CN111057751A - 一种基于实时荧光定量pcr检测土壤真菌数量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，属于土壤真菌数量检测领域。本发明公开的方法主要包括：称取过筛的新鲜土壤，利用试剂盒提取土壤总DNA，统一稀释到一定浓度；将生长适度的模板射纹革菌的菌丝利用CTAB法提取总DNA，制备成标准曲线系列模板DNA溶液；将标准曲线或待测土壤模板DNA溶液构建qPCR反应体系，包括根据真菌18S核糖体rRNA保守序列设计的通用qPCR引物；利用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应；绘制出标准曲线；计算每克干土中真菌数量。本发明提供的检测土壤真菌数量的方法，操作安全简便，引物序列特异性好，灵敏度高，结果精准可靠，重现性好。

Description

一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法
技术领域
本发明属于土壤真菌数量检测领域，更具体地说，涉及一种基于实时荧光定量PCR(qPCR)检测土壤真菌数量的方法。
背景技术
真菌在农业和森林土壤生态系统中占有重要地位，每克土壤中真菌数目达到几千万个，根际土壤中真菌数目更是达到100倍之多。研究表明，真菌是连接土壤和植物之间的重要纽带，与植物的生长息息相关。一方面真菌是有机质降解的主要微生物，其分泌的降解酶类是土壤养分转化和能量流动的重要保障，另一方面真菌分泌植物促生或有害物质，增强植物抗病能力或诱导植物感病。同时，真菌也是土壤微生物的主要组分，全球土壤真菌生物量碳约为12Gt(吨)，是土壤细菌(7Gt)的两倍，更是远远超过土壤动物(2Gt)和古细菌(0.5Gt)。由于区域内生物细胞的总丰度决定了土壤中有机质周转率的上限，因此，土壤真菌的数量一定程度上反映土壤群落的基线功能潜力，是评价土壤微生物群落结构、土壤肥力高低和土壤结构改良的可靠指标。同时，由于真菌数量受到土地利用方式、植物群落结构、气候条件和土壤理化性质等众多因素影响。因此，提供一种简单迅速、可批量操作和结果精准的真菌数量检测方法具有重要的意义。
土壤真菌的数量一定程度上反映土壤群落的基线功能潜力，是评价土壤微生物群落结构、土壤肥力高低和土壤结构改良的可靠指标。但我国土壤真菌数量测定方法采用稀释平板法、琼脂膜法、麦角甾醇换算法和几丁质换算法等方法，但存在着方法粗放烦琐、与国际先进方法脱轨以及实验设备落后等诸多问题。以稀释平板法为例，由于全世界已知的真菌种类总数高达510万种，远远超过最初估计的150万种，但其中只有8万种真菌可以人工培养，因此平板培养法局限性很大，不能获得真菌数量的可靠信息；麦角甾醇和几丁质换算法是基于真菌常见而特有的物质来估算土壤真菌的数量，方法虽简单易行，但是特异性差，数据精准度较低；还有利用实时荧光定量PCR测定某一类特殊生理功能真菌，如发明专利201610473539.8，公开了基于实时荧光定量PCR检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法，该方法灵敏度虽高，但并不能表征土壤真菌整体数量。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，包括如下步骤：
1)提取土壤样品总模板DNA并测定DNA浓度，稀释制成待测土壤模板DNA溶液；
2)提取射纹革菌的菌丝中总DNA并测定DNA浓度，制备成标准曲线模板DNA溶液；
3)将标准曲线模板DNA溶液或待测土壤模板DNA溶液分别进行qPCR反应体系构建，所述qPCR反应体系包括针对常见土壤真菌18S核糖体rRNA保守序列设计的通用qPCR引物，所述通用qPCR引物包括：上游引物FF390序列为5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；下游引物FR1序列为5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I为次黄嘌呤碱基；
4)对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应；
5)以标准曲线模板DNA溶液中的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线：y＝ax+b，其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列；
6)计算待测土壤模板DNA溶液的目标特异性片段总拷贝数N(copy)＝10(Ct-b)/a，式中Ct为待测土壤模板DNA溶液测定的具体循环数，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列；
7)计算土壤样品每克干土的真菌数量＝(c*V*N)/(cr*Vr*m)，单位为copy/g；式中c为土壤样品总模板DNA浓度，单位为ng/μL；cr为待测土壤模板DNA溶液的浓度，单位为ng/μL；V为土壤样品总模板DNA的体积，单位为μL，Vr为待测土壤模板DNA溶液的体积，单位为μL；m为用于提取总模板DNA的土壤样品干重，单位为g。
进一步地，步骤1)具体为：称取0.3g过2mm筛的新鲜土壤，利用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取土壤样品总DNA并溶于灭菌双蒸水中，测定DNA浓度，并将浓度统一稀释到4-6ng/μL，作为待测土壤模板DNA溶液。
进一步地，步骤2)具体为：将22℃下180rpm震荡马铃薯液体培养基培养生长2天的射纹革菌的菌丝倒扣在已灭菌的纱布上，拧干菌丝水分后于液氮中研磨成粉末；利用CTAB法提取0.2g所述粉末的总DNA，将所述总DNA溶于灭菌双蒸水中，制备成标准曲线模板DNA母液，测定其DNA浓度，制备标准曲线模板DNA溶液。
进一步地，所述制备标准曲线模板DNA溶液的具体方法为：利用已知的射纹革菌基因组碱基数40.92Mb和质量4.48432×10-5ng及其目标特异性片段拷贝数5个/基因组，计算出标准曲线模板DNA母液中的目标特异性片段拷贝浓度，单位为copy/μL；取适量母液加入灭菌双蒸水调节目标特异性片段拷贝浓度至108copy/5μL；取10μL 108copy/5μL模板DNA溶液加入灭菌双蒸水依次稀释为107copy/5μL，106copy/5μL，105copy/5μL，104copy/5μL，103copy/5μL的标准曲线模板DNA溶液，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列。
进一步地，步骤3)中所述qPCR反应体系构建的方法具体为：在96孔荧光定量板上，依次加入标准曲线模板DNA溶液/待测土壤模板DNA溶液5μL，10μM上游引物FF390溶液0.5μL，10μM下游引物FR1溶液0.4μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，再用灭菌双蒸水将反应体系调节至20μL；用透明封膜密封96孔荧光定量板，采用微孔板离心机离心混匀。
进一步地，步骤4)具体为：利用ABI7500实时荧光定量PCR仪对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应，反应步骤为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火+延伸1min，45个循环。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
1)操作安全简便，省去人工培养或浸提萃取步骤，大大减少操作时间，且反应条件高度一致；
2)针对常见真菌18S核糖体rRNA保守序列设计引物，使用的引物序列特异性好，测试灵敏度高，利用真菌18S核糖体rRNA拷贝数与真菌数量成正相关的关系估量土壤中真菌总量，结果精准可靠(虽然每种真菌18S核糖体rRNA拷贝数可能均不相同，但其总量与真菌总量总是正相关的)；
3)标准曲线具有较高的线性(R2＞0.98)和较高的扩增效率(E：90-105％)，重现性好。
附图说明
图1为96孔荧光定量板及加样排列方式示意图；
图中，C8为标曲10的8次方拷贝溶液5μL+FF390引物0.5μL+FR1引物0.4μL+qPCR混合液10μL+灭菌双蒸水4.1μL，C7为标曲10的7次方拷贝溶液5μL+FF390引物0.5μL+FR1引物0.4μL+qPCR混合液10μL+灭菌双蒸水4.1μL，依此类推；S1为待测土样1模板DNA溶液5μL+FF390引物0.5μL+FR1引物0.4μL+qPCR混合液10μL+灭菌双蒸水4.1μL，S2为待测土样2模板DNA溶液5μL+FF390引物0.5μL+FR1引物0.4μL+qPCR混合液10μL+灭菌双蒸水4.1μL，依此类推。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
试剂配制及耗材、仪器：
OMEGA E.Z.N.A.土壤DNA提取试剂盒，类型为50次/盒，货号D5625-01；
马铃薯液体培养基(PDB)：去皮马铃薯100g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.75g，加水至1000mL，pH自然；
荧光定量PCR板及封膜购于生工，PCR板标准为96孔，100μL，PP，透明，无裙边，灭菌，无DNA酶、RNA酶，货号F603101；
Luna Universal qPCR Master Mix购于New England Biolabs，是经过优化的具有SYBR通道2X预混液，货号M3003H。
ABI7500实时荧光定量PCR仪产自赛默飞世尔。
实施例1：建立基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法
针对常见土壤真菌(大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)、木霉属(Trichoderma)、小孔异担子菌(Heterobasidion parviporum)和血痕韧革菌(Stereum sanguinolentum))的18S核糖体rRNA保守序列设计的荧光定量PCR(qPCR)通用引物如下：
上游引物FF390序列：5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；
下游引物FR1序列：5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I为次黄嘌呤碱基。
标准曲线模板DNA系列稀释浓度：利用已知的射纹革菌(Phlebia radiataFBCC43)基因组碱基数(40.92Mb)和质量(4.48432×10-5ng)及其目标特异性片段拷贝数(5个/基因组)，计算出标准曲线模板DNA母液里的目标特异性片段拷贝浓度(copy/μL)；取适量母液按照稀释公式加入灭菌双蒸水调节目标特异性片段拷贝浓度至108copy/5μL；取10μL 108copy/5μL模板DNA溶液加入灭菌双蒸水依次稀释为107copy/5μL，106copy/5μL，105copy/5μL，104copy/5μL，103copy/5μL的标准曲线模板DNA溶液(简称“标曲”)。
实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法的操作步骤：
1)将土壤样品过2mm筛后，称取0.3g左右的新鲜土壤，利用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取土壤总DNA，溶于灭菌双蒸水中，测定DNA浓度，放置-20℃冰箱备用。
2)将22℃震荡(180rpm)马铃薯液体培养基(PDB)条件下生长2天的模板射纹革菌(Phlebia radiata FBCC43；购于芬兰赫尔辛基大学真菌菌种库)菌丝倒扣在纱布(已灭菌)上，拧干水分后于液氮中研磨成粉末。称取0.2g射纹革菌粉末利用CTAB法提取总DNA，溶于灭菌双蒸水中，制备成标准曲线模板DNA母液，测定DNA浓度，放置-20℃冰箱备用。
3)将土壤模板DNA溶液统一稀释到一定浓度，4-6ng/μL，作为待测土壤模板DNA溶液。在96孔荧光定量板上，依次加入标准曲线或待测土壤模板DNA溶液5μL(排列方式如附图)，10μM上游引物FF390溶液0.5μL，10μM下游引物FR1溶液0.4μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，再用灭菌双蒸水将反应体系调节至20μL，3次重复。用透明封膜密封96孔荧光定量板，采用微孔板离心机离心混匀。
4)利用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应，反应步骤为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火+延伸1min，45个循环。
5)以射纹革菌DNA溶液系列稀释浓度的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝ax+b；其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数。
6)计算待测样品上机溶液的目标特异性片段总拷贝数N(copy)＝10(Ct-b)/a式中Ct为待测样品测定的具体循环数。
7)计算待测样品每克干土的真菌数量(copy/g)＝(c*V*N)/(cr*Vr*m)
式中c为土壤样品提取的初始DNA浓度(ng/μL)，V为每个土壤样品提取模板DNA的总体积(μL)，cr为上机反应体系的土壤样品模板DNA统一调节的浓度(4-6ng/μL)，Vr为上机反应体系的土壤样品模板DNA的体积(5μL)，m为用于提取模板DNA的土壤样品干重(g)。
实施例2：
本实施例所使用的土壤采自江苏省南京市紫金山(32°04′N，118°50′E)西南麓枫香纯林与枫香黑松混交林，土壤类型为灰棕壤，呈弱酸性。距树主干1m左右除去枯枝落叶层，用灭菌50mL离心管取表层土壤(0-10cm)，处理1为枫香纯林土壤，处理2为枫香黑松混交林土壤，各处理3次重复，用上述方法进行土壤真菌数量检测。
具体操作步骤如下：
1)将土壤样品过2mm筛后，称取0.3g左右的新鲜土壤，利用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取土壤总DNA，溶于灭菌双蒸水中，测定DNA浓度，放置-20℃冰箱备用。
2)将22℃震荡(180rpm)马铃薯液体培养基(PDB)条件下生长2天的模板射纹革菌(Phlebia radiata FBCC43；购于芬兰赫尔辛基大学真菌菌种库)菌丝倒扣在纱布(已灭菌)上，拧干水分后于液氮中研磨成粉末。称取0.2g射纹革菌粉末利用CTAB法提取总DNA，溶于灭菌双蒸水中，制备成标准曲线模板DNA母液，测定DNA浓度，放置-20℃冰箱备用。
3)将土壤模板DNA溶液统一稀释到浓度为6ng/μL，作为待测土壤模板DNA溶液。在96孔荧光定量板上，依次加入标准曲线或待测土壤模板DNA溶液5μL，10μM上游引物FF390溶液0.5μL，10μM下游引物FR1溶液0.4μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，再用灭菌双蒸水将反应体系调节至20μL，3次重复。用透明封膜密封96孔荧光定量板，采用微孔板离心机离心混匀。
4)利用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应，反应步骤为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火+延伸1min，45个循环。
5)以射纹革菌DNA溶液系列稀释浓度的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线，y＝-3.4931x+41.707；其中R2＝0.9923，扩增效率E＝93.32％。
6)计算待测样品上机溶液的目标特异性片段总拷贝数N(copy)＝10(41.707-Ct)/3.4931
式中Ct为待测样品测定的具体循环数。
7)计算待测样品每克干土的真菌数量(copy/g)＝(c*V*N)/(cr*Vr*m)
式中c为土壤样品提取的初始DNA浓度(ng/μL)，V为每个土壤样品提取模板DNA的总体积(μL)，cr为上机反应体系的土壤样品模板DNA统一调节的浓度(6ng/μL)，Vr为上机反应体系的土壤样品模板DNA的体积(5μL)，m为用于提取模板DNA的土壤样品干重(g)。
试验结果如下：
Figure BDA0002374311900000071
由上表数据可以看出，各处理之间真菌数量差异达到显著水平，较小的标准差表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确性高，重现性好。
实施例3：
本实施例所使用的土壤采自广东省湛江市南方种苗基地(21°27′N，110°11′E)4年生和9年生赤桉人工林，土壤类型为砖红壤，呈弱酸性。距树主干1m左右除去枯枝落叶层，用灭菌50mL离心管取表层土壤(0-10cm)，处理1为4年生赤桉人工林土壤，处理2为9年生赤桉人工林土壤，各处理3次重复。具体操作步骤同实施例2，绘出此次标准曲线，y＝-3.4834x+41.119；其中R2＝0.9904，扩增效率E＝93.68％。
试验结果如下：
Figure BDA0002374311900000072
Figure BDA0002374311900000081
表中数据同样显示了此分析方法结果较高的精密性和重现性，同时表明不同林龄对土壤真菌数量产生显著性影响。

Claims (6)

1.一种基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取土壤样品总模板DNA并测定DNA浓度，稀释制成待测土壤模板DNA溶液；
2)提取射纹革菌的菌丝中总DNA并测定DNA浓度，制备成标准曲线模板DNA溶液；
3)将标准曲线模板DNA溶液或待测土壤模板DNA溶液分别进行qPCR反应体系构建，所述qPCR反应体系包括针对常见土壤真菌18S核糖体rRNA保守序列设计的通用qPCR引物，所述通用qPCR引物包括：上游引物FF390序列为5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；下游引物FR1序列为5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I为次黄嘌呤碱基；
4)对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应；
5)以标准曲线模板DNA溶液中的目标特异性片段拷贝10的幂数和测定的循环数Ct值绘制出标准曲线：y＝ax+b，其中y为循环数Ct，x为目标特异性片段拷贝10的幂数，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列；
6)计算待测土壤模板DNA溶液的目标特异性片段总拷贝数N(copy)＝10(Ct-b)/a，式中Ct为待测土壤模板DNA溶液测定的具体循环数，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列；
7)计算土壤样品每克干土的真菌数量＝(c*V*N)/(cr*Vr*m)，单位为copy/g；式中c为土壤样品总模板DNA浓度，单位为ng/μL；cr为待测土壤模板DNA溶液的浓度，单位为ng/μL；V为土壤样品总模板DNA的体积，单位为μL，Vr为待测土壤模板DNA溶液的体积，单位为μL；m为用于提取总模板DNA的土壤样品干重，单位为g。
2.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤1)具体为：称取0.3g过2mm筛的新鲜土壤，利用OMEGA土壤DNA提取试剂盒提取土壤样品总DNA并溶于灭菌双蒸水中，测定DNA浓度，并将浓度统一稀释到4-6ng/μL，作为待测土壤模板DNA溶液。
3.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤2)具体为：将22℃下180rpm震荡马铃薯液体培养基培养生长2天的射纹革菌的菌丝倒扣在已灭菌的纱布上，拧干菌丝水分后于液氮中研磨成粉末；利用CTAB法提取0.2g所述粉末的总DNA，将所述总DNA溶于灭菌双蒸水中，制备成标准曲线模板DNA母液，测定其DNA浓度，制备标准曲线模板DNA溶液。
4.根据权利要求3所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，所述制备标准曲线模板DNA溶液的具体方法为：利用已知的射纹革菌基因组碱基数40.92Mb和质量4.48432×10-5ng及其目标特异性片段拷贝数5个/基因组，计算出标准曲线模板DNA母液中的目标特异性片段拷贝浓度，单位为copy/μL；取适量母液加入灭菌双蒸水调节目标特异性片段拷贝浓度至108copy/5μL；取10μL 108copy/5μL模板DNA溶液加入灭菌双蒸水依次稀释为107copy/5μL，106copy/5μL，105copy/5μL，104copy/5μL，103copy/5μL的标准曲线模板DNA溶液，所述目标特异性片段是18S核糖体rRNA基因序列。
5.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤3)中所述qPCR反应体系构建的方法具体为：在96孔荧光定量板上，依次加入标准曲线模板DNA溶液/待测土壤模板DNA溶液5μL，10μM上游引物FF390溶液0.5μL，10μM下游引物FR1溶液0.4μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，再用灭菌双蒸水将反应体系调节至20μL；用透明封膜密封96孔荧光定量板，采用微孔板离心机离心混匀。
6.根据权利要求1所述的基于实时荧光定量PCR检测土壤真菌数量的方法，其特征在于，步骤4)具体为：利用ABI7500实时荧光定量PCR仪对步骤3)构建的qPCR反应体系进行qPCR反应，反应步骤为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火+延伸1min，45个循环。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113862340A (zh) * 2020-09-01 2021-12-31 四川大学华西医院 一种节约、省时的微量pcr方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436615A (zh) * 2013-08-24 2013-12-11 福州大学 一种pcr-dgge\tgge\sscp引物筛选方法
CN109680047A (zh) * 2019-01-05 2019-04-26 青海民族大学 一种利用定量pcr技术测定真菌丰度的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436615A (zh) * 2013-08-24 2013-12-11 福州大学 一种pcr-dgge\tgge\sscp引物筛选方法
CN109680047A (zh) * 2019-01-05 2019-04-26 青海民族大学 一种利用定量pcr技术测定真菌丰度的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XU ET AL.: "Age and Species of Eucalyptus Plantations Affect Soil Microbial Biomass and Enzymatic Activities", 《MICROORGANISMS》 *
XU ET AL.: "Age and Species of Eucalyptus Plantations Affect Soil Microbial Biomass and Enzymatic Activities", 《MICROORGANISMS》, 29 June 2020 (2020-06-29) *
ZHOU ET AL.: "The impact of wildfire on microbial C:N:P stoichiometry and the fungal-to-bacterial ratio in permafrost soil", 《BIOGEOCHEMISTRY》 *
ZHOU ET AL.: "The impact of wildfire on microbial C:N:P stoichiometry and the fungal-to-bacterial ratio in permafrost soil", 《BIOGEOCHEMISTRY》, 28 October 2018 (2018-10-28), pages 5 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113862340A (zh) * 2020-09-01 2021-12-31 四川大学华西医院 一种节约、省时的微量pcr方法

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