中黄曲霉毒素污染防控，产地溯源至关重要，是解决黄曲霉毒素污染的根本所在。
目前,依靠传统的表型溯源分析已不能满足公共卫生快速反应体系的需要，因而开展相关微生物的分子特征研究，建立相应的基因信息库，并基于现代分子生物学理论的基因分型技术研究溯源已成为热点。
众所周知，微生物是地球上适应性最强的生物，在地球的各类极端环境中都能发现它们的踪影。微生物为适应不同的生存环境，在漫长的进化中产生了很多变异，造就了微生物丰富的遗传多样性。DNA溯源正是利用这种变异来判断污染的来源，而建立能够区别不同地区来源的黄曲霉菌DNA指纹图谱方法是黄曲霉菌DNA产地溯源的关键所在。
DNA指纹图谱源于个体基因组DNA序列的特异性，这种DNA序列的特异性通过分子标记得以凸现。DNA指纹图谱因为其易分型便于规模化检测，而且检测手段简单快捷、成本低廉等优点成为目前国际上公认的最具发展潜力的分子技术，应用于众多国家的食品追溯系统，如美国、法国、加拿大、比利时、意大利、日本、乌拉圭、澳大利亚和新西兰等，而在我国则刚刚起步，且未见有关于食品中黄曲霉菌污染的DNA指纹图谱建立的报道。DNA指纹图谱使用的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)、SNP标记(单核苷酸多态性)和ISSR(简单重复序列多态性)等。ISSR技术利用真核生物基因组内广泛存在的简单重复序列设计单一通用引物，在此通用引物的3’或5’端加1-4个嘧啶碱基或锚定嘌呤，以此16-18bp的短重复序列作为引物，来扩增两个序列相同但方向相反的微卫星重复序列之间的单拷贝序列，然后经电泳分离获得PCR扩增图谱，相比较其它的DNA分子标记方法，ISSR引物设计简单，具有普遍适用性、多态性高、重复性好等特点，ISSR分子标记已经在遗传多样性、指纹图谱的构建、基因定位、品种鉴定、遗传进化和系统发育等方面得到广泛应用。
利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，其关键就是能够找到能够区别于不同地区来源的黄曲霉菌中的DNA位点，通过分子标记技术寻找出具有产地属性的黄曲霉菌DNA指纹图谱，目前未见有利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的报道。
发明内容
本发明的目的是在针对花生黄曲霉毒素污染产地溯源管理的需求，填补针对我国不同产地花生黄曲霉菌污染DNA溯源技术的缺口，提供一种针对我国花生不同产地属性DNA指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的花生产地属性的DNA指纹图谱，从而能够为花生黄曲霉菌污染的产地溯源提供理论和参考依据和技术支持。
本发明的一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，
包括以下步骤：
(1)黄曲霉菌的分离：对不同产地的花生进行黄曲霉菌的分离、纯化、鉴定。
(2)样品DNA提取：对来自不同产区的花生中分离的黄曲霉菌进行DNA提取，通过纯化试剂盒纯化后-20℃保存备用。
(3)分别使用引物R1、R2、R3对提取的花生黄曲霉菌DNA进行PCR扩增。R1引物为：AGAGAGAGAGAGAGAGG；R2引物为CACACACACACACACAA；R3引物为AGAGTTGGTAGCTCTTGATC。
(4)PCR产物进行凝胶电泳分析，记录每条引物反应的扩增结果。电泳图谱中每一条扩增带均代表引物与模板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，有带的记为1，无带的记为0，进行统计。
(5)利用NTSYSpc(Version2.10e)软件进行聚类分析，获得不同产地的花生黄曲霉菌DNA指纹图谱。
优选的，一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法步骤(1)黄曲霉菌的分离方法为：取10g不同产地的花生，加入90mL0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基上，30℃黑暗培养5d。挑取长有黄色孢子的黄曲霉菌在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。黄曲霉菌的鉴定采用形态鉴定和分子鉴定，形态鉴定的方法是利用AFPA培养基进行鉴定；黄曲霉和寄生曲霉在AFPA培养基上背面会产生亮橘色的颜色。具体操作为挑取保存于MEA培养基上的菌株于AFPA培养基上，30℃培养3-5d，选择AFPA培养基背面为亮橘色的菌株进行分子鉴定。分子鉴定的方法为：通过真菌钙调基因序列对菌株进行分子鉴定(Rodrigues,etal.,2011)。黄曲霉基因组钙调蛋白PCR扩增所用的引物为CL1：GARTWCAAGGAGGCCTTCTC和CL2A：TTTTTGCATCATGAGTTGGAC。PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLASTresearches上比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
优选的，一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法步骤(2)黄曲霉菌DNA提取采用氯化苄法，DNA纯化采用试剂盒柱层析法。
优选的，一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法步骤(3)PCR反应体系为(20μL)10×PCRbuffer2.0μL，1.4UTaqDNA聚合酶，0.35mmol/LdNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/LMgCl2。
反应条件为：93℃预变性5min，1个循环；93℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共40个循环；72℃最后延伸6min。
优选的，一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法步骤(4)凝胶电泳条件为：1.4％琼脂糖凝胶(含有染色剂)，100V的电压，30min。
本发明的有点如下：
(1)本发明方法稳定、重现性好、易于掌握。
(2)本发明所选引物特异性好，能将中国花生主产区黄曲霉菌污染溯源至单个产地或者范围较小的片区，可作为中国花生主产地黄曲霉菌污染的产地溯源理论方法和技术支持。
附图说明
图1是一个样品的三个平行试验图谱
图2是来自不同地区的花生黄曲霉菌ISSR聚类分析图
图3是来自山东青岛的7株菌株的R1引物ISSR图谱
图4是来自山东青岛的7株菌株的R2引物ISSR图谱
图5是来自山东青岛的7株菌株的R3引物ISSR图谱
图6是来自辽宁阜新的7株菌株的R1引物ISSR图谱
图7是来自辽宁阜新的7株菌株的R2引物ISSR图谱
图8是来自辽宁阜新的7株菌株的R3引物ISSR图谱
图9是来自湖北大悟的7株菌株的R1引物ISSR图谱
图10是来自湖北大悟的7株菌株的R2引物ISSR图谱
图11是来自湖北大悟的7株菌株的R3引物ISSR图谱
具体实施方式
实施例1—本发明方法稳定、重现性好，易于掌握
按照本发明的方法对一株黄曲霉菌进行R1引物的ISSR标记的三个平行，其图谱见图1。其中M为DNAmarker。图1可以看出，本发明的方法方法稳定，重现性好，背景清晰，条带亮度高。
实施例2—本发明能将中国花生主产区黄曲霉菌污染溯源至单个产地或者范围较小的片区
按照本发明的方法对24株分离自不同地区的黄曲霉菌进行R1、R2、R3引物的ISSR标记，结果进行聚类分析，图谱图2。从图2可以看出，每个地区的菌株都能通过该方法与别的地区的菌株分离开，因此，本发明能将中国花生主产区黄曲霉菌污染溯源至单个产地或者范围较小的片区。
实施例3—花生黄曲霉菌样本：7株分离自山东省青岛市胶南市宝山镇向阳村产的花生中的黄曲霉菌
(1)7株黄曲霉菌的分离：对山东省青岛市胶南市宝山镇向阳村产的花生进行黄曲霉菌的分离、纯化、鉴定。
取10g不同产地的花生，加入90mL0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基上，30℃黑暗培养5d。挑取长有黄色孢子的黄曲霉菌在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。黄曲霉菌的鉴定采用形态鉴定和分子鉴定，形态鉴定的方法是利用AFPA培养基进行鉴定；黄曲霉和寄生曲霉在AFPA培养基上背面会产生亮橘色的颜色。具体操作为挑取保存于MEA培养基上的菌株于AFPA培养基上，30℃培养3-5d，选择AFPA培养基背面为亮橘色的菌株进行分子鉴定。分子鉴定的方法为：通过真菌钙调基因序列对菌株进行分子鉴定(Rodrigues,etal.,2011)。黄曲霉基因组钙调蛋白PCR扩增所用的引物为CL1：GARTWCAAGGAGGCCTTCTC和CL2A：TTTTTGCATCATGAGTTGGAC。PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLASTresearches上比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
(2)提取样品DNA：对来自不同产区的花生中分离的黄曲霉菌进行DNA提取，通过纯化试剂盒纯化后-20℃保存备用。
(3)分别使用引物R1、R2、R3对提取的花生黄曲霉菌DNA进行PCR扩增。R1引物为：AGAGAGAGAGAGAGAGG；R2引物为CACACACACACACACAA；R3引物为AGAGTTGGTAGCTCTTGATC。PCR反应体系为(20μL)10×PCRbuffer2.0μL，1.4UTaqDNA聚合酶，0.35mmol/LdNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/LMgCl2。反应条件为：93℃预变性5min，1个循环；93℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共40个循环；72℃最后延伸6min。
(4)PCR产物进行凝胶电泳分析，记录每条引物反应的扩增结果。凝胶电泳条件为：1.4％琼脂糖凝胶(含有染色剂)，100V的电压，30min。电泳图谱中每一条扩增带均代表引物与模板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，有带的记为1，无带的记为0，进行统计。
(5)利用NTSYSpc(Version2.10e)软件进行聚类分析，获得不同产地的花生黄曲霉菌DNA指纹图谱。
山东省青岛市胶南市宝山镇向阳村产的花生中分离的7株黄曲霉菌经按顺序依次进行R1、R2、R3引物扩增得到的DNA图谱见图3-图5。其中M为DNAmarker，1-7为样品编号。
实施例4—花生黄曲霉菌样本：7株分离自辽宁省阜新市蒙古族自治县他本县皂力村的花生中的黄曲霉菌
(1)7株黄曲霉菌的分离：对辽宁省阜新市蒙古族自治县他本县皂力村的花生进行黄曲霉菌的分离、纯化、鉴定。
取10g不同产地的花生，加入90mL0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基上，30℃黑暗培养5d。挑取长有黄色孢子的黄曲霉菌在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。黄曲霉菌的鉴定采用形态鉴定和分子鉴定，形态鉴定的方法是利用AFPA培养基进行鉴定；黄曲霉和寄生曲霉在AFPA培养基上背面会产生亮橘色的颜色。具体操作为挑取保存于MEA培养基上的菌株于AFPA培养基上，30℃培养3-5d，选择AFPA培养基背面为亮橘色的菌株进行分子鉴定。分子鉴定的方法为：通过真菌钙调基因序列对菌株进行分子鉴定(Rodrigues,etal.,2011)。黄曲霉基因组钙调蛋白PCR扩增所用的引物为CL1：GARTWCAAGGAGGCCTTCTC和CL2A：TTTTTGCATCATGAGTTGGAC。PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLASTresearches上比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
(2)提取样品DNA：对来自不同产区的花生中分离的黄曲霉菌进行DNA提取，通过纯化试剂盒纯化后-20℃保存备用。
(3)分别使用引物R1、R2、R3对提取的花生黄曲霉菌DNA进行PCR扩增。R1引物为：AGAGAGAGAGAGAGAGG；R2引物为CACACACACACACACAA；R3引物为AGAGTTGGTAGCTCTTGATC。PCR反应体系为(20μL)10×PCRbuffer2.0μL，1.4UTaqDNA聚合酶，0.35mmol/LdNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/LMgCl2。反应条件为：93℃预变性5min，1个循环；93℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共40个循环；72℃最后延伸6min。
(4)PCR产物进行凝胶电泳分析，记录每条引物反应的扩增结果。凝胶电泳条件为：1.4％琼脂糖凝胶(含有染色剂)，100V的电压，30min。电泳图谱中每一条扩增带均代表引物与模板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，有带的记为1，无带的记为0，进行统计。
(5)利用NTSYSpc(Version2.10e)软件进行聚类分析，获得不同产地的花生黄曲霉菌DNA指纹图谱。
辽宁省阜新市蒙古族自治县他本县皂力村的花生中分离的7株黄曲霉菌经按顺序依次进行R1、R2、R3引物扩增得到的DNA图谱见图6-图8。其中M为DNAmarker，1-7为样品编号。
实施例5—花生黄曲霉菌样本：7株分离自湖北省孝感市大悟县刘集镇店岗村的花生中的黄曲霉菌
(1)7株黄曲霉菌的分离：对湖北省孝感市大悟县刘集镇店岗村的花生进行黄曲霉菌的分离、纯化、鉴定。
取10g不同产地的花生，加入90mL0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基上，30℃黑暗培养5d。挑取长有黄色孢子的黄曲霉菌在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。黄曲霉菌的鉴定采用形态鉴定和分子鉴定，形态鉴定的方法是利用AFPA培养基进行鉴定；黄曲霉和寄生曲霉在AFPA培养基上背面会产生亮橘色的颜色。具体操作为挑取保存于MEA培养基上的菌株于AFPA培养基上，30℃培养3-5d，选择AFPA培养基背面为亮橘色的菌株进行分子鉴定。分子鉴定的方法为：通过真菌钙调基因序列对菌株进行分子鉴定(Rodrigues,etal.,2011)。黄曲霉基因组钙调蛋白PCR扩增所用的引物为CL1：GARTWCAAGGAGGCCTTCTC和CL2A：TTTTTGCATCATGAGTTGGAC。PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLASTresearches上比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
(2)提取样品DNA：对来自不同产区的花生中分离的黄曲霉菌进行DNA提取，通过纯化试剂盒纯化后-20℃保存备用。
(3)分别使用引物R1、R2、R3对提取的花生黄曲霉菌DNA进行PCR扩增。R1引物为：AGAGAGAGAGAGAGAGG；R2引物为CACACACACACACACAA；R3引物为AGAGTTGGTAGCTCTTGATC。PCR反应体系为(20μL)10×PCRbuffer2.0μL，1.4UTaqDNA聚合酶，0.35mmol/LdNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/LMgCl2。反应条件为：93℃预变性5min，1个循环；93℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共40个循环；72℃最后延伸6min。
(4)PCR产物进行凝胶电泳分析，记录每条引物反应的扩增结果。凝胶电泳条件为：1.4％琼脂糖凝胶(含有染色剂)，100V的电压，30min。电泳图谱中每一条扩增带均代表引物与模板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，有带的记为1，无带的记为0，进行统计。
(5)利用NTSYSpc(Version2.10e)软件进行聚类分析，获得不同产地的花生黄曲霉菌DNA指纹图谱。
湖北省孝感市大悟县刘集镇店岗村的花生中分离的7株黄曲霉菌经按顺序依次进行R1、R2、R3引物扩增得到的DNA图谱见图9-图11。其中M为DNAmarker，1-7为样品编号。
Claims (5)
1.一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，包括黄曲霉菌DNA提取、ISSR-PCR反应、反应产物的电泳图谱的分析，其特征在于包括以下步骤：
(1)黄曲霉菌的分离：对不同产地的花生进行黄曲霉菌的分离、纯化、鉴定。
(2)样品DNA提取：对来自不同产区的花生中分离的黄曲霉菌进行DNA提取，通过纯化试剂盒纯化后-20℃保存备用。
(3)分别使用引物R1、R2、R3对提取的花生黄曲霉菌DNA进行PCR扩增。R1引物为：AGAGAGAGAGAGAGAGG；R2引物为CACACACACACACACAA；R3引物为AGAGTTGGTAGCTCTTGATC。
(4)PCR产物进行凝胶电泳分析，记录每条引物反应的扩增结果。电泳图谱中每一条扩增带均代表引物与模板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，有带的记为1，无带的记为0，进行统计。
(5)利用NTSYSpc(Version2.10e)软件进行聚类分析，获得不同产地的花生黄曲霉菌DNA指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，其特征在于步骤(1)黄曲霉菌的分离方法为：取10g不同产地的花生，加入90mL0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10-1菌悬液；取0.1mL菌液，涂布在DG18培养基上，30℃黑暗培养5d。挑取长有黄色孢子的黄曲霉菌在DG18培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。黄曲霉菌的鉴定采用形态鉴定和分子鉴定，形态鉴定的方法是利用AFPA培养基进行鉴定；黄曲霉和寄生曲霉在AFPA培养基上背面会产生亮橘色的颜色。具体操作为挑取保存于MEA培养基上的菌株于AFPA培养基上，30℃培养3-5d，选择AFPA培养基背面为亮橘色的菌株进行分子鉴定。分子鉴定的方法为：通过真菌钙调基因序列对菌株进行分子鉴定。黄曲霉基因组钙调蛋白PCR扩增所用的引物为CL1：GARTWCAAGGAGGCCTTCTC和CL2A：TTTTTGCATCATGAGTTGGAC。PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLASTresearches上比对。
3.根据权利要求1所述的一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，其特征在于步骤(2)黄曲霉菌DNA提取采用氯化苄法，DNA纯化采用试剂盒柱层析法。
4.根据权利要求1所述的一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，其特征在于步骤(3)PCR反应体系为(20μL)10×PCRbuffer2.0μL，1.4UTaqDNA聚合酶，0.35mmol/LdNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/LMgCl2。反应条件为：93℃预变性5min，1个循环；93℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共40个循环；72℃最后延伸6min。
5.根据权利要求1所述的一种利用ISSR分子标记技术建立不同产地花生黄曲霉菌DNA指纹图谱的方法，其特征在于步骤(4)凝胶电泳条件为：1.4％琼脂糖凝胶(含有染色剂)，100V的电压，30min。
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