CN109680047A - 一种利用定量pcr技术测定真菌丰度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，利用18S rRNA基因丰度来估算真菌的丰度。从单细胞酵母菌中提取基因组DNA，用PCR扩增目标基因，该基因作为已知数量的目标模板建立标准曲线。PCR产物纯化后用Nano‑drop ND‑1000分光光度计定量。实验表明，本发明方法测定浮游真菌丰度真实可靠，并且高效易行。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学方法与定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法，特别涉及利用18S rRNA基因丰度来估算真菌的丰度。
背景技术
真菌的表现形式多种多样，有腐生生物、病原体和共生体。真菌广泛的存在于陆地和海洋中，在一系列生物地球化学循环过程中起重要作用。而且真菌一直被认为在降解陆生植物碎屑有机物方面发挥重要的作用，尽管它们出现在不同的海洋生态系统中，并且在碎屑食物链中扮演着主要角色，但是与陆地环境相比，它们在分解海洋有机物和海洋生物地球化学循环中的作用仍知之甚少。特别是在近海海洋环境中，初级生产力通常超过植食动物的消费，大部分初级生产的有机物成为了可被消费者利用的碎屑。因此，在陆地和淡水生态系统初级生产的矿化过程中，真菌发挥的重要作用已被广泛接受。然而，真菌在海水中的生态功能在很大程度上被忽略了。
真菌在近海生态系统是不可或缺的一部分，但是它们在海洋生态系统中的生态重要性经常被低估或完全被忽视。海洋真菌最重要的功能是在近海海洋生态系统中作为木本植物和草本植物的分解者。然而，有关这些功能的研究大部分来自海洋底泥或实验室数据，在水层中仍有待证明。
已有科学家利用麦角固醇含量和14C标记的醋酸方法测定浮游真菌的生物量和生产率，并估计了真菌在淡水生态系统的碳循环和能量流动方面贡献的量级大小。这类研究表明，真菌是颗粒态碎屑的重要分解者，在淡水生态系统的碎屑食物网中扮演着关键角色。由于开阔大洋的水层中可用的有机质含量低，相应的真菌生物量较低，所以通常认为在开阔水域的矿化过程中真菌是不重要的。然而，近海海水有机质的可用性和复杂性比较高，尤其是在近海地区有高生产力的栖息地(如：盐沼和红树林)，真菌的生物量很可观。由此，我们推测在海洋生态碎屑食物链中，真菌扮演类似与在淡水生态系统中发挥的作用。事实上，直接检测与显微计数相结合的实验表明，智利中南部的上升流生态系统的活跃期间，表层水中真菌的生物量与原核生物(细菌和古细菌)是相当的。
丰度作为衡量生物的生态功能的重要指标，已应用广泛，但在水层中测定真菌丰度的方法鲜有报道，本实验的方法能快速、准确的测定水层中真菌的丰度，为进一步研究真菌的生态功能提供依据。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，解决现有技术中在水层中测定真菌丰度的方法少、准确度不高的问题。
本发明的技术方案是：
一种利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，包括以下步骤：
(1)已知的浮游真菌DNA的提取；
(2)扩增浮游真菌18S rRNA基因片段；
(3)目的片段的胶回收纯化；
(4)克隆文库构建；
(5)阳性克隆筛选；
(6)标准质粒模板的获得；
(7)定量PCR获得目的基因拷贝数；以各采样点的DNA样品为模板，对真菌特异的18S rRNA gene进行qPCR反应，PCR产物纯化后用分光光度计定量。
所述步骤(1)浮游真菌DNA的提取是利用GENEray Biotechnology植物基因组DNA提取试剂盒提取单细胞酵母菌的基因组DNA。
所述步骤(2)是指以提取的已知菌种的DNA作为模板，以FR1和FF390为引物进行PCR，扩增浮游真菌18S rRNA基因片段，以ddH2O为模板作为阴性对照。
所述步骤(4)克隆文库构建包括以下步骤：
(1)用零背景pTOPO-TA克隆试剂盒分别将回收纯化后的DNA与pTOPO-T Vector在PCR仪中连接；
(2)连接结束后，将全量转化到感受态细胞。
所述步骤(5)阳性克隆筛选是指待长成克隆文库后，用无菌牙签随机挑取单菌落，在含有氨苄青霉素的LB选择培养基中震荡培养。
所述步骤(6)标准质粒模板的获得是指将阳性克隆对应的菌液代表，在氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养至指数生长后期，用Plasmid Midi Kit试剂盒进行质粒提取，提取完成后用ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer核酸含量测定仪测出质粒的浓度，并计算出质粒模板的准确拷贝数。
本发明的有益效果为：实验表明，本发明方法测定浮游真菌丰度真实可靠，并且高效易行。
附图说明
图1利用真菌特异性18S rRNA基因qPCR测定2015年5月采集于深圳沿海的浮游真菌丰度。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
为了对真菌的18S rRNA基因进行qPCR绝对定量，首先需要构建包含目的基因片段且已知浓度的标准质粒模板作为参照。具体构建步骤如下：
1、已知的浮游真菌DNA的提取
利用GENEray Biotechnology植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取Rhodosporidium diobovatum的基因组DNA(TJUWZ4：CGMCC #2.5689,GenBank No:KT281890.1)。具体步骤见说明书。
2、目的片段的PCR扩增
以提取的上述已知菌种的DNA作为模板，以FR1(5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′)和FF390(5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′)为引物进行PCR，扩增浮游真菌18S rRNA基因片段，以ddH2O为模板作为阴性对照。PCR扩增体系：DNA模板1μL，引物FR1和FF390各0.5μL，Mixture5μL，ddH2O 4μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃热变性10s，50℃退火15s，72℃延伸20s，循环40次；72℃后延伸10min。PCR反应结束后，用1％(m/v)的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，并将目的片段进行回收纯化。
3、目的片段的胶回收纯化。
目的片段的回收纯化用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(索莱宝，北京)，具体操作步骤见说明书。
4、克隆文库构建。
(1)用零背景pTOPO-TA克隆试剂盒分别将回收纯化后的DNA与pTOPO-T Vector(金百特生物，北京)在PCR仪中连接。
A.按照如下体系操作(10μL体系)：
用移液器轻轻吸打混匀或者轻弹管底混匀所加入的试剂，低速瞬时离心使所有液体处于离心管管底，注意此步只能在室温(20℃～30℃)进行。
注：如果使用5μL体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。
不同大小插入片段的推荐用量：
B.室温(20℃～30℃)连接5min。
C.连接产物可直接用于转化感受态细胞或储存于-20℃。
(2)连接结束后，将全量(10μL)转化到感受态细胞，具体过程如下：
A.在冰浴上融化感受态细胞，取50μL感受态细胞加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
B.42℃水浴热激30s，快速将管转移到冰浴中2min，该过程尽量不要摇动离心管。
C.向每个离心管中加入500μL无菌的SOC或不含抗生素的LB培养基，混匀后置于30℃，200rpm min-1培养1h，使细菌复苏。
D.根据实验要求，各吸取30μL和100μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素(氨苄青霉素)的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
5、阳性克隆筛选。
待长成克隆文库后，用无菌牙签随机挑取单菌落约12个，在含有氨苄青霉素的LB选择培养基中震荡培养2h。以上述菌液为模板，以载体专用引物M13F(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)和M13R(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)为引物进行PCR筛选阳性克隆，PCR引物序列及反应条件见载体说明书。以1.5％(m/v)的琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。
6、标准质粒模板的获得。
将阳性克隆对应的菌液代表，在10mL含有100μg mL–1氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养至指数生长后期。用Plasmid Midi Kit试剂盒(Omega,USA)按照商家提供的说明书步骤进行质粒提取，提取完成后用ND-1000 UV-VisSpectrophotometer(Thermo Fisher Scientific,USA)核酸含量测定仪测出质粒的浓度，并用在线计算软件(http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html)计算出质粒模板的准确拷贝数。
7、定量PCR获得目的基因拷贝数
以各采样点的DNA样品为模板，对真菌特异的18S rRNA gene进行qPCR反应。引物为FR1和FF390。qPCR反应体系共10μL：2×Sybr Green qPCR mix(GENE-BETTER TM lifescience,Inc.,Beijing,China)5μL，正反引物各0.25μL(10pmol μL–1)，DNA模板1μL和超纯水4μL。qPCR反应器为CFX Connect TM Real-Time System(Bio-Rad Laboratories,Inc.,CA,USA)。qPCR反应条件：94℃预变性3min；94℃热变性10s，50℃退火15s，72℃延伸和收集荧光数据20s，循环40次。从Rhodosporidium diobovatum中提取基因组DNA，用PCR扩增目标基因，该基因作为已知数量的目标模板建立标准曲线。PCR产物纯化后用Nano-drop ND-1000分光光度计定量(Nanodrop,Thermo Fisher Scientific Inc.,Lough-borough,UK)。
用本方法测定珠江三角洲深圳海域浮游真菌的丰度(图1)。图1显示珠江三角洲深圳海域浮游真菌18S rRNAgene的变化范围为7.30×104～2.18×107copies L–1，平均为7.41×106copies L–1。对浮游真菌的丰度进行单因素方差分析，发现在不同的采样区有明显的空间差异(P<0.05，表1)，尤其是大亚湾区域(5.52×105copies L–1)的浮游真菌丰度显著低于深圳湾(1.10×107copies L–1)和珠江口(1.20×107copies L–1)(P<0.05，表1)。
同时，浮游真菌的丰度随着盐度，pH和DO的下降而上升，与亚硝酸盐(P<0.01；r＝0.818)，硝酸盐(P<0.01；r＝0.832)，硅酸盐(P<0.01；r＝0.696)和TN(P<0.05；r＝0.531)呈显著的正相关关系(表2)。由于在近海区域，近岸的盐度，pH均低于远岸，而营养盐浓度均高于远岸，由此可知浮游真菌的丰度呈现出近岸高于远岸的趋势。值得注意的是，浮游真菌的丰度与浮游植物的生物量(以叶绿素含量计)也呈现正相关关系。
这些结果符合生态学理论，说明本试验方法真实可靠，并且高效易行。
表1不同采样站位之间浮游真菌丰度的多重比较(LSD)
表2环境变量与浮游真菌丰度和生物量的Pearson相关性分析
注：*-P<0.05**-P<0.01
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)已知的浮游真菌DNA的提取；
(2)扩增浮游真菌18S rRNA基因片段；
(3)目的片段的胶回收纯化；
(4)克隆文库构建；
(5)阳性克隆筛选；
(6)标准质粒模板的获得；
(7)定量PCR获得目的基因拷贝数；以各采样点的DNA样品为模板，对真菌特异的18SrRNA gene进行qPCR反应，PCR产物纯化后用分光光度计定量。
2.根据权利要求1所述利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，其特征在于，所述步骤(1)浮游真菌DNA的提取是利用GENEray Biotechnology植物基因组DNA提取试剂盒提取单细胞酵母菌的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，其特征在于，所述步骤(2)是指以提取的已知菌种的DNA作为模板，以FR1和FF390为引物进行PCR，扩增浮游真菌18S rRNA基因片段，以ddH2O为模板作为阴性对照。
4.根据权利要求1所述利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，其特征在于，所述步骤(4)克隆文库构建包括以下步骤：
(1)用零背景pTOPO-TA克隆试剂盒分别将回收纯化后的DNA与pTOPO-T Vector在PCR仪中连接；
(2)连接结束后，将全量转化到感受态细胞。
5.根据权利要求1所述利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，其特征在于，所述步骤(5)阳性克隆筛选是指待长成克隆文库后，用无菌牙签随机挑取单菌落，在含有氨苄青霉素的LB选择培养基中震荡培养。
6.根据权利要求1所述利用定量PCR技术测定真菌丰度的方法，其特征在于，所述步骤(6)标准质粒模板的获得是指将阳性克隆对应的菌液代表，在氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养至指数生长后期，用Plasmid Midi Kit试剂盒进行质粒提取，提取完成后用ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer核酸含量测定仪测出质粒的浓度，并计算出质粒模板的准确拷贝数。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111057751A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-04-24 | 南京林业大学 | 一种基于实时荧光定量pcr检测土壤真菌数量的方法 |
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| CN102181566A (zh) * | 2011-05-12 | 2011-09-14 | 南方医科大学 | 一种检测热带假丝酵母菌的实时荧光定量pcr试剂盒 |
| CN106011256A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-10-12 | 江苏省农业科学院 | 基于实时荧光定量pcr 检测小麦根际土壤中丛枝菌根真菌数量的方法 |
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- 2019-01-05 CN CN201910009926.XA patent/CN109680047A/zh active Pending
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