CN108949908B - 两步基因组比较法设计贵州木霉njau 4742定量pcr特异性引物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法。本发明首先将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，再将筛选得到的片段与同种菌株916的全基因组比对，设计出系列具独特碱基的引物序列。同时，还选用gfp标记菌株gfp‑NJAU 4742中插入的标记片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准。通过同属不同种菌株扩增特异性检验、土壤添加再检测、盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出最优的定量PCR引物。本发明的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和贵州木霉NJAU 4742的定量提供方法。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及对一株贵州木霉NJAU 4742的定量PCR技术的特异性引物的设计及应用。
背景技术
在过去的十几年中，对目标植物有利生长的研究中已经将大量功能性微生物菌剂直接接种到土壤中或与有机肥料结合作为土壤改良剂。因此，接种菌株在新环境中的存活在其功能表现上起着关键作用，因为有效的定殖是功能菌株刺激植物生长或对土壤微生物生态系统有利诱导的根本前提。
传统上选择性培养基多被用于检测或分离环境中的有益促生菌，然而，该方法灵敏度较低且耗时，并且对于形态上相似度极高的真菌种难以准确识别。基于DNA分析，定量PCR(qPCR)技术可以准确定量土壤中多种微生物的丰度，已成为当前分子生物学及微生物生态学研究和应用中使用最多的技术之一，其方法利用引物组定量扩增一段不含任何副产物(非特异性DNA)的特异DNA片段的拷贝，因此引物设计是qPCR中至关重要的一环。目前常用的引物设计必须首先寻找到具有特异性的序列(通常的做法是，从文献中获取物种特异性基因，并根据其保守的范围确定其通用性)，然而，从文献中获得的所谓“物种特异性基因”往往信息比较滞后，并未基于不断增长的基因组数据进行必要的更新，导致基于该基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其特异性。有研究者基于木霉属共有的内部转录组间隔区(ITS)对木霉菌属设计引物且在不同的土壤中进行检测和定量；然而，这对于木霉种的区分是不够特异的。也有研究者利用SCAR标记技术能够对物种进行准确鉴定和监测，然而此分子方法基于对RAPD序列的分析，这是十分费时费力的过程。
木霉菌属的真菌在土壤中广泛存在，被认为是一种理想的生物防治剂，具有特定的生物防治机制，包括产生抗生素，具有竞争及诱导抗性等。同时，一些具有根际定殖能力的木霉菌株通过增加养分吸收以及刺激植物防御生物和非生物损害为植物生长提供直接或间接的促进作用。贵州木霉属于哈茨木霉菌种的亚种，贵州木霉NJAU 4742在国内已被广泛应用于商业生物制剂的固体发酵和生物肥料开发(专利申请号200910233576.1，CN201610003589.X和CN201610440785.3)。该菌株具有较强的促进植物生长的能力并含有多种优势基因。因此，探索来自功能性菌株贵州木霉4742的新型产品的开发以及通过定量PCR技术监测其在植物根系的动态变化，揭示其在农业生产实践的潜在促生机制尤为重要。
发明内容
本发明旨在针对现有实时定量PCR特异性引物设计技术的局限，提供一种两步比较基因组法，基于真菌特异性片段设计菌株特异性定量PCR引物的方法；并利用两步比较基因组法设计了贵州木霉NJAU 4742的菌株特异性定量PCR引物。
一种两步基因组比较设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法；包括如下步骤：
(1)将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，
(2)将筛选得到的片段与同胞菌株916全基因组一一比对，得到一系列具体区分菌株916的独特碱基序列作为NJAU 4742全基因组引物序列设计的来源，利用Oligo 6软件实施引物序列设计，设定产物大小为100-200bp，引物长度为22±2bp，共设计10对引物，同时，选用由农杆菌介导的gfp标记菌株gfp-NJAU 4742中插入的单拷贝片段按照上述参数设计三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准；另选用一对已报道哈茨木霉引物作为对照；
(3)选用gfp标记菌株gfp-NJAU 4742中的单拷贝片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准，再通过与同属不同种菌株依次交叉扩增特异性检验、土壤添加扩增特异性再检测、盆栽土壤实际检测等步骤，筛选出如下两对最优的贵州木霉NJAU 4742定量PCR引物；P6：上游引物如SEQ IDNO.11所示和下游引物如SEQ ID NO.12所示；P7：上游引物如SEQ ID NO.13所示和下游引物如SEQ ID NO.14所示。
gfp标记菌株gfp-NJAU 4742的构建方法如下：通过农杆菌介导转化方法，将质粒pCAMBIA-gfp中T-DNA插入至NJAU 4742基因组中，获得成功标记且稳定遗传的木霉gfp-NJAU 4742菌株，并通过southern blotting实验验证其插入片段为单拷贝。最后，结合Biolog分析与病原真菌的平板对峙试验结果显示了荧光标记菌株具有与野生型相同的表型特征及重寄生能力，具体见已发表论文(Jian Zhang,Gunseli Bayram Akcapinar,LeaAtanasova,Mohammad Javad Rahimi,Agnieszka Przylucka,Dongqing Yang,ChristianP.Kubicek,Ruifu Zhang,Qirong Shen,Irina S.Druzhinina.The neutralmetallopeptidase NMP1of Trichodermaguizhouenseis required for mycotrophyandself-defence.Environmental Microbiology,2016,18(2),580–597)。
按照上述的方法设计的贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物，选自P6和P7中的任意一对；P6：上游引物如SEQ ID NO.11所示和下游引物如SEQ ID NO.12所示；P7：上游引物如SEQ ID NO.13所示和下游引物如SEQ ID NO.14所示。
本发明所述的贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物在制备贵州木霉NJAU 4742定量PCR试剂盒中的应用。
本发明所述的贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物在贵州木霉NJAU4742定量和/或定性检测中的应用。
有益效果
本发明的引物设计方法和设计的菌株特异性引物能够为其他菌株的定量PCR特异性引物设计和贵州木霉NJAU 4742的定量提供方法，该方法设计的两对引物用于贵州木霉NJAU 4742的定量特异性好、准确度高。
附图说明
图1基于贵州木霉NJAU 4742基因组设计的10对引物对不同木霉种菌株的交叉扩增。条带M,DL2000DNA标记；条带1,贵州木霉NJAU 4742；2,T.lixii2784(TUCIM NO.)；3,贵州木霉3009；4,贵州木霉1044；5,贵州木霉4843；6,哈茨木霉1818；7,贵州木霉3611；8,贵州木霉1651；9,贵州木霉53；10,哈茨木霉916；11,T.atrobrunneum 271；12,Hypocrea'pseudoharzianum'nom.prov.2610；13,T.afroharzianum 51；14,Hypocrea'pseudoharzianum'nom.prov.2710and15,T.pyrimidale 2673。引物ITS1作为阳性对照.
图2使用M13通用引物对14个克隆质粒的普通PCR扩增验证
图3不同土壤类型及添加木霉属相近菌株处理对贵州木霉gfp-NJAU 4742定量效果的影响。图中字母代表基于图基检验下的不同引物检测拷贝的显著性。
图4土壤中接种贵州木霉NJAU 4742不同孢子浓度梯度的定量检测。每组柱状图中左边的为P6,右边的为P7。
图5辣椒盆栽中特异性引物对贵州木霉NJAU 4742数量的检测。图中字母代表基于图基检验下的不同引物检测拷贝的显著性。
生物样品保藏信息
NJAU4742，分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年04月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.12166。
具体实施方式
实施例1供试菌株来源
本发明中所实验的贵州木霉NJAU 4742(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年4月11日，保藏编号为CGMCC NO.12166)及由农杆菌介导的gfp标记的NJAU 4742菌株gfp-NJAU 4742由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室提供，gfp菌株的构建简单描述如下：通过农杆菌介导转化方法，将质粒pCAMBIA-gfp中T-DNA插入至NJAU 4742基因组中，获得成功标记且稳定遗传的木霉gfp-NJAU 4742菌株，并通过southernblotting实验验证其插入片段为单拷贝。最后，结合Biolog分析与病原真菌的平板对峙试验结果显示了荧光标记菌株具有与野生型相同的表型特征及重寄生能力,具体见已发表论文(Jian Zhang,Gunseli Bayram Akcapinar,LeaAtanasova,Mohammad Javad Rahimi,Agnieszka Przylucka,Dongqing Yang,ChristianP.Kubicek,Ruifu Zhang,Qirong Shen,Irina S.Druzhinina.The neutralmetallopeptidase NMP1of Trichodermaguizhouenseis required for mycotrophyandself-defence.Environmental Microbiology,2016,18(2),580–597)。。在此之外，同时选用一对已报道哈茨木霉引物作为阳性对照。同时选取了14株同属与哈茨木霉进化枝中同源性高度相近的菌株，保藏在奥地利维也纳科技大学化工学院微生物工程保藏中心(表1)。
表1用于引物分析的菌株及其相应的GenBank登录号
注-：未登记。
实施例2引物序列选择及交叉扩增验证
本发明采用两步比对法基于数据库对两株同胞相近的菌株的全基因组序列比对，以寻找只针对NJAU 4742的特异性序列。第一步：将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI两大权威数据库中筛选比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段。第二步：将筛选得到的片段与同胞菌株916全基因组一一比对，得到一系列具体区分菌株916的独特碱基序列作为NJAU 4742全基因组引物序列设计的来源。同时，本发明还选用由农杆菌介导的gfp标记菌株gfp-NJAU 4742中插入的单拷贝片段设计了三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准。利用Oligo 6软件实施引物序列设计，设定产物大小为100-200bp，引物长度为22±2bp，共设计13对引物，其中10对基于基因组序列，三对基于gfp插入序列，并选用一对已报道哈茨木霉引物一并用于本发明(表2)。另外，来自14种其他木霉种的基因组序列和我们的目标菌株的DNA被引物P1-P10依次交叉扩增模板，用于对引物特异性的测试(图1)。使用Funal DNA试剂盒(OMEGA)的方法从50至100mg菌丝体中提取各真菌的总DNA。
表2引物信息
在使用14种其他木霉属物种和菌株NJAU 4742基因组DNA作为模板，对10对来自基因组设计的木霉引物的交叉扩增结果中表明，引物P1和P3-P10当且仅当以菌株NJAU4742DNA用作模板时才产生扩增，引物ITS1扩增出所有测试的木霉菌菌株DNA模板，而引物P2产生除目标菌株NJAU 4742模板外，对菌株T.guizhouense 1044和T.guizhouense 1651的非特异性扩增，在下一步研究中舍去。(图1)。
实施例3质粒的构建及定量PCR
将来自贵州木霉NJAU 4742基因组中所选靶基因区域设计的10对引物，gfp插入片段设计的3对引物(两对引物P11和P13设计于gfp基因相关，P12设计于GFP蛋白上连有的一段潮霉素基因，这段基因用于筛选标记菌株，潮霉素片段和GFP是连在一起的整体)及引物ITS1扩增产物的片段(表2)分别克隆到pMD19-T载体(TaKaRa)中，并将质粒转化进大肠杆菌Top10细胞中，使用PMD19-T通用序列引物M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO.43)和M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO.44)，做PCR扩增验证质粒中的片段，并由南京金斯瑞生物技术有限公司测序。使用分光光度计(NanoDrop2000，Thermo Scientific Inc.，USA)测量质粒的DNA浓度。在7500实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)上使用Premix Ex TaqTM(TaKaRa)在20μl反应体系中进行梯度qPCR扩增。插入不同片段的质粒用于制备10倍稀释系列(一式三份)。使用无菌水作为阴性对照。自动确定每个样品的循环阈值(CT)值。通过将CT值与DNA浓度的对数作图(数据未显示)并用于计算扩增效率(E)来产生标准曲线。从标准曲线计算未知样品中的初始目标基因拷贝数(所有基因片段均为单拷贝)。
使用通用引物M13对14个克隆质粒的构建进行扩增检测，琼脂糖凝胶电泳上观察到14对引物所产生的预期大小的产物片段被成功插入载体，结合测序结果得到扩增序列与目标模板一致(数据未展示)，表明用于制作qPCR标准曲线的14个引物对的克隆质粒被成功构建(图2)，通过不同质粒浓度扩增的14对引物的标准曲线结果中，溶解曲线及扩增效率作为引物特异性及灵敏性的参考参数，其中引物P6，P7，P8，P11，P12和P13和P8表现出较高的扩增效率及单一的溶解曲线峰，且最佳扩增条件见(表3)，其他引物对在下一步研究中舍去。
表3 qPCR扩增引物条件及参数
实施例4 NJAU 4742接种土壤实验
本发明从江苏南京，江苏大丰，云南禄劝三个地区选取不同理化性质的黄棕壤，盐碱土，红壤，pH分别为中性，碱性和酸性的三种土壤用于接种菌株的培育实验，每种类型土壤分别接种单菌gfp-NJAU 4742的孢子液，14株相近菌株混合液和含有gfp-NJAU 4742混合的15株菌株孢子液及等量的水，每处理三个重复，28℃黑暗培养7天。其中黄棕壤同时被用来接种NJAU 4742孢子液不同浓度梯度的实验。
如图3所示，正如预期，来自报道的哈茨木霉通用引物对ITS1显示了最高的拷贝数，表明ITS1产生了对土壤土著或接种的木霉属相近物种的非特异性扩增。这与它在溶解曲线中显示的双峰结果一致。同时，引物P10的值与ITS1非常接近，表明P10中也存在非特异性扩增，在随后的实验中被丢弃。除此之外，其余3个引物对(P6，P7，P8)和3个标准引物对(P11，P12，P13)之间没有显着差异，这些引物对gfp-NJAU 4742的拷贝数均显示了一致数量范围，表明这些引物对菌株gfp-NJAU 4742的检测是足够特异性的。此外，引物P6-P8和P10-P13同时对添加了等体积水的对照处理的土壤样品进行qPCR，CT值均高于32，表明原始土壤中不存在gfp-NJAU 4742。
图4中显示了引物P6和P7对添加不同NJAU 4742孢子浓度梯度的土壤中的定量PCR结果，两个引物检测到的NJAU 4742拷贝值随着添加的孢子浓度的增加呈现出增加的趋势，并且两种引物之间没有显着差异，表明它们能够准确定量土壤中NJAU 4742中的拷贝数，且在孢子浓度在4-8次方间能够灵敏的呈梯度区分。在本次实验中低于103孢子接种的土壤中CT值均在32以上，处于检测水平之下数据未显示。
实施例5利用特异性引物对辣椒盆栽中gfp-NJAU 4742菌株的定量
2017年4月-8月在江苏淮安温室中进行了辣椒盆栽实验。辣椒移栽苗分别来自于普通育苗基质所育种苗和生物育苗基质所育种苗。生物基质是通过在普通育苗基质中接种gfp-NJAU 4742孢子液获得，其孢子终浓度不低于107g-1(干重，下同)。盆栽试验包括以下四种处理：(a)OF处理，移栽普通育苗基质所育种苗，土中施有1.5％鸡粪有机肥；(b)OFBS处理，移栽生物育苗基质所育种苗，土中施有1.5％(质量比，下同)鸡粪有机肥；(c)BF处理，移栽普通育苗基质所育种苗，土中施有1.5％鸡粪生物有机肥。生物有机肥料是通过将10％的gfp-NJAU 4742孢子液接种于一次腐熟发酵的秸秆粉中固体发酵7天后，按10％与鸡粪有机肥混合。生物有机肥中最终孢子浓度不低于108g-1。(d)BFBS处理，移栽生物育苗基质所育种苗，土中施有1.5％鸡粪生物有机肥。每盆装有5kg土，每个处理10盆重复。鸡粪堆肥由中国江苏南通惠农有限公司提供。待挂果期，分别收集根际，土体土，每个土壤样品做三个生物学重复保存与-80℃，以备使用。所有土壤样品DNA分别用引物对P6，P7，P11和P12进行定量PCR，以检测gfp-NJAU 4742的总数。每个样品进行三次重复。
将引物P6，P7，P11和P12分别对OFBS，OF，BF和BFBS四种处理的土壤样品中的gfp-NJAU 4742的数量进行定量PCR检测，然而OF处理中未检测到(CT值均大于32，数据未显示)(图5)。在OFBS，BF和BFBS处理中，根际土样中gfp-NJAU 4742的拷贝数均高于土体样品，无论在根际和土体土壤中，OFBS处理gfp-NJAU 4742的数量是最少的。根际土中BFBS和BF中gfp-NJAU4742的数量相近，土体土中BFBS中的数量略高于BF中的数量。此外，无论OFBS，BF或BFBS处理中的土体和根际土壤，引物P6和P7都对gfp-NJAU 4742的拷贝数显示相近的值，并且该值与标准系参考引物对P11和P12的值一致，表明引物对P6，P7能够有效且灵敏的检测天然土壤中gfp-NJAU 4742的数量,与实施例4中NJAU 4742的梯度定量试验吻合,也证明了P6，P7能够有效且灵敏的对NJAU 4742。
序列表
<110> 南京农业大学
南京农业大学淮安研究院
<120> 两步基因组比较法设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cgtctgctgc tccatacaa 19
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccgatagtg gaaaccga 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttgtggccg tttacgtcg 19
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acaactccca aacccaatgt ga 22
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgttgttgaa agttttgatt cattt 25
<210> 29
<211> 127
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtggcgaaaa ctctcatact cgtaataggt atgatagcaa caagagcttg catgaaaaag 60
atccgatctt tttaagtctt ttggggtaac aaggtgctac tgaaagcacg gcaaacttga 120
tttatag 127
<210> 30
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcccactcaa attgcgaaca tagtcggcat atttttcttg tagtctgctt ttgtggaaca 60
gtcgtatgga ttcattaatt ttgtgaacaa agacgccaaa aagtaggtcg cacaatggac 120
gattgatgag tatgtcgtcg tcg 143
<210> 31
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tggtctaacg gctcttcaac ataatgagaa ctctattgtt accaattagt atgcaattaa 60
tattggtaca agcagtggcc ggtagtgcca gtcataaaaa acagaactca taataccaga 120
taaagtgtca gtgcct 136
<210> 32
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cgacggaact acatgataag caatatggct gaccgcgatc gcatcttgtc tttcgtaccc 60
ggcatcgttc acaggaaata agacgaggct cattcattta gg 102
<210> 33
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgtctaccaa tcaccagttt acggaggtaa cggcggccat cctgatcagt acgcaaacaa 60
cagctatgga cacaaccaag cttcaggcgt atggaatgcg atgaattttt ctggtaatgg 120
atggaacaat ggtg 134
<210> 34
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgtctaccaa tcaccagttt acggaggtaa cggcggccat cctgatcagt acgcaaacaa 60
cagctatgga cacaaccaag cttcaggcgt atggaatgcg atgaattttt ctggtaatgg 120
atggaacaat ggtg 134
<210> 35
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtggcgtcct tggtcattgt tggctggcca ctgaggcgct tcacaccggt acgccgacga 60
ttcacttctt aggactaaag aaattacctg atatatccga gtatcacatc tatgcctacg 120
ctctgtgt 128
<210> 36
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tatgctggtg gtggtcttag tggtgtcggt cttccattcc tcatggaatg gcttcttgca 60
cgattcggtt acaagatcac actacgcgca ttggctgtag gagtgcttct tcttatcgca 120
cctattcagc cattac 136
<210> 37
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctctacaag ctccaagacc acggaattgc tatgaaatat ggacttttga cagttgatgg 60
tgaagagttt gaccccttga cgcatattga tctcgataaa tgcacaatga caat 114
<210> 38
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctccatcacc tgcatttagt gtgtctctgg tgccgattgc cctttggatt tctggcgtgg 60
acaataacat ggcacccttg tctaaatgtg aacactgcag gacaagcttt gacacagctg 120
gatgccttat gaatcactgt cga 143
<210> 39
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 60
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 120
acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag a 171
<210> 40
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt 60
ctggaggccg tggttggctt gtatggagca gcagacg 97
<210> 41
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaaggaaaa agggcccatg 60
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 120
gacgtaaacg gccacaag 138
<210> 42
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
acaactccca aacccaatgt gaacgttacc aaactgttgc ctcggcggga tctctgcccc 60
gggtgcgtcg cagccccgga ccaaggcgcc cgccggagga ccaaccaaaa ctctttttgt 120
ataccccctc gcgggttttt ttataatctg agccttctcg gcgcctctcg taggcgtttc 180
gaaaatgaat caaaactttc aacaacg 207
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
caggaaacag ctatgacc 18
Claims (4)
1.一种两步基因组比较设计贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物的方法；其特征在于包括如下步骤：
（1）将NJAU 4742全基因组序列在NCBI和JGI数据库中比对，选出没有匹配的大于500bp的基因组片段，
（2）将筛选得到的片段与同胞菌株916全基因组一一比对，得到一系列具体区分菌株916的独特碱基序列作为NJAU 4742全基因组引物序列设计的来源，利用Oligo 6软件实施引物序列设计，设定产物大小为100-200bp，引物长度为22±2 bp，共设计10对引物；同时，选用由农杆菌介导的gfp标记菌株gfp-NJAU 4742中插入的单拷贝片段按照上述参数设计三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准；另选用一对已报道哈茨木霉引物作为对照；
（3）选用gfp标记菌株gfp-NJAU 4742中的单拷贝片段设计的三对引物作为对基于基因组设计的引物特异性的检验标准，再通过与同属不同种菌株依次交叉扩增特异性检验、土壤添加扩增特异性再检测、盆栽土壤实际检测步骤，筛选出如下两对贵州木霉NJAU 4742定量PCR引物；P6：上游引物如SEQ ID NO.11所示和下游引物如SEQ ID NO.12所示；P7：上游引物如SEQ ID NO.13所示和下游引物如SEQ ID NO.14所示。
2.按照权利要求1所述的方法设计的贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物，其特征在于选自P6和P7中的任意一对；P6：上游引物如SEQ ID NO.11所示和下游引物如SEQ IDNO.12所示；P7：上游引物如SEQ ID NO.13所示和下游引物如SEQ ID NO.14所示。
3.权利要求2所述的贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物在制备贵州木霉NJAU4742定量PCR试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的贵州木霉NJAU 4742定量PCR特异性引物在贵州木霉NJAU 4742定量和/或定性检测中的应用。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810768488.0A CN108949908B (zh) | 2018-07-13 | 2018-07-13 | 两步基因组比较法设计贵州木霉njau 4742定量pcr特异性引物的方法 |
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Family
ID=64483947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN101696390B (zh) * | 2009-10-29 | 2010-12-08 | 南京农业大学资产经营有限公司 | 连作黄瓜、西瓜枯萎病的生物防治菌株及其微生物有机肥料 |
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